CN102539788B - 一种卵白蛋白双抗夹心elisa检测方法 - Google Patents
一种卵白蛋白双抗夹心elisa检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法，属于生物检验检疫领域。抗卵白蛋白的单克隆抗体的制备，抗卵白蛋白的多克隆抗体的制备，包被抗体用特异性高的单克隆抗体，检测抗体用HRP标记的多克隆抗体，检测程序简单方便，检测时间短，且灵敏度高，最低检测限可达到0.31ng/mL，用于制备快速、有效、低成本的过敏原检测试剂盒，操作简单方便，一次操作时间不超过2h，且可同时检测多个样品，节省时间，检测灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于生物检验检疫领域，通过将卵清白蛋白免疫实验动物获得多克隆抗体，建立卵清白蛋白双抗夹心ELISA检测方法。
背景技术
食物过敏是对食物中蛋白质分子产生的一种不良免疫反应。流行病学调查显示, 25% 以上的人群受到过敏疾病的困扰。世界卫生组织(WHO )将牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类(虾、蟹、龙虾)、花生、大豆、核果类(杏、板栗、腰果等)及小麦这8类食物定为常见的过敏食物。
鸡蛋中的蛋白质属于优质蛋白质，除了含有成年人所需要的八种必需氨基酸外，还含有婴幼儿必须通过膳食补充的组氨酸，更是唯一一个蛋白质生物价达100的天然食物。然而正是这些对人体相当有益的蛋白质却可能成为儿童患过敏性疾病的祸首。不仅是儿童，某些先天性遗传缺陷的成年人同样有着对鸡蛋过敏的烦扰。据报道，鸡蛋过敏的高危人群为婴幼儿和儿童，是儿童继发性营养不良的原因之一。
迄今为止，鸡蛋过敏尚无特效疗法，严格避免食用带鸡蛋的食物是鸡蛋过敏患者的最佳选择。然而鸡蛋营养丰富，若从鸡蛋过敏患者的膳食中除去鸡蛋，势必造成其营养不均衡。而且，由于现在食物配料的多样化，使食物的组成变得十分复杂，鸡蛋过敏患者很难避免遭受危害，因此，鸡蛋过敏已经严重影响了部分人群的生活质量，甚至危急生命，值得我们去关注和研究。
鸡蛋中的过敏原主要存在于蛋清中，目前公认蛋清中有4 种蛋白成分能与人类血清结合而引起过敏反应，为鸡蛋的主要过敏原，它们分别是卵类黏蛋白、卵白蛋白OVA、卵转铁蛋白和溶菌酶。
目前国内检测卵白蛋白主要利用进口的酶联免疫检测试剂盒，灵敏度高，重复性好，但是价格昂贵，而国内尚没有市售的OVA ELISA 检测试剂盒。一般企业为节约检测成本，只使用其检测疫苗原液及成品，无法广泛用于工艺评价。
发明内容
本发明提供一种卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法，目的是建立快速、有效、低成本的卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法。
本发明采取的技术方案是：
（一）抗卵白蛋白的单克隆抗体制备：
（a）采用免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠足垫快速免疫方案：用1mg/mL的卵白蛋白100μL与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min；使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的BALB/C 100μL与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀后注射方法同上，首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价；
（b）细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆:
强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液，按1：5～10的比例与SP2/0细胞充分混合，在37℃水浴下与50%PEG1000进行细胞融合；将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO2培养箱中培养；并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换HAT培养基；待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高、细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止；先后两次细胞融合的融合率分别为20.3%和73.1%，阳性率分别为0和1.78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4E9，2011年12月7日在地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5557，分类命名：产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株；亲和力常数为4.8×108M-1；
（二）制备抗卵白蛋白的多克隆抗体：
（a）用卵白蛋白OVA免疫3只健康新西兰大白兔，免疫剂量为1mg/1mL/只，第一次免疫用弗式完全佐剂与等体积的卵白蛋白OVA乳化完全后于颈部及背部皮下结合后腿根部肌肉多点注射，以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫用弗氏不完全佐剂，免疫剂量及免疫方法同第一次免疫，第三次加强免疫后10天耳缘静脉采血并分离血清，用双向免疫琼脂扩散方法测定血清效价，当血清效价达到24及以上时，心脏采血并在37℃放置2h，4℃静置过夜后3000rpm离心20min，收集血清，即获得多克隆抗体；
（b）多克隆抗体的纯化
采用辛酸-硫酸铵法纯化兔血清，具体操作如下：（1）1份血清加入3份醋酸盐缓冲液（pH 4.5），混合均匀后于30min内逐滴加入正辛酸，边加边搅拌，加入辛酸的量为75ul/mL兔血清。4℃静置1h；（2）4℃以12000rpm离心30min，弃沉淀收集上清并准确记录体积，加入1/10倍体积的PBS（0.01M，pH7.0），调pH至7.2,然后逐滴加入饱和硫酸铵至50%饱和，边加边搅拌，4℃静置2h；(3) 4℃,12000rpm离心15min,弃上清，沉淀用适当体积的PBS（0.01M，pH7.0）溶起，逐滴加入饱和硫酸铵至33%饱和,4℃静置2h；（4）重复第3步；5）4℃,12000rpm离心15min,弃上清，沉淀用适当体积的PBS（0.01M，pH7.0）溶起，并于4℃条件下在PBS（0.01M，pH7.0）中透析直到没有硫酸根离子为止；紫外分光光度计测定纯化后的蛋白浓度，并分装保存至-80℃备用；
(c)辣根过氧化物酶（HRP）标记多克隆抗体
纯化后的多克隆抗体用一种活化的辣根过氧化物酶试剂盒标记，标记方法按照试剂盒说明书进行，具体操作方法如下：（1）1mg HRP用50μL去离子水完全溶解后，加入50μL纯化后的多克隆抗体溶液，含有多克隆抗体100μg，混合均匀后加入10μL左右的启动剂，调pH至9.5；（2）4℃放置12h，加入少量的硼氢化钠，再加入终止剂，约3倍体积启动剂的量，调节pH至7.0左右；（3）加甘油至50%，-20℃保存备用；
(d)卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法
（1）用纯化后的单克隆抗体4E9（5μg/mL）包被ELISA板，100 μL/孔，4℃包被过夜；
（2）0.1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；
（3）加入新鲜配制的1%脱脂奶粉，100 μL/孔，37℃包被1h；
（4）0.1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；
（5）加入系列稀释的OVA标准品溶液或者待检样品及辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体（1:2000 倍稀释），各100μL/孔，37℃孵育1h；
（6）0.1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；
（7）加入OPD底物溶液，100μL/孔，37℃避光反应15min；
（8）加入2M硫酸终止反应，50μL/孔；
（9）酶标仪492nm处读值，记录OD值；
（10）绘制标准曲线，计算待检样品中OVA含量。
本发明卵白蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒的组装，试剂盒包括：包被用的单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体、包被液、封闭剂、洗液、系列稀释的OVA标准品溶液、酶标多抗稀释液、底物溶液和终止液；包被抗体为单克隆抗体4E9，检测抗体为辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体，封闭剂为1%脱脂奶粉，酶标多抗稀释液稀释液为含有1%BSA的PBST（0.01M的PBS，含tween-20 0.05%），底物为OPD溶液，终止液为2M硫酸。
本发明包被抗体用特异性高的单克隆抗体，检测抗体用HRP标记的多克隆抗体，检测程序简单方便，检测时间短，且灵敏度高，最低检测限可达到0.31ng/mL，用于制备快速、有效、低成本的过敏原检测试剂盒，操作简单方便，一次操作时间不超过2h，且可同时检测多个样品，节省时间，检测灵敏度高。
具体实施方式
实施例 1用高纯度的卵白蛋白免疫BALB/C小鼠
具体的免疫方法如下:
采用两种免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠，一种是足垫快速免疫方案：用1mg/mL的OVA100μL与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min。使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30μL。首免后七天用1mg/mL的BALB/C 100μL与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀后注射方法同上，首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价。另一种是常规免疫方案：首次免疫乳化方法同足垫快速免疫法，腹腔及背部皮下多点注射100μg/100μL的卵白蛋白,两周后进行加强免疫，100μg/100μL抗原与等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫每次间隔两周，四免后三天断尾检测小鼠血清效价。
实施例 2细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆
具体操作步骤如下:
强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏(足垫免疫小鼠无菌取出腘淋巴结)，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液（或者用注射器研磨腘淋巴结制备细胞悬液），按1：（5～10）的比例与SP2/0细胞充分混合，在37℃水浴下与50%PEG1000进行细胞融合，将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO2培养箱中培养，并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换HAT培养基，待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高，细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止，先后两次细胞融合的融合率分别为20.3%和73.1%，阳性率分别为0和1.78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，命名为4E9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5557，分类命名：产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株。
实施例 3单抗亚类鉴定及腹水大量制备
具体方法如下:
（1）用检测原卵白蛋白OVA包被酶标板，4℃过夜；
（2）PBST洗涤3次，甩干；
（3）加入适当稀释的腹水或细胞培养上清，37℃，1h；
（4）PBST洗涤3次，加入单抗亚类鉴定试剂，37℃，1h；
（5）PBST洗涤3次，甩干；
（6）每孔加入100ul底物溶液，37℃显色15min，酶标仪读值判断阳性结果。
单克隆抗体亚类鉴定
体外大量诱生腹水法的具体操作:取8～10周龄健壮的BALB/C小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml高压灭菌的石蜡油，1～2周后腹腔注射处于对数生长期的杂交瘤细胞1～2×106个/只，注射细胞7～10天后，选择腹腔明显膨胀，行动迟缓的小鼠抽取腹水，37℃温箱孵育1小时，5000rpm/min离心20min，弃去脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，-80℃保存备用。
实施例4 辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水
具体操作如下:
腹水加2倍体积的醋酸缓冲液（0.06mol/L，PH5.0），用1mol/L HCl调PH至4.8，逐滴加入辛酸（11ul/ml稀释腹水），边加边搅拌，30min内完成，4℃静置2h，10000g离心30min，弃沉淀。上清加入1/10体积的PBS（0.01mol/L），用1mol/LNaOH调PH至7.2。4℃下加入硫酸铵（0.277g/ml）至45%饱和，搅拌30min，10000g离心30min。弃上清，将沉淀溶于适量0.01mol/L PBS中，4℃透析过夜，然后分装-80℃保存备用。
实施例5采用间接ELISA方法测纯化后腹水效价
具体操作如下:
（1）用检测原卵白蛋白OVA包被酶标板，4℃过夜；
（2）PBST洗涤3次，甩干；
（3）纯化后的腹水从5千倍开始倍比稀释，同时设定阴性对照，阴性对照为注射骨髓瘤细胞产生的腹水。每个浓度设定2个重复孔，37℃孵育1h；
（4）PBST洗涤3次，甩干；
（5）每孔加入100ul辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（1:5000倍稀释），37℃孵育1h；
（6）PBST洗涤3次，甩干；
（7）每孔加入100ulOPD底物溶液，37℃显色15min，酶标仪读值记录结果。
实施例6 单抗分子量及腹水蛋白含量测定
将纯化前和纯化后的腹水经变性SDS-PAGE电泳后，以Marker中标准蛋白在凝胶中的相对迁移率为横坐标，以标准蛋白分子量的对数为纵坐标绘制标准曲线。根据抗体轻链和重链在凝胶中的迁移情况，计算单抗4E9分子量为156,370Da。采用紫外分光光度法测定腹水蛋白含量，分别测定260nm和280nm处的吸光值，按下面的经验公式计算蛋白含量：蛋白浓度（mg/ml）=1.450×OD280-0.745×OD260，测得4E9的腹水蛋白含量为12.87mg/m。
实施例7 单抗亲和力的测定
具体操作如下:
OVA按8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、1ug/ml包被酶标板，将单抗从一定浓度开始倍比稀释，其余同间接ELISA法。以抗体浓度（mol/L）的对数值为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，可在一个坐标系内作出4条S形曲线。找出S形曲线的顶部，设定为ODmax。在曲线中分别找出4条曲线各自50%ODmax对应的抗体浓度。将4个浓度两两一组，根据下列公式计算单抗的亲和力常数。
Ka=（n-1）/2（n[Ab、]t-[Ab]t）
其中n为每组中两个包被浓度的倍数，[Ab、]t和[Ab]t分别为每组中两个50%ODmax对应的抗体浓度（mol/L）。
根据该公式可求得4E9单抗的亲和力常数为4.8×108M-1，为高亲和力抗体，适合ELISA检测。
实施例 8
抗卵白蛋白的多克隆抗体的制备
用OVA免疫3只健康新西兰大白兔（2kg左右），免疫剂量为1mg/1mL/只。第一次免疫用弗式完全佐剂与等体积的OVA乳化完全后于颈部及背部皮下结合后腿根部肌肉多点注射。以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫用弗氏不完全佐剂，免疫剂量及免疫方法同第一次免疫。第三次加强免疫后10天耳缘静脉采血并分离血清，用双向免疫琼脂扩散方法测定血清效价。当血清效价达到24及以上时，心脏采血并在37℃放置2h，4℃静置过夜后3000rpm离心20min，收集血清，即获得多克隆抗体。
实施例9
辛酸-硫酸铵法纯化多克隆抗体
具体操作如下：
（1）1份血清加入3份醋酸盐缓冲液（pH 4.5），混合均匀后于30min内逐滴加入正辛酸，边加边搅拌加入辛酸的量为75μl/mL兔血清。4℃静置1h；
（2）4℃条件下，12000rpm离心30min，弃沉淀收集上清并准确记录体积，加入1/10倍体积的PBS（0.01M，pH7.0），调pH至7.2,然后逐滴加入饱和硫酸铵至50%饱和，边加边搅拌。4℃静置2h；
(3) 4℃条件下,12000rpm离心15min,弃上清，沉淀用PBS（0.01M，pH7.0）溶起，逐滴加入饱和硫酸铵至33%饱和,4℃静置2h；
（4）重复第3步；
（5）4℃条件下,12000rpm离心15min,弃上清，沉淀用适当体积的PBS（0.01M，pH7.0）溶起，并于4℃条件下在PBS（0.01M，pH7.0）中透析直到没有硫酸根离子为止。紫外分光光度计测定纯化后蛋白浓度，并分装保存至-80℃备用。
实施例10
单抗最佳包被浓度和酶标多抗最佳工作浓度的确定
采用棋盘滴定法确定单抗最佳包被浓度和酶标多抗最佳稀释度。单抗4E9用包被液（pH9.6的碳酸盐缓冲液）分别稀释成8.0,6.0,4.0,2.0,1.0,0.5μg/mL，纵向加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜。PBST洗涤后用1%脱脂奶粉封闭1h。PBST洗涤后，横向加入系列稀释的酶标多抗，稀释倍数分别为1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600，1:3200，100μL/孔，37℃孵育1h。洗涤后，每孔加入100μLOPD底物溶液，37℃孵育15min，终止后酶标仪读值。选择吸光度为1.0左右时的单抗包被浓度和酶标多抗稀释度为最佳的单抗和酶标多抗工作浓度1:1600。
实施例11
最适包被时间的确定
包被时间分为4组，第1组: 4℃包被过夜；第2组: 37℃包被2h+ 4℃包被过夜；第3组：37℃包被2h；第4组：37℃包被1h。洗涤后于37℃分别封闭1h，同时加入一定浓度的OVA标准品和酶标多抗，37℃孵育1h，阴性对照孔不加OVA标准品，而加入等体积的PBS，根据P/N值确定最佳包被时间，第1组: 4℃包被过夜。
实施例12
最适封闭剂的确定
用最佳单抗包被浓度4℃包被过夜，洗涤后分别用1%脱脂奶粉、5%脱脂奶粉、1%明胶、3%BSA、1%小牛血清及1%NH4Cl封闭，100μL/孔，37℃封闭1h，根据P/N值确定最适封闭剂。
实施例13
最适封闭时间的确定
最佳单抗包被浓度4℃包被过夜，用最适封闭剂封闭，封闭时间分成4组。第1组: 37℃，30min;第2组：37℃，1h；第3组：37℃，2h；第4组: 4℃过夜。根据P/N值确定最佳封闭时间，37℃，1h。
实施例14
酶标多抗稀释液的确定
最佳单抗包被浓度4℃包被过夜，用最适封闭剂及封闭时间封闭。酶标抗体稀释液一共分成5组，第1组:0.01M的PBS；第2组:PBST(0.01M的PBS，含tween-20 0.05%)；第3组:Tris-HCL(0.05M,pH 8.0)；第4组:PBS+1%BSA；第5组:PBST+1%BSA，根据P/N值确定最适酶标多抗稀释液。
实施例15
OVA标准品或样品与酶标抗体最适作用时间的确定
最佳单抗包被浓度4℃包被过夜，用最适封闭剂及封闭时间封闭，最适抗体稀释液稀释酶标抗体。作用时间一共分成4组。第1组:30min；第2组:1h；第3组1.5h；第4组:2h，根据P/N值确定最佳OVA标准品或样品与酶标抗体作用时间，第2组:1h。
实施例16
底物作用时间的确定
最佳单抗包被浓度4℃包被过夜，用最适封闭剂及封闭时间封闭，最适抗体稀释液稀释样品及酶标抗体，作用最佳时间后，底物作用时间分成4组。第1组:10min；第2组:15min；第3组20min；第4组:30min，根据P/N值确定最佳底物作用时间，第2组:15min。
实施例17
标准曲线的绘制
标准品OVA按20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0ng/mL稀释，按照以上优化的ELISA条件进行，其中每个浓度设定至少2个重复孔。以测得的P/N值大于2.1时的最低OVA浓度作为最低检测限。以标准品浓度的对数作为横坐标，对应的OD值作为纵坐标绘制标准曲线。
实施例18
优化后的OVA双抗夹心ELISA检测方法的操作
（1）抗OVA的单克隆抗体4E9 2μg/ml包被酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；
（2）0.1%的PBST洗涤3次，每次5min；
（3）新鲜配制的1%脱脂奶粉封闭剂，100μL/孔，37℃封闭1h；
（4）0.1%的PBST洗涤3次，每次5min；
（5）系列稀释的OVA标准品或适当稀释的待检样品与辣根过氧化物酶标记的多抗（1:1600倍稀释），各100μL/孔，37℃孵育1h；
（6）0.1%的PBST洗涤3次，每次5min；
（7）加入OPD底物溶液，100μL/孔，37℃孵育15min，立即加入2M硫酸终止反应，50μL/孔，酶标仪测定OD492值。
（8）绘制标准曲线，并根据标准曲线计算待检样品中OVA的含量。
实施例19卵白蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒的组装
试剂盒包括：包被用的单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体、包被液、封闭剂、洗液、系列稀释的OVA标准品溶液、酶标多抗稀释液、底物溶液和终止液，包被抗体为单克隆抗体4E9，检测抗体为辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体，封闭剂为1%脱脂奶粉，酶标多抗稀释液稀释液为含有1%BSA的PBST（0.01M的PBS，含tween-20 0.05%），底物为OPD溶液，终止液为2M硫酸。
Claims (1)
1.一种卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法，其特征在于包括下列步骤：
（一）抗卵白蛋白的单克隆抗体制备：
（a）采用足垫快速免疫方案免疫健康 BALB/C 雌性小鼠：用1mg/mL的卵白蛋白100μL与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min；使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的卵白蛋白 100μL与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀后注射方法同上，首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价；
（b）细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆:
强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出腘淋巴结，用注射器研磨腘淋巴结制备细胞悬液，按1：5～10的比例与SP2/0细胞充分混合，在37℃水浴下与50%PEG1000进行细胞融合；将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO2培养箱中培养；并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换HAT培养基；待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高、细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止；先后两次细胞融合的融合率分别为20.3%和73.1%，阳性率分别为0和1.78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4E9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5557，分类命名：产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株；亲和力常数为4.8×108M-1；
（二）制备抗卵白蛋白的多克隆抗体：
（a）用卵白蛋白OVA免疫3只健康新西兰大白兔，免疫剂量为1mg/1mL/只，第一次免疫用弗式完全佐剂与等体积的卵白蛋白OVA乳化完全后于颈部及背部皮下结合后腿根部肌肉多点注射，以后每隔2周加强免疫一次，加强免疫用弗氏不完全佐剂，免疫剂量及免疫方法同第一次免疫，第三次加强免疫后10天耳缘静脉采血并分离血清，用双向免疫琼脂扩散方法测定血清效价，当血清效价达到24及以上时，心脏采血并在37℃放置2h，4℃静置过夜后3000rpm离心20min，收集血清，即获得多克隆抗体；
（b）多克隆抗体的纯化
采用辛酸-硫酸铵法纯化兔血清，具体操作如下：（1）1份血清加入3份pH 4.5的醋酸盐缓冲液，混合均匀后于30min内逐滴加入正辛酸，边加边搅拌，加入辛酸的量为75ul/mL兔血清，4℃静置1h；（2）4℃以12000rpm离心30min，弃沉淀收集上清并准确记录体积，加入1/10倍体积、0.01M的 pH7.0PBS，调pH至7.2,然后逐滴加入饱和硫酸铵至50%饱和，边加边搅拌，4℃静置2h；(3) 4℃,12000rpm离心15min,弃上清，沉淀用适当体积0.01M的 pH7.0的PBS溶起，逐滴加入饱和硫酸铵至33%饱和,4℃静置2h；（4）重复第3步；5）4℃,12000rpm离心15min,弃上清，沉淀用适当体积0.01M的pH7.0的PBS溶起，并于4℃条件下在0.01M 的pH7.0的PBS中透析直到没有硫酸根离子为止；紫外分光光度计测定纯化后的蛋白浓度，并分装保存至-80℃备用；
(c)辣根过氧化物酶（HRP）标记多克隆抗体
纯化后的多克隆抗体用一种活化的辣根过氧化物酶试剂盒标记，标记方法按照试剂盒说明书进行，具体操作方法如下：（1）1mg HRP用50μL去离子水完全溶解后，加入50μL纯化后的多克隆抗体溶液，含有多克隆抗体100μg，混合均匀后加入10μL左右的启动剂，调pH至9.5；（2）4℃放置12h，加入少量的硼氢化钠，再加入终止剂，约3倍体积启动剂的量，调节pH至7.0左右；（3）加甘油至50%，-20℃保存备用；
(d)卵白蛋白双抗夹心ELISA检测方法
（1）用纯化后的单克隆抗体4E9以5μg/mL包被ELISA板，100 μL/孔，4℃包被过夜；
（2）0.1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；
（3）加入新鲜配制的1%脱脂奶粉，100 μL/孔，37℃包被1h；
（4）0.1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；
（5）加入系列稀释的OVA标准品溶液或者待检样品及以1：2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的多克隆抗体，各100μL/孔，37℃孵育1h；
（6）0.1%的PBST洗涤3次，5min/次，拍干；
（7）加入OPD底物溶液，100μL/孔，37℃避光反应15min；
（8）加入2M硫酸终止反应，50μL/孔；
（9）酶标仪492nm处读值，记录OD值；
（10）绘制标准曲线，计算待检样品中OVA含量。
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