CN102558350A - 一种抗卵白蛋白的单克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗卵白蛋白的单克隆抗体及其制备方法，属于生物检验检疫领域。免疫健康BALB/C雌性小鼠足垫快速免疫方法：细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆，获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4E9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5557，为进一步研制出快速、有效、低成本的卵白蛋白OVA检测试剂盒奠定了基础。

Description

一种抗卵白蛋白的单克隆抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于生物检验检疫领域，通过将卵清白蛋白免疫实验动物获得单克隆抗体，为建立卵清白蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒奠定基础。 

背景技术

食物过敏是对食物中蛋白质分子产生的一种不良免疫反应。流行病学调查显示, 25% 以上的人群受到过敏疾病的困扰。世界卫生组织(WHO )将牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类(虾、蟹、龙虾)、花生、大豆、核果类(杏、板栗、腰果等)及小麦这8类食物定为常见的过敏食物。 

鸡蛋中的蛋白质属于优质蛋白质，除了含有成年人所需要的八种必需氨基酸外，还含有婴幼儿必须通过膳食补充的组氨酸，更是唯一一个蛋白质生物价达100的天然食物。然而正是这些对人体相当有益的蛋白质却可能成为儿童患过敏性疾病的祸首。不仅是儿童，某些先天性遗传缺陷的成年人同样有着对鸡蛋过敏的烦扰。据报道，鸡蛋过敏的高危人群为婴幼儿和儿童，是儿童继发性营养不良的原因之一。 

迄今为止，鸡蛋过敏尚无特效疗法，严格避免食用带鸡蛋的食物是鸡蛋过敏患者的最佳选择。然而鸡蛋营养丰富，若从鸡蛋过敏患者的膳食中除去鸡蛋，势必造成其营养不均衡。而且，由于现在食物配料的多样化，使食物的组成变得十分复杂，鸡蛋过敏患者很难避免遭受危害，因此，鸡蛋过敏已经严重影响了部分人群的生活质量，甚至危急生命，值得我们去关注和研究。 

鸡蛋中的过敏原主要存在于蛋清中，目前公认蛋清中有4 种蛋白成分能与人类血清结合而引起过敏反应，为鸡蛋的主要过敏原，它们分别是卵类黏蛋白、卵白蛋白（OVA）、卵转铁蛋白和溶菌酶。 

目前国内检测卵白蛋白主要利用进口的酶联免疫检测试剂盒，灵敏度高，重复性好，但是价格昂贵。 

发明内容

本发明提供一种抗卵白蛋白的单克隆抗体及其制备方法，目的是建立能稳定、高效分泌抗卵白蛋白的杂交瘤细胞株，从而为研制卵白蛋白双抗夹心ELISA试剂盒奠定基础。 

本发明采取的技术方案是： 

（1）免疫健康BALB/C雌性小鼠足垫快速的免疫方法：用1mg/mL的卵白蛋白100μL与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min；使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的BALB/C 100μL与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀后注射方法同上，首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价；

（2）细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆，具体方法如下:

强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液，按1：5～10的比例与SP2/0细胞充分混合，在37℃水浴下与50%PEG1000进行细胞融合；将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO₂培养箱中培养；并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换HAT培养基；待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高、细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止；先后两次细胞融合的融合率分别为20.3%和73.1%，阳性率分别为0和1.78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4E9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5557，分类命名：产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株；亲和力常数为4.8×10⁸M^-1。

本发明还包括单抗亚类测定及单抗的大量制备，用鼠免疫球蛋白亚类检测试剂盒鉴定单抗亚类，用小鼠体外诱生腹水法大量制备腹水； 

本发明还包括单抗分子量及腹水蛋白含量测定：

将纯化前和纯化后的腹水经变性SDS-PAGE电泳后，以Marker中标准蛋白在凝胶中的相对迁移率为横坐标，以标准蛋白分子量的对数为纵坐标绘制标准曲线。根据抗体轻链和重链在凝胶中的迁移情况，计算抗体分子量。采用紫外分光光度法测定腹水蛋白含量，分别测定260nm和280nm处的吸光值，按下面的经验公式计算蛋白含量：蛋白浓度（mg/ml）=1.450×OD₂₈₀-0.745×OD₂₆₀。

本发明采用高纯度的卵白蛋白免疫BALB/C小鼠，筛选出一株能稳定分泌抗卵白蛋白的杂交瘤细胞株，为进一步研制出快速、有效、低成本的卵白蛋白OVA检测试剂盒奠定了基础。 

具体实施方式

实施例 1用高纯度的卵白蛋白免疫BALB/C小鼠 

具体的免疫方法如下:

采用两种免疫方案免疫健康BALB/C雌性小鼠，一种是足垫快速免疫方案：用1mg/mL的OVA100μL与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min。使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30μL。首免后七天用1mg/mL的BALB/C 100μL与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀后注射方法同上，首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价。另一种是常规免疫方案：首次免疫乳化方法同足垫快速免疫法，腹腔及背部皮下多点注射100μg/100μL的卵白蛋白,两周后进行加强免疫，100μg/100μL抗原与等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫每次间隔两周，四免后三天断尾检测小鼠血清效价。

实施例 2细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆 

具体操作步骤如下:

强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏(足垫免疫小鼠无菌取出腘淋巴结)，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液（或者用注射器研磨腘淋巴结制备细胞悬液），按1：（5～10）的比例与SP2/0细胞充分混合，在37℃水浴下与50%PEG1000进行细胞融合，将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO₂培养箱中培养，并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换HAT培养基，待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高，细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止，先后两次细胞融合的融合率分别为20.3%和73.1%，阳性率分别为0和1.78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，命名为4E9，2011年11月7日在地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5557，分类命名：产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株。

实施例 3单抗亚类鉴定及腹水大量制备 

具体方法如下:

（1）用检测原卵白蛋白OVA包被酶标板，4℃过夜；

（2）PBST洗涤3次，甩干；

（3）加入适当稀释的腹水或细胞培养上清，37℃，1h；

（4）PBST洗涤3次，加入单抗亚类鉴定试剂，37℃，1h；

（5）PBST洗涤3次，甩干；

（6）每孔加入100ul底物溶液，37℃显色15min，酶标仪读值判断阳性结果。

单克隆抗体亚类鉴定 

体外大量诱生腹水法的具体操作:取8～10周龄健壮的BALB/C小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml高压灭菌的石蜡油，1～2周后腹腔注射处于对数生长期的杂交瘤细胞1～2×10⁶个/只，注射细胞7～10天后，选择腹腔明显膨胀，行动迟缓的小鼠抽取腹水，37℃温箱孵育1小时，5000rpm/min离心20min，弃去脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，-80℃保存备用。

实施例4 辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水 

具体操作如下:

腹水加2倍体积的醋酸缓冲液（0.06mol/L，PH5.0），用1mol/L HCl调PH至4.8，逐滴加入辛酸（11ul/ml稀释腹水），边加边搅拌，30min内完成，4℃静置2h，10000g离心30min，弃沉淀。上清加入1/10体积的PBS（0.01mol/L），用1mol/LNaOH调PH至7.2。4℃下加入硫酸铵（0.277g/ml）至45%饱和，搅拌30min，10000g离心30min。弃上清，将沉淀溶于适量0.01mol/L PBS中，4℃透析过夜，然后分装-80℃保存备用。

实施例5采用间接ELISA方法测纯化后腹水效价 

具体操作如下:

（1）用检测原卵白蛋白OVA包被酶标板，4℃过夜；

（2）PBST洗涤3次，甩干；

(3)纯化后的腹水从5千倍开始倍比稀释，同时设定阴性对照，阴性对照为注射骨髓瘤细胞产生的腹水。每个浓度设定2个重复孔，37℃孵育1h；

（4）PBST洗涤3次，甩干；

（5）每孔加入100ul辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（1:5000倍稀释），37℃孵育1h；

（6）PBST洗涤3次，甩干；

（7）每孔加入100ulOPD底物溶液，37℃显色15min，酶标仪读值记录结果。

实施例6 单抗分子量及腹水蛋白含量测定 

将纯化前和纯化后的腹水经变性SDS-PAGE电泳后，以Marker中标准蛋白在凝胶中的相对迁移率为横坐标，以标准蛋白分子量的对数为纵坐标绘制标准曲线。根据抗体轻链和重链在凝胶中的迁移情况，计算单抗4E9分子量为156,370Da。采用紫外分光光度法测定腹水蛋白含量，分别测定260nm和280nm处的吸光值，按下面的经验公式计算蛋白含量：蛋白浓度（mg/ml）=1.450×OD₂₈₀-0.745×OD₂₆₀，测得4E9的腹水蛋白含量为12.87mg/m。

实施例7 单抗亲和力的测定 

具体操作如下:

OVA按8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、1ug/ml包被酶标板，将单抗从一定浓度开始倍比稀释，其余同间接ELISA法。以抗体浓度（mol/L）的对数值为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，可在一个坐标系内作出4条S形曲线。找出S形曲线的顶部，设定为OD_max。在曲线中分别找出4条曲线各自50%OD_max对应的抗体浓度。将4个浓度两两一组，根据下列公式计算单抗的亲和力常数。

Ka=（n-1）/2（n[Ab^、]_t-[Ab]_t） 

其中n为每组中两个包被浓度的倍数，[Ab^、]_t和[Ab]_t分别为每组中两个50%OD_max对应的抗体浓度（mol/L）。

根据该公式可求得4E9单抗的亲和力常数为4.8×10⁸M^-1，为高亲和力抗体，适合ELISA检测。 

Claims (3)

1.一种抗卵白蛋白的单克隆抗体，其特征在于是由下列方法制成的：

（1）免疫健康BALB/C雌性小鼠足垫的快速免疫方法：用1mg/mL的卵白蛋白100μL与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min；使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的BALB/C 100μL与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀后注射方法同上，首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价；

（2）细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆，具体方法如下:

强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液，按1：5～10的比例与SP2/0细胞充分混合，在37℃水浴下与50%PEG1000进行细胞融合；将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO₂培养箱中培养；并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换HAT培养基；待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高、细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止；先后两次细胞融合的融合率分别为20.3%和73.1%，阳性率分别为0和1.78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4E9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5557，分类命名：产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株；亲和力常数为4.8×10⁸M^-1。

2.如权利要求1所述的一种抗卵白蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

（1）免疫健康BALB/C雌性小鼠足垫快速的免疫方法：用1mg/mL的卵白蛋白100μL与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化器乳化40min；使用乙醚将3只BALB/C小鼠分别麻醉后，用酒精棉对小鼠的两只后脚掌消毒，皮下注射，每只后脚掌注射免疫原30μL；首免后七天用1mg/mL的BALB/C 100μL与等量的弗氏不完全佐剂混合均匀后注射方法同上，首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价；

（2）细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆，具体方法如下:

强免后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液，按1：5～10的比例与SP2/0细胞充分混合，在37℃水浴下与50%PEG1000进行细胞融合；将融合后的细胞悬液加入含20%胎牛血清的HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100ul，放入37℃、5%CO₂培养箱中培养；并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换HAT培养基；待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高、细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止；先后两次细胞融合的融合率分别为20.3%和73.1%，阳性率分别为0和1.78%，经过三次克隆化筛选，最后获得一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株命名为4E9，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号是CGMCC No.5557，分类命名：产鸡卵白蛋白单克隆抗体细胞株；亲和力常数为4.8×10⁸M^-1。

3.如权利要求1所述的一种抗卵白蛋白的单克隆抗体在制备ELISA 检测试剂盒中的应用。