CN104561207A

CN104561207A - 螺旋藻抗肿瘤多肽的双酶解制备方法

Info

Publication number: CN104561207A
Application number: CN201510031233.2A
Authority: CN
Inventors: 张学武; 王竹君
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2015-01-21
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2035-01-21
Also published as: CN104561207B

Abstract

本发明提供螺旋藻抗肿瘤多肽的双酶解制备方法。该方法为：采用纯水，通过反复冻融、均质和超声获取螺旋藻全蛋白，通过碱性蛋白酶Alcalase？2.4和木瓜蛋白双酶解的方法，获取螺旋藻多肽，再利用超滤膜分离纯化，获得分子量大小范围为0-3K、3-5K，5-10K以及大于10K的螺旋藻多肽共4个组份。本发明得到的螺旋藻多肽和单肽组分，为抗肿瘤药物和保健食品的开发利用奠定了理论基础。

Description

螺旋藻抗肿瘤多肽的双酶解制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及螺旋藻抗肿瘤多肽的双酶解制备方法。

背景技术

生物活性肽是对机体的功能或状态具有积极作用并最终影响机体健康的特殊蛋白质片段。相较于蛋白质而言，小分子肽片段的优越性主要体现在：更易被人体吸收利用；活性高，在较小浓度下即可发挥其特有的生理作用；分子量小，易于修饰和改造，能够通过人工化学合成等。而相较于单一的氨基酸而言，小分子肽除了具有特殊的生理活性外，在吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸无可比拟的优越性。已有研究证实，人体小肠存在专门的低聚肽吸收通道，人体摄入的蛋白质经过多种消化酶的水解，主要以低肽的形式被吸收，且二肽和三肽的吸收速度比同组成的氨基酸更快。

海洋环境复杂多变，其高盐、高压、低温、寡营养等独特条件赋予了海洋生物某些优良的特性。许多研究表明，生物活性肽，尤其是海洋来源的生物活性肽具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌、降压、降血糖等多种作用。而近年来，海洋来源的天然生物抗肿瘤肽也取得一定的进展，成为抗肿瘤药物和保健品开发的重要来源。

螺旋藻（Spirulina）是人类迄今为止所发现的最优质的纯天然蛋白质食品源，其蛋白质含量高达50－70%，由18种氨基酸组成，包含人体全部8种必需氨基酸，且配比合理。其丰富的蛋白质和氨基酸为开发螺旋藻生物活性肽提供了良好的物质基础。利用酶解手段将螺旋藻蛋白进行非变性水解，不仅能提高螺旋藻蛋白的溶解性和体内吸收利用率，还能获取具有特殊生理功能的生物活性肽。目前已有报道从螺旋藻蛋白酶解物中成功提取到抗氧化肽、ACE抑制肽、抑菌肽等，但抗肿瘤肽的研究尚处于初级阶段。本文以MTT实验为指导，通过酶解、超滤、凝胶色谱分离技术，纯化得到多个抗肿瘤活性肽组分，并通过质谱技术对其组分和序列进行初步鉴定，为进一步开发螺旋藻的食用和药用价值提供理论依据。

发明内容

为进一步开发螺旋藻在食品和生物医学领域的应用价值，本发明的目的是提供一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法。

为实现本发明的目的，采用如下技术方案：

螺旋藻抗肿瘤多肽的双酶解制备方法，包括如下步骤：

（1）采用反复冻融、均质和超声联用的方法，提取螺旋藻蛋白：取10~50 g螺旋藻粉，用超纯水配制成浓度为5% (w/v)的溶液，反复冻融2~5次后，冰浴中均质、超声，离心取上清液，冷冻干燥，备用；

（2）取步骤（1）得到的螺旋藻蛋白配置成2~5%的蛋白液，加入碱性蛋白酶Alcalase2.4在控制条件下进行酶解，使用0.05～0.2 mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间，酶解完后再调节酶解条件，加入木瓜蛋白酶在控制条件下进行酶解，反应体系的pH值控制方法同上，酶解完毕后灭酶，冷却至室温，将酶解液离心，取上清液；

（3）取步骤（2）得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10 KD、5 KD以及3 KD的超滤膜过滤，从而获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD，5-10KD和大于10 KD的螺旋藻蛋白酶解液；

（4）取步骤（3）得到的0-3K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析，水洗脱，按照出峰的时间顺序，收集得到6个多肽组分，分别命名为D1、D2、D3、D4、D5和D6，即螺旋藻抗肿瘤多肽。

上述方法中，步骤（1）所述反复冻融条件为：-20 ℃冰箱中冷冻4~8h，再置于 37℃水浴中解冻2~3h；均质条件为：样品置于冰浴中均质1~3min，转速为在3000~5000rpm搅拌 20~50s，然后在7000~12000rpm搅拌 30~60s，最后在3000~5000rpm搅拌20~50s。

上述方法中，步骤（1）所述超声条件为：样品置于冰浴中，以460~670 W 的功率超声20~15min，超声过程中每超声 4~8 s间隔 6~10 s后再超声4~8 s间隔 6~10 s，如此重复进行。

上述方法中，步骤（1）所述离心条件为：4 ℃，8000 ~10000r/min，离心时间为 30 ~60min。

上述方法中，步骤（2）碱性蛋白酶Alcalase2.4与木瓜蛋白酶双酶解的水解条件是：碱性蛋白酶酶解温度40~60℃，pH=7~9，酶解时间4~8 h，酶与底物的浓度比为4~6%（w/w），然后加入木瓜蛋白酶酶解，酶解温度40~60℃，pH=6~7，酶解时间2~4h，酶与底物浓度比为3~5%（w/w）。

上述方法中，步骤（2）所述灭酶条件为：80~95℃水浴灭酶10~15 min。

上述方法中，步骤（2）所述离心条件为8000~10000 r/min，离心30~60 min。

上述方法中，步骤（3）所述的超滤在CO₂压力为0.1～0.25 MPa的室温下用超滤杯结合10K，5K和3K的超滤膜超滤。

上述方法中，步骤（4）所述的葡聚糖凝胶Sephadex G-15分离纯化，具体条件为：柱体积为150~200 mL，上样量为1~4 mL，上样浓度为50~150 mg/mL，流动相为水，流速为0.4 mL/min，每8 min收集一管，总共收集160管，检测波长为280 nm。

上述方法中，步骤（4）所述螺旋藻抗肿瘤多肽组份通过 MALDI-TOF-TOF质谱分析鉴定得到，D1其中一条分子量为970.5992的肽，其序列为RLLLLSAGGA(C→N)，D4为分子量991.6139的单肽，其序列为RLCLVLFK(C→N)，D5为两个肽的混合组分，其中一条与D4成分相同，另一条肽分子量为808.4778，序列为RVGVHGAL(C→N)。

与现有的技术相比，本发明具有如下的技术优点和效果：

本发明得到的6个螺旋藻多肽组份对乳腺癌细胞（MCF-7）和肝癌细胞（HepG-2）均具有一定的抑制作用。其中，D1对MCF-7和HepG-2的半抑制浓度IC₅₀值分别为：小于实验最低剂量浓度31.25 μg/mL和48.90μg/mL。D2对MCF-7和HepG-2半抑制浓度IC₅₀分别为：171.07μg/mL和96.06μg/mL。D3对MCF-7的半抑制浓度IC₅₀值小于实验最低剂量浓度31.25 μg/mL 。D5对MCF-7的半抑制浓度IC₅₀值为160.42μg/mL 。MALDI-TOF-TOF-MS二级质谱分析得出D1所含多肽的其中一条分子量为970.5992，序列为RLLLLSAGGA(C→N)，D4是一个分子量为991.6139的单肽，序列为RLCLVLFK(C→N)，D5组分包含2条肽，其中一条肽同D4，另一条肽分子量为808.4778，序列为RVGVHGAL(C→N)。在500μg/mL时，这三条肽MCF-7对抑制率分别为55.11%、52.92%和36.09%；，对HepG-2抑制率分别为40.17%、72.41%和27.10%。因而本发明得到的螺旋藻多肽有利于抗肿瘤药物和保健食品的开发利用。

附图说明

图1为实施例1中0-3 K酶解液组份的葡聚糖凝胶SephadexG-15柱层析洗脱曲线。

图2为实施例1中所制备的6个多肽组份浓度均为500 μg/mL时对乳腺癌细胞（MCF-7）和肝癌细胞（HepG-2）抑制效果。

图3为实施例1所制备的螺旋藻多肽中荷质比m/z = 970.5992的二级质谱图。

图4为实施例1所制备的螺旋藻多肽中荷质比m/z = 991.6139的二级质谱图。

图5为实施例1所制备的螺旋藻多肽中荷质比m/z =808.4778的二级质谱图。

具体实施方式

以下结合实例和附图对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。

实施例1

（1）取10 g螺旋藻粉，用超纯水配制成浓度为5% (w/v)的溶液，在-20 ℃冰箱中冷冻4h，再置于 37℃水浴中解冻2h，如此反复冻融5次。样品置于冰浴中均质2min，转速为5000rpm 30s，然后10000rpm 1min，最后5000rpm 30s 。然后冰浴中以460W 的功率超声20min（每超声 6 s ，间隔 9 s）。4 ℃，8000r/min，离心 30 min。

（2）取步骤（1）得到的螺旋藻蛋白配置成2%（w/w）的蛋白液，加入碱性蛋白酶Alcalase2.4使酶与底物浓度比为4%（w/w），调节温度至40℃，pH为7.0，酶解8 h。然后pH至6.0，按照3%（w/w）的酶底比加入木瓜蛋白酶酶解4h。该过程中使用0.05mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间。酶解完毕后80℃水浴中灭酶15min，冷却至室温，8000r/min，离心30min后取上清液。

（3）取步骤（2）得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10 KD、5 KD以及3 KD的超滤膜过滤（CO2的压力为0.10 MPa的室温下），从而获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD，5-10KD和大于10 KD的螺旋藻蛋白酶解液。

（4）取步骤（2）得到的0-3K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析，柱体积为150 mL，上样量为1 mL，上样浓度为150 mg/mL，流动相为水，流速为0.40 mL/min，每8 min收集一管，总共收集160管，检测波长为280 nm，按照出峰的时间顺序，收集得到6个多肽组分，分别命名为D1、D2、D3、D4、D5和D6（图1）。

通过步骤（1）~（4）得到6种螺旋藻多肽组份，用MTT法对这6个组份进行抗肿瘤活性检测，结果表明当这6种组份的浓度分别为500 μg/mL时，对乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG-2均具有一定的抑制作用（图 2）。其中D1和D3对乳腺癌细胞MCF-7有显著的抑制作用，其半数抑制浓度IC₅₀值小于31.25μg/mL，D3和D5的IC₅₀值分别为171.07μg/mL 和160.42μg/mL 。D1和D2对肝癌细胞HepG-2有较强的抑制作用，其半抑制浓度IC₅₀值分别为48.90 μg/mL和96.06μg/mL。MALDI-TOF-TOF-MS二级质谱分析得出D1中的一条分子量为970.5992的肽，其序列为RLLLLSAGGA(C→N)（图3）。D4是一个分子量为991.6139的单肽，序列为RLCLVLFK(C→N)（图4）。D5组分包含2条肽，其中一条肽同D4，另一条肽的分子量为808.4778，序列为RVGVHGAL(C→N)（图5）。在500μg/mL时，这三条肽MCF-7对抑制率分别为55.11%、52.92%和36.09%；，对HepG-2抑制率分别为40.17%、72.41%和27.10%。

实施例2

（1）取20 g螺旋藻粉，用超纯水配制成浓度为5% (w/v)的溶液，在-20 ℃冰箱中冷冻5h，再置于 37℃水浴中解冻2.5h，如此反复冻融4次。样品置于冰浴中均质70s，转速为5000rpm 20s，然后12000rpm 30s，最后5000rpm 20s 。然后冰浴中以500 W 的功率超声20min（每超声 4 s ，间隔 6 s）。4 ℃，8000r/min，离心 40 min。

（2）取步骤（1）得到的螺旋藻蛋白配置成3%（w/w）的蛋白液，加入碱性蛋白酶Alcalase2.4使酶与底物浓度比为5%（w/w），调节温度至50℃，pH为8.0，酶解6 h。然后调节pH至6.5，按照3.5%（w/w）的酶底比加入木瓜蛋白酶酶解3h。该过程中使用0.05mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间。酶解完毕后95℃水浴中灭酶10min，冷却至室温，8000r/min，离心40min后取上清液。

（3）取步骤（2）得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10 KD、5 KD以及3 KD的超滤膜过滤（CO2的压力为0.15 MPa的室温下），从而获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD，5-10KD和大于10 KD的螺旋藻蛋白酶解液。

（4）取步骤（2）得到的0-3K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析，柱体积为150 mL，上样量为2 mL，上样浓度为50 mg/mL，流动相为水，流速为0.40 mL/min，每8 min收集一管，总共收集160管，检测波长为280 nm，按照出峰的时间顺序，收集得到6个多肽组分，分别命名为D1、D2、D3、D4、D5和D6。检测方法与结果参照实施例1。

实施例3

（1）取25 g螺旋藻粉，用超纯水配制成浓度为5% (w/v)的溶液，在-20 ℃冰箱中冷冻6h，再置于 37℃水浴中解冻3h，如此反复冻融3次。样品置于冰浴中均质150s，先在转速为4000rpm 50s，然后8000rpm 50s，最后4000rpm 50s 。然后冰浴中以600 W 的功率超声15min（每超声 5 s ，间隔 7 s）。4 ℃，8000r/min，离心 45 min。

（2）取步骤（1）得到的螺旋藻蛋白配置成4%（w/w）的蛋白液，加入碱性蛋白酶Alcalase2.4使酶与底物浓度比为5%（w/w），调节温度至55℃，pH为8.5，酶解5h。然后调节pH至6.5，按照4%（w/w）的酶底比加入木瓜蛋白酶酶解3h。该过程中使用0.05mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间。酶解完毕后95℃水浴中灭酶10min，冷却至室温，8000r/min，离心45min后取上清液。

（3）取步骤（2）得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10 KD、5 KD以及3 KD的超滤膜过滤（CO2的压力为0.22 MPa的室温下），从而获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD，5-10KD和大于10 KD的螺旋藻蛋白酶解液。

（4）取步骤（2）得到的0-3K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析，柱体积为180 mL，上样量为2 mL，上样浓度为75 mg/mL，流动相为水，流速为0.40 mL/min，每8 min收集一管，总共收集160管，检测波长为280 nm，按照出峰的时间顺序，收集得到6个多肽组分，分别命名为D1、D2、D3、D4、D5和D6。检测方法与结果参照实施例1。

实施例4

（1）取25 g螺旋藻粉，用超纯水配制成浓度为5% (w/v)的溶液，在-20 ℃冰箱中冷冻8h，再置于 37℃水浴中解冻3h，如此反复冻融2次。样品置于冰浴中均质3min，先在转速为3000rpm 1min，然后7000rpm 1min，最后在3000rpm 1min 。然后冰浴中以670 W 的功率超声20min（每超声 7 s ，间隔 10 s）。4 ℃，8000r/min，离心 60 min。

（2）取步骤（1）得到的螺旋藻蛋白配置成5%（w/w）的蛋白液，加入碱性蛋白酶Alcalase2.4使酶与底物浓度比为6%（w/w），调节温度至60℃，pH为9，酶解4h。然后调节pH至7，按照5%（w/w）的酶底比加入木瓜蛋白酶酶解2h。该过程中使用0.2mol/L的NaOH和HCl来调节反应体系的pH值，控制pH值在pH±0.05之间。酶解完毕后90℃水浴中灭酶10min，冷却至室温，8000r/min，离心60min后取上清液。

（3）取步骤（2）得到的酶解液，依次用截留分子量分别为10 KD、5 KD以及3 KD的超滤膜过滤（CO2的压力为0.25 MPa的室温下），从而获得分子量大小范围为0-3 KD、3-5 KD，5-10KD和大于10 KD的螺旋藻蛋白酶解液。

（4）取步骤（2）得到的0-3K的酶解液进行葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱层析，柱体积为200 mL，上样量为4 mL，上样浓度为50 mg/mL，流动相为水，流速为0.40 mL/min，每8 min收集一管，总共收集160管，检测波长为280 nm，按照出峰的时间顺序，收集得到6个多肽组分，分别命名为D1、D2、D3、D4、D5和D6。检测方法与结果参照实施例1。

本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1. 一种螺旋藻抗肿瘤多肽的双酶解制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）取10~50 g螺旋藻粉，用超纯水配制成浓度为5% (w/v)的溶液，反复冻融2~5次后，冰浴中均质、超声，离心取上清液，冷冻干燥，备用；

2. 根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的双酶解制备方法，其特征在于，步骤（1）所述反复冻融条件为：-20 ℃冰箱中冷冻4~8h，再置于 37℃水浴中解冻2~3h；均质条件为：样品置于冰浴中均质1~3min，转速为在3000~5000rpm搅拌 20~50s，然后在7000~12000rpm搅拌 30~60s，最后在3000~5000rpm搅拌20~50s。

3. 根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的双酶解制备方法，其特征在于，步骤（1）所述超声条件为：样品置于冰浴中，以460~670 W 的功率超声20~15min，超声过程中每超声 4~8 s间隔 6~10 s后再超声4~8 s间隔 6~10 s，如此重复进行。

4. 根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的双酶解制备方法，其特征在于，步骤（1）所述离心条件为：4 ℃，8000 ~10000r/min，离心时间为 30 ~60min。

5. 根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的双酶解制备方法，其特征在于，步骤（2）碱性蛋白酶Alcalase2.4与木瓜蛋白酶双酶解的水解条件是：碱性蛋白酶酶解温度40~60℃，pH=7~9，酶解时间4~8 h，酶与底物的浓度比为4~6%（w/w），然后加入木瓜蛋白酶酶解，酶解温度40~60℃，pH=6~7，酶解时间2~4h，酶与底物浓度比为3~5%（w/w）。

6.根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的双酶解制备方法，其特征在于，步骤（2）所述灭酶条件为：80~95℃水浴灭酶10~15 min。

7.根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述离心条件为8000~10000 r/min，离心30~60 min。

8.根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的双酶解制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的超滤在CO₂压力为0.1～0.25 MPa的室温下用超滤杯结合10K，5K和3K的超滤膜超滤。

9.根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的双酶解制备方法，其特征在于，步骤（4）所述的葡聚糖凝胶Sephadex G-15分离纯化，具体条件为：柱体积为150~200 mL，上样量为1~4 mL，上样浓度为50~150 mg/mL，流动相为水，流速为0.4 mL/min，每8 min收集一管，总共收集160管，检测波长为280 nm。

10. 根据权利要求1所述的一种螺旋藻抗肿瘤多肽的双酶解制备方法，其特征在于，步骤（4）所述螺旋藻抗肿瘤多肽组份通过 MALDI-TOF-TOF质谱分析鉴定得到，D1其中一条分子量为970.5992的肽，其序列为RLLLLSAGGA(C→N)，D4为分子量991.6139的单肽，其序列为RLCLVLFK(C→N)，D5为两个肽的混合组分，其中一条与D4成分相同，另一条肽分子量为808.4778，序列为RVGVHGAL(C→N)。