CN110904178A - 一种蛋白多肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蛋白多肽的制备方法，涉及多肽技术领域。包含以下步骤：(1)活体螺旋藻过滤清洗、萃取处理；(2)碱性蛋白酶酶解；(3)风味蛋白酶酶解；(4)红曲霉酶解；(5)过滤；(6)洗脱、冷冻干燥。本发明的有益效果是：通过采用三步酶解法，即采用碱性蛋白酶、风味蛋白酶和红曲酶共同水解螺旋藻蛋白，能极大效率的提取螺旋藻蛋白多肽，且水解率达到75％以上。

Description

一种蛋白多肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种蛋白多肽的制备方法，具体的说，涉及一种螺旋藻蛋白多肽的制备方法。
背景技术
螺旋藻(Spirulina)是一类单细胞生物，属于蓝藻门颤藻科。大量研究表明，螺旋藻含有非常丰富的营养成分，蛋白质含量高达50％-70％，氨基酸组成比例非常理想，是一种极好的蛋白质来源。但蛋白质属于大分子物质，遇水膨胀后粘度较大，不利于加工，且也不利于人体对其消化和吸收。对螺旋藻蛋白质进行水解有利于提高蛋白质的溶解性，提高利用率。螺旋藻蛋白水解后形成多肽及小分子肽，能被人体快速吸收。
现有技术中，提取螺旋藻蛋白多肽的方法，主要有以下两种：一是采用反复冻融与超声破碎相结合的方法提取螺旋藻蛋白多肽，该方法提取率较低，且提取时间长；二是采用单一的生物酶提取法进行单独提取，同样存在提取率低的现象。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种蛋白多肽的制备方法旨在解决上述背景技术中存在的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种蛋白多肽的制备方法，包含以下步骤：
(1)活体螺旋藻过滤清洗、萃取处理：将活体螺旋藻过滤清洗，通过破壁技术对螺旋藻进行破壁分离，分离出螺旋藻蛋白和小分子多肽，将藻泥进行沥水处理，使藻泥的含水量处于75-85％；；
(2)第一步酶解：将处理好的藻泥装入反应罐内，加入碱性蛋白酶，完成第一步酶解反应；
(3)第二步酶解：在第一步酶解完成后加入风味蛋白酶，完成第二步酶解反应；
(4)第三步酶解：在第二步酶解完成后加入红曲霉，完成第三步酶解反应；
(5)过滤：采用截留分子量为3000～20000道尔顿的滤膜过滤或采用凝胶过滤色谱法过滤，收集滤液得到螺旋藻蛋白多肽溶液；
(6)将螺旋藻蛋白多肽溶液依次通过亲和色谱柱和反相色谱柱，收集洗脱液，冷冻干燥。
本发明的有益效果是：通过采用三步酶解法，即采用碱性蛋白酶、风味蛋白酶和红曲酶共同水解螺旋藻蛋白，能极大效率的提取螺旋藻蛋白多肽，且水解率达到75％以上。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步的，所述步骤(1)中在藻泥沥水之前调节PH为8-9。
优选的，所述酶解温度为50-60℃，所述酶解时间为5-12小时。
优选的，所述碱性蛋白酶活力为20万-80万U/g，其用量为藻泥质量的2.5-5％；所述风味蛋白酶活力为20-60万U/g，其用量为藻泥质量的1-3％；所述红曲霉活力为4-8万U/g，其用量为藻泥质量的0.20-0.3％；
本发明中，所述步骤(5)中，过滤时保持温度为45～60℃。
进一步的，所述步骤(5)中，过滤时所截留的分子量为5000道尔顿。
其中，所述步骤(6)中亲和色谱柱是以整合素作为配基的。
一种通过上述制备方法所制得得到的蛋白多肽的序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
本发明的一种根据上述方法所制备得到的蛋白多肽在制备功能食品、药品和化妆品中的应用。
采用上述进一步方案的有益效果是：本发明通过三步酶解法处理螺旋藻蛋白原料、过滤后采用以整合素为配基的亲和色谱法和反向色谱柱，能特异性分离螺旋藻蛋白多肽，制备过程简单易控，适宜于大规模制备和生产。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：蛋白多肽的制备方法一
(1)活体螺旋藻过滤清洗、萃取处理：将活体螺旋藻过滤清洗，通过破壁技术对螺旋藻进行破壁分离，分离出螺旋藻蛋白和小分子多肽，PH达到8时将藻泥进行沥水处理，使藻泥的含水量处于75-85％；
(2)第一步酶解：将处理好的藻泥装入反应罐内，加入活力为20万U/g、重量为藻泥质量2.5％的碱性蛋白酶，在50℃条件下完成第一步酶解反应，酶解时间为2.4小时；
(3)第二步酶解：在第一步酶解完成后加入活力为20万U/g、重量为藻泥质量1％的风味蛋白酶，在50℃条件下完成第二步酶解反应，酶解时间为1.3小时；
(4)第三步酶解：在第二步酶解完成后加入活力为4万U/g、重量为藻泥质量0.2％的红曲酶，在50℃条件下完成第三步酶解反应，酶解时间为1.3小时；
(5)过滤：在45℃条件下，采用截留分子量为5000道尔顿的滤膜过滤或采用凝胶过滤色谱法过滤，收集滤液得到螺旋藻蛋白多肽溶液；
(6)将螺旋藻蛋白多肽溶液循环上扬指以整合素为配基的亲和色谱柱，直至上样溶液与透过溶液中藻蓝蛋白含量一致，其中，柱填料体积为100ml，填料粒径为100μm；
(7)将步骤(6)中上样后的产品用25％的乙醇在室温条件下进行洗脱，所得到的溶液即为与整合素配基特异性结合的多肽溶液；
(8)将步骤(7)中的多肽溶液于50℃条件下进行减压蒸馏，即得到螺旋藻蛋白溶液；
(9)将步骤(8)中的螺旋藻蛋白溶液上样至反相色谱柱(Xbrige：C18,5μm，4.6*250mm)，然后以乙腈：水＝75:25为流动相进行等度洗脱，得到序列为HSHACTSYYCAKFCGTASCTHYCHPLHHYCCVNCSK的活性多肽溶液；
(10)将步骤(9)中的活性多肽溶液进行冷冻干燥，得到藻蓝蛋白活性多肽粉末。
实施例2：蛋白多肽的制备方法二
(1)活体螺旋藻过滤清洗、萃取处理：将活体螺旋藻过滤清洗，通过破壁技术对螺旋藻进行破壁分离，分离出螺旋藻蛋白和小分子多肽，PH达到8。5时将藻泥进行沥水处理，使藻泥的含水量处于75-85％；；
(2)第一步酶解：将处理好的藻泥装入反应罐内，加入活力为50万U/g、重量为藻泥质量4％的碱性蛋白酶，在55℃条件下完成第一步酶解反应，酶解时间为4小时；
(3)第二步酶解：在第一步酶解完成后加入活力为40万U/g、重量为藻泥质量2％的风味蛋白酶，在55℃条件下完成第二步酶解反应，酶解时间为3小时；
(4)第三步酶解：在第二步酶解完成后加入活力为6万U/g、重量为藻泥质量0.25％的红曲酶，在55℃条件下完成第三步酶解反应，酶解时间为3小时；
(5)过滤：在50℃条件下，采用截留分子量为5000道尔顿的滤膜过滤或采用凝胶过滤色谱法过滤，收集滤液得到螺旋藻蛋白多肽溶液；
(6)将螺旋藻蛋白多肽溶液循环上扬指以整合素为配基的亲和色谱柱，直至上样溶液与透过溶液中藻蓝蛋白含量一致，其中，柱填料体积为100ml，填料粒径为100μm；
(7)将步骤(6)中上样后的产品用25％的乙醇在室温条件下进行洗脱，所得到的溶液即为与整合素配基特异性结合的多肽溶液；
(8)将步骤(7)中的多肽溶液于50℃条件下进行减压蒸馏，即得到螺旋藻蛋白溶液；
(9)将步骤(8)中的螺旋藻蛋白溶液上样至反相色谱柱(Xbrige：C18,5μm，4.6*250mm)，然后以乙腈：水＝75:25为流动相进行等度洗脱，得到序列为HSHACTSYYCAKFCGTASCTHYCHPLHHYCCVNCSK的活性多肽溶液；
(10)将步骤(9)中的活性多肽溶液进行冷冻干燥，得到藻蓝蛋白活性多肽粉末。
实施例3：蛋白多肽的制备方法三
(1)活体螺旋藻过滤清洗、萃取处理：将活体螺旋藻过滤清洗，通过破壁技术对螺旋藻进行破壁分离，分离出螺旋藻蛋白和小分子多肽，PH达到9时将藻泥进行沥水处理，使藻泥的含水量处于75-85％；
(2)第一步酶解：将处理好的藻泥装入反应罐内，加入活力为80万U/g、重量为藻泥质量5％的碱性蛋白酶，在60℃条件下完成第一步酶解反应，酶解时间为5小时；
(3)第二步酶解：在第一步酶解完成后加入活力为60万U/g、重量为藻泥质量3％的风味蛋白酶，在60℃条件下完成第二步酶解反应，酶解时间为3.5小时；
(4)第三步酶解：在第二步酶解完成后加入活力为8万U/g、重量为藻泥质量0.3％的红曲酶，在60℃条件下完成第三步酶解反应，酶解时间为3.5小时；
(5)过滤：在60℃条件下，采用截留分子量为5000道尔顿的滤膜过滤或采用凝胶过滤色谱法过滤，收集滤液得到螺旋藻蛋白多肽溶液；
(6)将螺旋藻蛋白多肽溶液循环上扬指以整合素为配基的亲和色谱柱，直至上样溶液与透过溶液中藻蓝蛋白含量一致，其中，柱填料体积为100ml，填料粒径为100μm；
(7)将步骤(6)中上样后的产品用25％的乙醇在室温条件下进行洗脱，所得到的溶液即为与整合素配基特异性结合的多肽溶液；
(8)将步骤(7)中的多肽溶液于50℃条件下进行减压蒸馏，即得到螺旋藻蛋白溶液；
(9)将步骤(8)中的螺旋藻蛋白溶液上样至反相色谱柱(Xbrige：C18,5μm，4.6*250mm)，然后以乙腈：水＝75:25为流动相进行等度洗脱，得到序列为HSHACTSYYCAKFCGTASCTHYCHPLHHYCCVNCSK的活性多肽溶液；
(10)将步骤(9)中的活性多肽溶液进行冷冻干燥，得到藻蓝蛋白活性多肽粉末。
试验例1：三步酶解与单一酶解之间的水解率对比(每种酶解方法都酶解10小时)。如表1所示。
酶解方法 水解率(％)
碱性蛋白酶 67
风味蛋白酶 53
红曲酶 56
三步酶解 78％
从表1可以看出，单一酶中，碱性蛋白酶的提取效果最好，而当三者结合水解时，则水解率高达78％。
其中，蛋白质水解度的测定采用pH-stat法(Adler-Nissen，1986)，
螺旋藻蛋白水解度(DH)以水解断裂的肽键数目(h)占总键数目(htot)的百分数来确定，即：DH＝h/htot×100％
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 襄阳蒙肽生物有限公司
<120> 一种蛋白多肽的制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 螺旋藻(spirulina)
<400> 1
His Ser His Ala Cys Thr Ser Thr Thr Cys Ala Leu Pro Cys Gly Thr
1 5 10 15
Ala Ser Cys Thr His Thr Cys His Pro Leu His His Thr Cys Cys Val
20 25 30
Ala Cys Ser Leu
35

Claims (9)

1.一种蛋白多肽的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)活体螺旋藻过滤清洗、萃取处理：将活体螺旋藻过滤清洗，通过破壁技术对螺旋藻进行破壁分离，分离出螺旋藻蛋白和小分子多肽，将藻泥进行沥水处理，使藻泥的含水量处于75-85％；
(2)第一步酶解：将处理好的藻泥装入反应罐内，加入碱性蛋白酶，完成第一步酶解反应；
(3)第二步酶解：在第一步酶解完成后加入风味蛋白酶，完成第二步酶解反应；
(4)第三步酶解：在第二步酶解完成后加入红曲霉，完成第三步酶解反应；
(5)过滤：采用截留分子量为3000～20000道尔顿的滤膜过滤或采用凝胶过滤色谱法过滤，收集滤液得到螺旋藻蛋白多肽溶液；
(6)将螺旋藻蛋白多肽溶液依次通过亲和色谱柱和反相色谱柱，收集洗脱液，冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中在藻泥沥水之前调节PH为8-9。
3.根据权利要求1所述的蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述酶解温度为50-60℃，所述酶解时间为5-12小时。
4.根据权利要求1所述的蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶活力为20万-80万U/g，其用量为藻泥质量的2.5-5％；所述风味蛋白酶活力为20-60万U/g，其用量为藻泥质量的1-3％；所述红曲霉活力为4-8万U/g，其用量为藻泥质量的0.20-0.3％。
5.根据权利要求1所述的蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，过滤时保持温度为45～60℃。
6.根据权利要求1所述的蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，过滤时所截留的分子量为5000道尔顿。
7.根据权利要求1所述的蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中亲和色谱柱是以整合素作为配基的。
8.根据权利要求1所述的蛋白多肽的制备方法，其特征在于，得到的蛋白多肽的序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
9.如根据权利要求1所述的蛋白多肽在制备功能食品、药品和化妆品中的应用。
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