CN102533917A - 一种从胶原蛋白制备rgd活性多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法，该方法是以胶原蛋白为原料，溶于水后调整pH值为7.0~9.0，然后加入占胶原蛋白原料质量的1/5000~5/100的胰蛋白酶，30~45℃条件下酶解，反应完成后升高温度到55~65℃保温10~30分钟使胰蛋白酶失活，得到胶原蛋白酶解液，在15~60℃温度范围内，采用截留分子量为3,000~20,000道尔顿的滤膜过滤或采用凝胶过滤色谱法过滤，收集滤液得到胶原蛋白多肽溶液，最后依次通过亲和色谱柱和反相色谱柱，收集洗脱液，冷冻干燥，所得粉末即为RGD活性多肽。本发明的方法操作简便，产品品质高，所得RGD活性多肽适用于医药、食品及化妆品等多个领域。

Description

一种从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法

技术领域

本发明涉及一种从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法。

背景技术

胶原蛋白是由动物细胞合成的一类蛋白质家族，胶原蛋白由三条肽链组成，肽链自身为左手螺旋结构，三条α肽链则以平行右手螺旋形式缠绕成三股螺旋结构而构成胶原蛋白分子。胶原蛋白可根据多肽的氨基酸序列差异及其交联方式分为多种类型，现在已经发现30余种不同类型的胶原蛋白。不同类型的胶原蛋白显示出高度的歧异性，包括大小、序列、组织分布和分子组成等，各类型胶原蛋白在理化性质、组织分布和合成机制以及在胚胎期、成年期的结构与功能上存在一定差异。目前，胶原蛋白多肽开发的重点集中于采用化学法、酶法及其耦合实现胶原蛋白制备工艺及不同分子量范围的胶原多肽分离分级，所分离组分区分度和特征性均存在不足。

胶原蛋白在体内具有重要的生物学功能，含有多种生物活性肽。Byuu HG和KIM SK等人首先利用碱性蛋白酶、链酶蛋白酶E和胶原酶共同水解鱼胶原蛋白，进而利用凝胶过滤、离子交换和反相层析分离到两种具有抑制血管紧张素转化酶活性的三肽Gly-Pro-Leu和Gly-Pro-Met [Process Biochemistry, 2001,36:1155-1162]，他们采用同样的方法水解牛胶原蛋白，得到了具有类似活性的三肽Gly-Pro-Val [Journal of Agriculture Food Chemistry,2001,49: 2992-2997]。XY Gao等人以酶解明胶为原料，采用纤维连接蛋白亲和色谱法-凝胶过滤和反相层析法，分离得到具有抗肿瘤活性的12肽和15肽，此两肽位于胶原蛋白的非三螺旋核心区[European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 1998, 45: 275-284]。Maruyama S等人从猪胶原蛋白嗜热菌蛋白酶水解液中分离的Gly-Pro-Arg是一种纤维蛋白原/凝血酶凝集抑制剂[Biochimica et Biophysica Acta,1993,1164:215-223]。

RGD肽是指含有精氨酸-甘氨酸–天冬氨酸 (Arg-Gly-Asp)序列的多肽，RGD肽是细胞发生特异性识别的结构基础之一，RGD肽在肿瘤治疗、抗血栓、治疗急性肾衰等方面均具有一定效果和应用价值。目前RGD肽的制备方式主要有三种：（1）从天然动植物体内提取；（2）化学法合成；（3）重组DNA技术制备。第一种方法针对性强，但RGD肽在生物体内含量极低，大规模制备受限；第二种对结构特殊、或天然不存在的RGD肽制备具有优势，但该方法成本高，且副产物多；第三种方法应用广泛，但多适用于制备长肽和蛋白质，对RGD小肽制备不具备成本优势。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法，步骤如下：

（1）将胶原蛋白溶于水，调节pH值为7.0~9.0；

（2）酶解：在胶原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶，或者不会完全破坏胶原蛋白中RGD序列的酶，如胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等，加入量为胶原蛋白质量的1/5000~5/100， 30~45℃条件下酶解，酶解时间为1~8小时，用2,4,6-三硝基苯磺酸衍生-分光光度法测定酶解液吸光度，当吸光度不再增长时视为酶解完成，升高温度到55~65℃保温10~30分钟使胰蛋白酶失活，终止反应，得到胶原蛋白酶解液；

（3）过滤：在15~60℃温度范围内，采用截留分子量为3,000~20,000道尔顿的滤膜过滤或采用凝胶过滤色谱法过滤，收集滤液得到胶原蛋白多肽溶液；

（4）将胶原蛋白多肽溶液依次通过亲和色谱柱和反相色谱柱，收集洗脱液，冷冻干燥，所得粉末即为胶原蛋白RGD活性多肽。

上述制备方法，其中步骤（2）所述胶原蛋白为动物源未降解的完整胶原蛋白，或者经过酸法、碱法、酶法处理过的胶原蛋白，或直接采用明胶。动物源的胶原蛋白原料可以是人、猪、牛、马、驴和鱼的皮、骨等来源的胶原蛋白。如果采用的胶原蛋白原料直接是水溶液的形式，则可以省去溶于水的步骤，直接调节pH值为7.0~9.0即可。

步骤（2）酶解优选加入胰蛋白酶，胰蛋白酶比活为1,000-5,000 U/mg，使用该比活的酶，能够在高效酶解胶原蛋白的前提下节省用量，降低生产成本。

步骤（3）滤膜截留分子量优选为5,000道尔顿，适合于小分子RGD活性肽的筛选。

步骤（3）凝胶过滤色谱法用到的凝胶过滤色谱柱有效分离范围为3,000~100,000道尔顿。

步骤（4）所述亲和色谱柱是以整合素作为配基的。整合素可以与含RGD序列的胶原蛋白活性多肽特异结合，利用整合素作为配基，采用亲和色谱法分离胶原蛋白RGD活性多肽，具有高特异性和高分离效率。

反相色谱法的基本原理是利用不同序列多肽的疏水性差异，在反相色谱柱上具有不同的保留性质，从而实现多组分分离。本发明采用反相色谱法是为了在亲和色谱法的基础上，获得分离效果更好、纯度更高的含RGD序列活性多肽，如果胶原蛋白多肽溶液中含RGD序列活性多肽的种类少于三种，且直接通过亲和色谱法可以获得完全分离，则反相色谱分离过程可以省去。

本发明的方法制备得到的RGD活性多肽也在本发明的保护范围之内，所制备得到的胶原蛋白RGD活性多肽在医药、食品和化妆品领域均具有明确的应用价值，如作为抗肿瘤药物、抗血栓药物、药物靶向受体制剂、肿瘤受体显像剂、胶原蛋白多肽保健食品和美容护肤品添加剂等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过一步酶解法处理胶原蛋白原料、过滤后采用以整合素为配基的亲和色谱法，特异性分离胶原蛋白酶解产物中含RGD序列活性多肽，所分离多肽具有明确序列和结构特征，制备过程简单易控，适宜于大规模制备和生产，促进胶原蛋白高值化利用，本发明也可用于基于胶原蛋白多肽的血浆代用品活性成份去除，提升血浆代用品的临床疗效。

具体实施方式

实施例1 

以5mg/mL牛I型胶原蛋白水溶液为原料，从该胶原蛋白溶液中分离胶原蛋白RGD活性多肽。

（1）将牛I型胶原蛋白 (购自西格玛-奥德里奇中国有限公司) 水溶液的pH值调至8.0，体积为10 mL。

（2）向胶原蛋白溶液中加入比活为3,000 U/mg的胰蛋白酶粉50 μg，于45℃下震荡反应30 min后，用2,4,6-三硝基苯磺酸衍生-分光光度法测定酶解液吸光度，吸光度不再增长，酶解反应完成，反应液升温到55℃，保温20 min使胰蛋白酶失活，终止反应，获得胶原蛋白酶解液。

（3）采用截留分子量为5,000 道尔顿的超滤膜，在55℃条件下对上述胶原蛋白酶解液进行过滤，收集的透过液为胶原蛋白多肽溶液。

（4）将胶原蛋白多肽溶液循环上样至以整合素为配基的亲和色谱柱，直至上样溶液和透过溶液中胶原蛋白含量一致。柱填料体积：100 mL，填料粒径：50~150 μm。

（5）使用200 mL 0.2 M碳酸氢铵溶液作为淋洗剂淋洗色谱柱，流速3 mL/min，将未与整合素配基结合的多肽从亲和色谱柱洗脱出来。

（6）使用25%乙醇溶液在25℃下淋洗亲和色谱柱，将与整合素配基结合的多肽洗脱，流速2 mL/min，收集流出溶液至无多肽检测信号。

（7）将所收集的溶液于45-55℃减压低温蒸发至体积为10 mL的胶原蛋白溶液。

（8）将减压低温蒸发所得胶原蛋白溶液上样至反相C18色谱柱（孔径：300埃），以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，并依据色谱峰收集洗脱液，得到序列分别为RGDAGPK（SEQ ID NO:1），RGDK（SEQ ID NO:2），RGDIGSPGR（SEQ ID NO:3），RGDQGPVGR（SEQ ID NO:4）的四种含RGD序列胶原蛋白活性多肽的溶液。

（9）将上述四种含RGD序列的活性多肽收集液冷冻干燥，所得白色或淡黄色粉末即为胶原蛋白RGD活性多肽。

实施例2 

以人II型胶原蛋白为原料，从该胶原蛋白分离胶原蛋白RGD活性多肽。

（1）将50 mg人II型胶原蛋白(购自西格玛-奥德里奇中国有限公司)溶于10 mL水中，调节pH值至8.0。

（2）向胶原蛋白溶液中加入比活2,000 U/mg的胰蛋白酶粉50 μg，于40℃下震荡反应1 h后，用2,4,6-三硝基苯磺酸衍生-分光光度法测定酶解液吸光度，吸光度不再增长，酶解完成，升高温度到65℃保温10 min使胰蛋白酶失活，终止反应，获得胶原蛋白酶解液。

（3）采用凝胶过滤色谱法对胶原蛋白酶解液进行分级，将胶原蛋白酶解液上样至有效分离范围为3,000至100,000道尔顿的凝胶过滤色谱柱，柱填料体积：100 mL，流速3 ml/min。 利用标准蛋白建立保留时间-分子量对数值之间的线性关系，收集5,000道尔顿以下的流出液，所收集流出液为胶原蛋白多肽溶液。

（4）将胶原蛋白多肽溶液循环上样至以整合素为配基的亲和色谱柱，直至上样溶液和透过溶液中胶原蛋白含量一致。柱填料体积：100 mL，填料粒径：50-150 μm。

（5）使用200 mL 0.2 M 碳酸氢铵溶液作为淋洗剂淋洗色谱柱，流速3 mL/min，将未与整合素配基结合的多肽从亲和色谱柱洗脱出来。

（6）使用25%乙醇溶液在25℃下淋洗亲和色谱柱，将与整合素配基结合的多肽洗脱，流速2 mL/min，收集流出溶液至无多肽检测信号。

（7）将所收集溶液于45-55℃减压低温蒸发至体积为10 mL的胶原蛋白溶液。

（8）将减压低温蒸发所得胶原蛋白溶液上样至反相C18色谱柱（孔径：300埃），以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，并依据色谱峰收集洗脱液，得到序列分别为RGDRGD（SEQ ID NO:5），RGDVGE（SEQ ID NO:6），RGDSGPPGRAGEPGLQGPAGPPGE（SEQ ID NO:7）的三种含RGD序列胶原蛋白活性多肽的溶液。

（9）将上述三种含RGD序列的活性多肽收集液冷冻干燥，所得白色或淡黄色粉末即为胶原蛋白RGD活性多肽。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  广东药学院

 

<120>  一种从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法

 

<130> 

 

<160>  7    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  7

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  1

 

Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys

1               5          

 

 

<210>  2

<211>  4

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  2

 

Arg Gly Asp Lys

1              

 

 

<210>  3

<211>  9

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  3

 

Arg Gly Asp Ile Gly Ser Pro Gly Arg

1               5                  

 

 

<210>  4

<211>  9

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  4

 

Arg Gly Asp Gln Gly Pro Val Gly Arg

1               5                  

 

 

<210>  5

<211>  6

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  5

 

Arg Gly Asp Arg Gly Asp

1               5      

 

 

<210>  6

<211>  6

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  6

 

Arg Gly Asp Val Gly Glu

1               5      

 

 

<210>  7

<211>  24

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  7

 

Arg Gly Asp Ser Gly Pro Pro Gly Arg Ala Gly Glu Pro Gly Leu Gln

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu

            20                 

 

 

Claims (8)

1.一种从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法，其特征在于步骤如下：

（1）将胶原蛋白溶于水，调节pH值为7.0~9.0；

（2）酶解：在胶原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶，加入量为胶原蛋白质量的1/5000~5/100， 30~45℃条件下酶解，酶解时间为0.5~8小时，用2,4,6-三硝基苯磺酸衍生-分光光度法测定酶解液吸光度，当吸光度不再增长时视为酶解完成，升高温度到55~65℃保温10~30分钟使胰蛋白酶失活，终止反应，得到胶原蛋白酶解液；

（3）过滤：在15~60℃温度范围内，采用截留分子量为3,000~20,000道尔顿的滤膜过滤或采用凝胶过滤色谱法过滤，收集滤液得到胶原蛋白多肽溶液；

（4）将胶原蛋白多肽溶液依次通过亲和色谱柱和反相色谱柱，收集洗脱液，冷冻干燥，所得粉末即为RGD活性多肽。

2.根据权利要求1所述从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法，其特征在于步骤（2）所述胶原蛋白为动物源未降解的完整胶原蛋白，或者经过酸法、碱法、酶法处理过的胶原蛋白，或直接采用明胶。

3.根据权利要求1所述从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法，其特征在于步骤（2）在胶原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶比活为1,000-5,000 U/mg。

4.根据权利要求1所述从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法，其特征在于步骤（3）滤膜截留分子量为5,000道尔顿。

5.根据权利要求1所述从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法，其特征在于步骤（3）凝胶过滤色谱法用到的凝胶过滤色谱柱有效分离范围为3,000~100,000道尔顿。

6.根据权利要求1所述从胶原蛋白制备RGD活性多肽的方法，其特征在于步骤（4）所述亲和色谱柱是以整合素作为配基的。

7.权利要求1~6任意一项所述方法制备得到的RGD活性多肽。

8.权利要求7所述RGD活性多肽在制备RGD活性多肽药物、RGD活性多肽食品或RGD活性多肽化妆品中的应用。