CN105385741A - 一种蜈蚣藻多肽液的制备方法 - Google Patents

一种蜈蚣藻多肽液的制备方法 Download PDF

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吴文惠
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Abstract

本发明公开了一种蜈蚣藻多肽液的制备方法。其是以新鲜蜈蚣藻为原料，经过烘干、粉碎、加水浸泡、研磨处理，得到蜈蚣藻匀浆；将蜈蚣藻匀浆加入一定量的蛋白酶，控制酶解条件进行两次酶解，得到酶解液；酶解液经灭酶、离心处理后采用凝胶层析柱分离纯化，即纯化的蜈蚣藻多肽原液。本发明的制备方法，其工艺合理，操作简单，蜈蚣藻多肽提取率及纯度高，适合大规模生产。

Description

一种蜈蚣藻多肽液的制备方法
技术领域
本发明涉及肽的制备，尤其是一种利用蜈蚣藻制备蜈蚣藻多肽液的制备方法。
背景技术
我们知道，蜈蚣藻别名：海赤菜、冬家烂、膏菜，为红藻门蜈蚣藻科蜈蚣藻属植物，具有清热解毒和驱虫之功效，是中国东南海域常见的大型藻类，其藻体中含有L-杉藻氨酰-L-杉藻氨酸、蜈蚣藻氨酸、牛磺酸、琼胶、多糖、蛋白质及硫酸盐甾化物、磷酸盐，并含其他微量元素。对蜈蚣藻的研究表明，其成分复杂，有多种生物活性，具有防治各种心血管病、抗肿瘤、抗凝血、抗血栓、抗病毒、抗氧化及增强免疫力等作用。近年来，对蜈蚣藻的研究主要集中于多糖类，例如，2006年8月2日公开的CN1810842A中国发明专利申请说明书中公开的“一种长叶蜈蚣藻多糖提取物、其制备方法及用途”，其公开方法的长叶蜈蚣藻多糖提取物的制备方法是将长叶蜈蚣藻在pH值5-7，90-100℃条件下热水浸提，得提取液；提取液采用乙醇醇沉，离心，取沉淀物复溶于水后再冷冻干燥，得长叶蜈蚣藻多糖提取物。双如，2011年第4期《食品与机械》公开的“超声波辅助提取蜈蚣藻多糖的工艺优化研究”，在该公开文件中，其采用单因素试验和L9(33)正交试验研究温度、超声处理时间、提取次数和超声波功率对多糖提取率的影响，确定最佳工艺为超声波提取温度70℃、超声处理时间15min、超声波功率为450W、提取3次；多糖提取率为18.83%，得率为62.75%。
经研究证明，蜈蚣藻含有丰富的蜈蚣藻多肽，它具有降血压的功效。目前，尚未发现蜈蚣藻多肽的制备工艺的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺合理、操作简单、蜈蚣藻多肽提取率及纯度高的蜈蚣藻多肽液的制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：一种蜈蚣藻多肽液的制备方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取新鲜蜈蚣藻为原料，将其烘干后粉碎，得蜈蚣藻干粉；将蜈蚣藻干粉加入去离子水，其料液比1:10～20，浸泡，使之充分溶胀，再研磨制成蜈蚣藻匀浆；
(2)一次酶解：将步骤(1)中得到的蜈蚣藻匀浆加入蜈蚣藻干粉质量1～2%的蛋白酶，调节溶液pH值3～9，控制温度35～60℃，酶解2～3h，得一次酶解液；将一次酶解液低温离心，得一次酶解清液和沉淀物；
(3)二次酶解：将步骤(2)中得到的沉淀物按照质量体积比1:8～10加入去离子水中，使之重悬，得悬浮液；将得到的悬浮液中加入沉淀物质量1～1.5％的蛋白酶，调节溶液pH值3～9，控制温度35～60℃，酶解2～3h，得二次酶解液；将二次酶解液低温离心，得二次酶解清液；
(4)合并：将步骤(2)中得到的一次酶解清液与步骤(3)中得到的二次酶解清液进行合并，得酶解清液；
(5)灭酶：将步骤(4)中得到的酶解清液在沸水浴中灭酶10～20min，低温离心，收集上清液，得蜈蚣藻多肽原液；
(6)分离纯化：将步骤(5)中得到的蜈蚣藻多肽原液过sephadex-G10凝胶层析柱进行凝胶过滤，使用去离子水进行洗脱，收集吸收峰，即得纯化的蜈蚣藻多肽液。
所述的步骤(1)中的浸泡是于4℃浸泡过夜。
所述的步骤(2)、步骤(3)中的蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味酶中的一种或者一种以上的组合。
所述的一次酶解液低温离心是将一次酶解液采用离心机在4℃条件下，控制转速12000～15000g，离心30～45min。
所述的二次酶解液低温离心是将二次酶解液采用离心机在4℃条件下，控制转速8000～10000g，离心15～30min。
本发明是以新鲜蜈蚣藻为原料，经过烘干、粉碎、加水浸泡、研磨处理，得到蜈蚣藻匀浆；将蜈蚣藻匀浆加入一定量的蛋白酶，控制酶解条件进行两次酶解，得到酶解液；酶解液经灭酶、离心处理后采用凝胶层析柱分离纯化，即纯化的蜈蚣藻多肽原液。在本发明的方法中，将蜈蚣藻烘干后进行粉粹、研磨，使蜈蚣藻细胞充分破碎，有利于内容物充分释放出来；利用蛋白酶进行两次酶解，克服一次酶解产物抑制效应，使得蜈蚣藻沉淀物中残留的蛋白质被进一步得以分解利用，缩短反应时间，并大大提高了蜈蚣藻多肽的提取率。通过GB50095-2010中的第一法凯氏定氮法测定蜈蚣藻多肽液中蛋白质含量，以评估蜈蚣藻多肽的提取率。经测定，蜈蚣藻多肽原液中蛋白质含量为1～2％，提取率为65～85％。采用凝胶层析柱分离纯化，能够去除溶液中的离子成分，使获得的多肽产物纯度高达90%以上。本发明的制备方法，其工艺合理，操作简单，蜈蚣藻多肽提取率及纯度高，适合大规模生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种蜈蚣藻多肽液的制备方法，其经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取新鲜蜈蚣藻为原料，在50℃下将其烘干后粉碎，得蜈蚣藻干粉；将蜈蚣藻干粉加入去离子水，其料液比1:15，于4℃浸泡过夜，使之充分溶胀，再用研磨机控制转速2000r/min，研磨80min，制成蜈蚣藻匀浆；
(2)一次酶解：定量称取步骤(1)中得到的蜈蚣藻匀浆加入蜈蚣藻干粉质量1.5%的胰蛋白酶，酶活力＞15000ul/g，混合均匀；用1mol/l的碳酸钠溶液调节溶液pH值8，控制温度37℃，酶解3h，得一次酶解液；将一次酶解液采用离心机在4℃条件下，控制转速15000g，离心40min，得一次酶解清液和沉淀物；
(3)二次酶解：将步骤(2)中得到的沉淀物按照质量体积比1:8加入去离子水中，使之重悬，得悬浮液；将得到的悬浮液中加入沉淀物质量1.2％的碱性蛋白酶，其中该碱性蛋白酶由地衣芽孢杆菌常规发酵而得，用1mol/l的碳酸钠溶液调节溶液pH值8，控制温度50℃，酶解2h，得二次酶解液；将二次酶解液采用离心机在4℃条件下，控制转速8000g，离心30min，得二次酶解清液；
(4)合并：将步骤(2)中得到的一次酶解清液与步骤(3)中得到的二次酶解清液进行合并，得酶解清液；
(5)灭酶：将步骤(4)中得到的酶解清液在沸水浴中灭酶15min，采用离心机在4℃条件下，控制转速8000g，离心30min，收集上清液，得蜈蚣藻多肽原液；
(6)分离纯化：将步骤(5)中得到的蜈蚣藻多肽原液过sephadex-G10凝胶层析柱进行凝胶过滤，使用去离子水进行洗脱，收集吸收峰，即得纯化的蜈蚣藻多肽液。
本实施例所提供的蜈蚣藻多肽的制备方法，其工艺合理，操作简单，其采用两次酶解法，克服一次酶解产物抑制效应，使得蜈蚣藻沉淀物中残留的蛋白质被进一步得以分解利用，缩短反应时间，大大提高了蜈蚣藻多肽的提取率；采用凝胶层析柱进行分离纯化，提高了蜈蚣藻多肽的纯度高。经测定，蜈蚣藻多肽原液中蛋白质含量为1.16％，提取率为71.6％。
实施例2
一种蜈蚣藻多肽液的制备方法，其经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取新鲜蜈蚣藻为原料，在60℃下将其烘干后粉碎，得蜈蚣藻干粉；将蜈蚣藻干粉加入去离子水，其料液比1:20，于4℃浸泡过夜，使之充分溶胀，再用研磨机控制转速3000r/min，研磨60min，制成蜈蚣藻匀浆；
(2)一次酶解：将步骤(1)中得到的蜈蚣藻匀浆加入蜈蚣藻干粉质量2%的蛋白酶，其中，蛋白酶是由40%的木瓜蛋白酶、30%的中性蛋白酶、20%的碱性蛋白酶混合而成，酶活力＞20000ul/g；用1mol/l的碳酸钠溶液调节溶液pH值9，控制温度35℃，酶解3h，得一次酶解液；将一次酶解液采用离心机在4℃条件下，控制转速12000g，离心45min，得一次酶解清液和沉淀物；
(3)二次酶解：将步骤(2)中得到的沉淀物按照质量体积比1:10加入去离子水中，使之重悬，得悬浮液；将得到的悬浮液中加入沉淀物质量1％的蛋白酶，其中，蛋白酶是由60%的胃蛋白酶、40%的风味酶混合而成，酶活力＞20000ul/g；用1mol/l的碳酸钠溶液调节溶液pH值9，控制温度35℃，酶解2h，得二次酶解液；将二次酶解液采用离心机在4℃条件下，控制转速10000g，离心15min，得二次酶解清液；
(4)合并：将步骤(2)中得到的一次酶解清液与步骤(3)中得到的二次酶解清液进行合并，得酶解清液；
(5)灭酶：将步骤(4)中得到的酶解清液在沸水浴中灭酶20min，采用离心机在4℃条件下，控制转速10000g，离心10min，收集上清液，得蜈蚣藻多肽原液；
(6)分离纯化：将步骤(5)中得到的蜈蚣藻多肽原液过sephadex-G10凝胶层析柱进行凝胶过滤，使用去离子水进行洗脱，收集吸收峰，即得纯化的蜈蚣藻多肽液。
本实施例所提供的蜈蚣藻多肽的制备方法，其工艺合理，操作简单，其采用两次酶解法，克服一次酶解产物抑制效应，缩短反应时间，提高了蜈蚣藻多肽的提取率；采用凝胶层析柱进行分离纯化，提高了蜈蚣藻多肽的纯度高。经测定，蜈蚣藻多肽原液中蛋白质含量为1.57％，提取率为82.5％。
实施例3
一种蜈蚣藻多肽液的制备方法，其经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取新鲜蜈蚣藻为原料，在55℃下将其烘干后粉碎，得蜈蚣藻干粉；将蜈蚣藻干粉加入去离子水，其料液比1:10，于4℃浸泡过夜，使之充分溶胀，再用研磨机控制转速6000r/min，研磨30min，制成蜈蚣藻匀浆；
(2)一次酶解：将步骤(1)中得到的蜈蚣藻匀浆加入蜈蚣藻干粉质量1%的蛋白酶，其中，蛋白酶是由30%的木瓜蛋白酶、20%的菠萝蛋白酶、50%的胃蛋白酶混合而成，酶活力＞20000ul/g；用1mol/l的碳酸钠溶液调节溶液pH值3，控制温度60℃，酶解2.5h，得一次酶解液；将一次酶解液采用离心机在4℃条件下，控制转速14000g，离心40min，得一次酶解清液和沉淀物；
(3)二次酶解：将步骤(2)中得到的沉淀物按照质量体积比1:9加入去离子水中，使之重悬，得悬浮液；将得到的悬浮液中加入沉淀物质量1.5％的蛋白酶，其中，蛋白酶是由35%的胰蛋白酶、25%的碱性蛋白酶、40%的风味酶混合而成，酶活力＞15000ul/g；用1mol/l的碳酸钠溶液调节溶液pH值3，控制温度60℃，酶解2.5h，得二次酶解液；将二次酶解液采用离心机在4℃条件下，控制转速9000g，离心25min，得二次酶解清液；
(4)合并：将步骤(2)中得到的一次酶解清液与步骤(3)中得到的二次酶解清液进行合并，得酶解清液；
(5)灭酶：将步骤(4)中得到的酶解清液在沸水浴中灭酶10min，采用离心机在4℃条件下，控制转速9000g，离心15min，收集上清液，得蜈蚣藻多肽原液；
(6)分离纯化：将步骤(5)中得到的蜈蚣藻多肽原液过sephadex-G10凝胶层析柱进行凝胶过滤，使用去离子水进行洗脱，收集吸收峰，即得纯化的蜈蚣藻多肽液。
本实施例所提供的蜈蚣藻多肽的制备方法，其工艺合理，操作简单，两次酶解缩短反应时间，提高蜈蚣藻多肽的提取率；采用凝胶层析柱进行分离纯化，提高蜈蚣藻多肽的纯度高。经测定，蜈蚣藻多肽原液中蛋白质含量为1.01％，提取率为65.5％。

Claims (5)

1.一种蜈蚣藻多肽液的制备方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：
(1)原料预处理：选取新鲜蜈蚣藻为原料，将其烘干后粉碎，得蜈蚣藻干粉；将蜈蚣藻干粉加入去离子水，其料液比1:10～20，浸泡，使之充分溶胀，再研磨制成蜈蚣藻匀浆；
(2)一次酶解：将步骤(1)中得到的蜈蚣藻匀浆加入蜈蚣藻干粉质量1～2%的蛋白酶，调节溶液pH值3～9，控制温度35～60℃，酶解2～3h，得一次酶解液；将一次酶解液低温离心，得一次酶解清液和沉淀物；
(3)二次酶解：将步骤(2)中得到的沉淀物按照质量体积比1:8～10加入去离子水中，使之重悬，得悬浮液；将得到的悬浮液中加入沉淀物质量1～1.5％的蛋白酶，调节溶液pH值3～9，控制温度35～60℃，酶解2～3h，得二次酶解液；将二次酶解液低温离心，得二次酶解清液；
(4)合并：将步骤(2)中得到的一次酶解清液与步骤(3)中得到的二次酶解清液进行合并，得酶解清液；
(5)灭酶：将步骤(4)中得到的酶解清液在沸水浴中灭酶10～20min，低温离心，收集上清液，得蜈蚣藻多肽原液；
(6)分离纯化：将步骤(5)中得到的蜈蚣藻多肽原液过sephadex-G10凝胶层析柱进行凝胶过滤，使用去离子水进行洗脱，收集吸收峰，即得纯化的蜈蚣藻多肽液。
2.根据权利要求1所述的一种蜈蚣藻多肽液的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的浸泡是于4℃浸泡过夜。
3.根据权利要求1所述的一种蜈蚣藻多肽液的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)、步骤(3)中的蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味酶中的一种或者一种以上的组合。
4.根据权利要求1所述的一种蜈蚣藻多肽液的制备方法，其特征在于：所述的一次酶解液低温离心是将一次酶解液采用离心机在4℃条件下，控制转速12000～15000g，离心30～45min。
5.根据权利要求1所述的一种蜈蚣藻多肽液的制备方法，其特征在于：所述的二次酶解液低温离心是将二次酶解液采用离心机在4℃条件下，控制转速8000～10000g，离心15～30min。
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