CN107501434A - 一种白芨多糖胶提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药化工领域，具体是一种白芨多糖胶提取方法。本发明使用微生物对白芨进行处理，使微生物充分溶解白芨细胞的细胞壁，让白芨细胞内容物大量溶出，且基本不破坏内容物中的多糖，最后用乙醇使多糖沉淀，进行分离提取，得到了一种提取效率高、对多糖造成破坏较小的白芨多糖胶提取方法。通过本方法提取白芨多糖胶，其中多糖含量较高。
Description
技术领域
本发明涉及医药化工领域，具体是一种白芨多糖胶提取方法。
背景技术
白芨是兰科白芨属植物，又称小白芨、莲及草、雪如末等，千百年来一直作为传统中药使用，其主要功能是敛疮止血、补肺、消肿生肌等。白芨鳞茎中含有大量水溶液性多糖，其化学成分主要是葡萄甘露聚糖，其是白芨胶的主要功能性成分。白芨多糖胶是一种优良的天然增稠剂，是安全性较高的医药原料、性能卓越的药用辅料和有相当发展前景的生物医学材料。此外，白芨多糖胶还可应用于日化产品中，替代化学增稠剂，并具有减少刺激性、保护皮肤、延缓衰老等功能。
由于目前白芨的市场需求日渐扩大，近年来我国大部分地区的野生白芨遭到过度采挖，野生白芨急剧减少，濒临灭绝，被国家列为重点保护的野生药用植物之一。
通过提升白芨的提取效率，可以使在不增加白芨消耗量的情况下增加白芨提取产物，以满足日渐增多的白芨提取物需求量。
目前，常规的白芨胶提取方法，效率不够高，因此常使用高温、超声、加酸等辅助手段来增加提取效率，但是这些手段会对多糖等有益成分造成一定的破坏，导致所得成品白芨胶品质下降。因此，寻找一种提取效率较高，又不会大量破坏其中多糖等有益成分的白芨多糖胶提取方法是重中之重。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种白芨多糖胶提取方法，本发明所述的白芨多糖胶提取方法包括如下步骤：
(1)将鲜白芨切碎成0.5-1.5cm的小块，加入3-5倍重量的水，研磨成浆；
(2)向白芨浆中加入2-3％的复合菌剂，33-37℃密闭静置发酵16-18h，使微生物充分破坏白芨细胞的细胞壁，以便于内容物流出；
(3)向发酵后的白芨浆中加入0.7-1.2％的蛋白酶、1-1.5倍量的60-95％乙醇，加热回流提取，使白芨浆中蛋白质及醇溶性物质溶解；
(4)将提取后的白芨浆进行过滤，弃去滤液，取滤渣，得到滤渣a；
(5)向滤渣a中加入4-5倍重量的水，62-64℃加热回流提取1.5-2h，使多糖溶解，趁热进行过滤，得到滤液a与滤渣b；
(6)向滤渣b中加入2.5-3倍重量的水，90-98℃超声加热回流提取1-1.2h，使沉淀中未溶出的白芨多糖溶出，趁热进行过滤，只取滤液，得到滤液b；
(7)将滤液a与滤液b合并，浓缩至体积为合并滤液的1/4-1/3；
(8)向浓缩后的溶液中加入1-2倍体积的90-95％乙醇溶液，0-5℃静置12h以上，收集沉淀；
(9)将沉淀用3-5倍水完全溶解，进行过滤，取滤液，得到滤液c；
(10)向滤液c中加入1-2倍体积的90-95％乙醇溶液，0-5℃静置12h以上，收集沉淀；
(11)将沉淀冷冻干燥，即得。
所述复合菌剂，是由能分解纤维素和果胶的微生物组成，用以分解白芨细胞的细胞壁。
所述复合菌剂，是由白色瘤胃球菌和生黄瘤胃球菌，按照1:3的活菌数目比混合而成。
所述复合菌剂，是由生黄瘤胃球菌和产琥珀酸拟杆菌，按照1:1的活菌数目比混合而成。
所述蛋白酶是中性蛋白酶。中性蛋白酶在中性溶液中能完全发挥其分解蛋白质的能力。
所述步骤(11)，是将沉淀用去离子水完全溶解，加入20％Sevage试剂(将氯仿、正丁醇按照5：1的体积比混合而成)，振荡，使蛋白质溶于有机层，离心至有机、无机液面交界处无白色混悬，除去有机层，收集水层，浓缩后冷冻干燥，即得。此步骤可以有效降低白芨多糖蛋白质含量。
所述步骤(11)，是将沉淀用去离子水完全溶解，在-36.8℃冻结3h，在67.5℃解冻，反复8次，使蛋白质变性析出，离心除去沉淀，浓缩清液后冷冻干燥，即得。此步骤可以有效降低白芨多糖蛋白质含量。
白色瘤胃球菌和生黄瘤胃球菌都是瘤胃球菌属消化球菌科的一属革兰氏阳性厌氧细菌，白色瘤胃球菌分解纤维素和果胶能力较弱，但是不会对多糖造成影响；生黄瘤胃球菌分解纤维素和果胶能力较强，但会分解小部分多糖。
产琥珀酸拟杆菌也是存在于动物瘤胃中的微生物，对纤维素和果胶的分解能力要大于白色瘤胃球菌和生黄瘤胃球菌，但是会产生少许琥珀酸等产物，影响纯度。
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
本发明使用微生物对白芨进行处理，使微生物充分溶解白芨细胞的细胞壁，让白芨细胞内容物大量溶出，且基本不破坏内容物中的多糖，最后用乙醇使多糖沉淀，进行分离提取，得到了一种提取效率高、对多糖造成破坏较小的白芨多糖胶提取方法。通过本方法提取白芨多糖胶，其中多糖含量较高。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
(1)将鲜白芨切碎成0.5-1.5cm的小块，加入4倍重量的水，研磨成浆；
(2)向白芨浆中加入2.5％的复合菌剂，35℃密闭静置发酵17h，所述复合菌剂，是由白色瘤胃球菌和生黄瘤胃球菌，按照1:3的活菌数目比混合而成；
(3)向发酵后的白芨浆中加入0.95％的中性蛋白酶、1.25倍量的77.5％乙醇，加热回流提取；
(4)将提取后的白芨浆进行过滤，弃去滤液，取滤渣，得到滤渣a；
(5)向滤渣a中加入4.5倍重量的水，63℃加热回流提取1.75h，趁热进行过滤，得到滤液a与滤渣b；
(6)向滤渣b中加入2.75倍重量的水，94℃超声加热回流提取1.1h，趁热进行过滤，只取滤液，得到滤液b；
(7)将滤液a与滤液b合并，浓缩至体积为合并滤液的7/12；
(8)向浓缩后的溶液中加入1.5倍体积的92.5％乙醇溶液，0.25℃静置14h，收集沉淀；
(9)将沉淀用4倍水完全溶解，进行过滤，取滤液，得到滤液c；
(10)向滤液c中加入1.5倍体积的92.5％乙醇溶液，2.5℃静置14h，收集沉淀；
(11)将沉淀冷冻干燥，即得。
实施例2
(1)将鲜白芨切碎成0.5-1.5cm的小块，加入3倍重量的水，研磨成浆；
(2)向白芨浆中加入2％的复合菌剂，33℃密闭静置发酵16h，所述复合菌剂，是由白色瘤胃球菌和生黄瘤胃球菌，按照1:3的活菌数目比混合而成；
(3)向发酵后的白芨浆中加入0.7％的中性蛋白酶、1倍量的60％乙醇，加热回流提取；
(4)将提取后的白芨浆进行过滤，弃去滤液，取滤渣，得到滤渣a；
(5)向滤渣a中加入4倍重量的水，62℃加热回流提取1.5h，趁热进行过滤，得到滤液a与滤渣b；
(6)向滤渣b中加入2.5倍重量的水，90℃超声加热回流提取1h，趁热进行过滤，只取滤液，得到滤液b；
(7)将滤液a与滤液b合并，浓缩至体积为合并滤液的1/4；
(8)向浓缩后的溶液中加入1倍体积的90％乙醇溶液，0℃静置12h，收集沉淀；
(9)将沉淀用3倍水完全溶解，进行过滤，取滤液，得到滤液c；
(10)向滤液c中加入1倍体积的90％乙醇溶液，0℃静置12h，收集沉淀；
(11)将沉淀冷冻干燥，即得。
实施例3
(1)将鲜白芨切碎成0.5-1.5cm的小块，加入5倍重量的水，研磨成浆；
(2)向白芨浆中加入3％的复合菌剂，37℃密闭静置发酵18h，所述复合菌剂，是由白色瘤胃球菌和生黄瘤胃球菌，按照1:3的活菌数目比混合而成；
(3)向发酵后的白芨浆中加入1.2％的中性蛋白酶、1.5倍量的95％乙醇，加热回流提取；
(4)将提取后的白芨浆进行过滤，弃去滤液，取滤渣，得到滤渣a；
(5)向滤渣a中加入5倍重量的水，64℃加热回流提取2h，趁热进行过滤，得到滤液a与滤渣b；
(6)向滤渣b中加入3倍重量的水，98℃超声加热回流提取1.2h，趁热进行过滤，只取滤液，得到滤液b；
(7)将滤液a与滤液b合并，浓缩至体积为合并滤液的1/3；
(8)向浓缩后的溶液中加入2倍体积的95％乙醇溶液，5℃静置16h，收集沉淀；
(9)将沉淀用5倍水完全溶解，进行过滤，取滤液，得到滤液c；
(10)向滤液c中加入2倍体积的95％乙醇溶液，5℃静置16h，收集沉淀；
(11)将沉淀冷冻干燥，即得。
实施例4
(1)将鲜白芨切碎成0.5-1.5cm的小块，加入4倍重量的水，研磨成浆；
(2)向白芨浆中加入2.5％的复合菌剂，35℃密闭静置发酵17h，所述复合菌剂，是由生黄瘤胃球菌和产琥珀酸拟杆菌，按照1:1的活菌数目比混合而成；
(3)向发酵后的白芨浆中加入0.95％的中性蛋白酶、1.25倍量的77.5％乙醇，加热回流提取；
(4)将提取后的白芨浆进行过滤，弃去滤液，取滤渣，得到滤渣a；
(5)向滤渣a中加入4.5倍重量的水，63℃加热回流提取1.75h，趁热进行过滤，得到滤液a与滤渣b；
(6)向滤渣b中加入2.75倍重量的水，94℃超声加热回流提取1.1h，趁热进行过滤，只取滤液，得到滤液b；
(7)将滤液a与滤液b合并，浓缩至体积为合并滤液的7/12；
(8)向浓缩后的溶液中加入1.5倍体积的92.5％乙醇溶液，0.25℃静置14h，收集沉淀；
(9)将沉淀用4倍水完全溶解，进行过滤，取滤液，得到滤液c；
(10)向滤液c中加入1.5倍体积的92.5％乙醇溶液，2.5℃静置14h，收集沉淀；
(11)将沉淀冷冻干燥，即得。
实施例5
(1)将鲜白芨切碎成0.5-1.5cm的小块，加入4倍重量的水，研磨成浆；
(2)向白芨浆中加入2.5％的复合菌剂，35℃密闭静置发酵17h，所述复合菌剂，是由白色瘤胃球菌和生黄瘤胃球菌，按照1:3的活菌数目比混合而成；
(3)向发酵后的白芨浆中加入0.95％的中性蛋白酶、1.25倍量的77.5％乙醇，加热回流提取；
(4)将提取后的白芨浆进行过滤，弃去滤液，取滤渣，得到滤渣a；
(5)向滤渣a中加入4.5倍重量的水，63℃加热回流提取1.75h，趁热进行过滤，得到滤液a与滤渣b；
(6)向滤渣b中加入2.75倍重量的水，94℃超声加热回流提取1.1h，趁热进行过滤，只取滤液，得到滤液b；
(7)将滤液a与滤液b合并，浓缩至体积为合并滤液的7/12；
(8)向浓缩后的溶液中加入1.5倍体积的92.5％乙醇溶液，0.25℃静置14h，收集沉淀；
(9)将沉淀用4倍水完全溶解，进行过滤，取滤液，得到滤液c；
(10)向滤液c中加入1.5倍体积的92.5％乙醇溶液，2.5℃静置14h，收集沉淀；
(11)将沉淀用去离子水完全溶解，加入20％Sevage试剂(将氯仿、正丁醇按照5：1的体积比混合而成)，振荡，离心至有机、无机液面交界处无白色混悬，除去有机层，收集水层，浓缩后冷冻干燥即得。
实施例6
(3)将鲜白芨切碎成0.5-1.5cm的小块，加入4倍重量的水，研磨成浆；
(4)向白芨浆中加入2.5％的复合菌剂，35℃密闭静置发酵17h，所述复合菌剂，是由白色瘤胃球菌和生黄瘤胃球菌，按照1:3的活菌数目比混合而成；
(3)向发酵后的白芨浆中加入0.95％的中性蛋白酶、1.25倍量的77.5％乙醇，加热回流提取；
(4)将提取后的白芨浆进行过滤，弃去滤液，取滤渣，得到滤渣a；
(5)向滤渣a中加入4.5倍重量的水，63℃加热回流提取1.75h，趁热进行过滤，得到滤液a与滤渣b；
(6)向滤渣b中加入2.75倍重量的水，94℃超声加热回流提取1.1h，趁热进行过滤，只取滤液，得到滤液b；
(7)将滤液a与滤液b合并，浓缩至体积为合并滤液的7/12；
(8)向浓缩后的溶液中加入1.5倍体积的92.5％乙醇溶液，0.25℃静置14h，收集沉淀；
(9)将沉淀用4倍水完全溶解，进行过滤，取滤液，得到滤液c；
(10)向滤液c中加入1.5倍体积的92.5％乙醇溶液，2.5℃静置14h，收集沉淀；
(11)将沉淀用去离子水完全溶解，在-36.8℃冻结3h，在67.5℃解冻，反复8次，离心除去沉淀，浓缩清液后冷冻干燥即得。
对比例1
(1)选新鲜白芨，晒干，粉碎至过60目筛；
(2)向白芨粉末中加入20倍量的蒸馏水，60℃回流提取4h，经过抽滤分离滤液、滤渣；
(3)向滤渣中加入20倍量的蒸馏水，60℃回流提取4h，经过抽滤分离滤液、滤渣；
(4)合并两次滤液，5000g条件下离心20min，取上清液，调ph至7，70℃真空浓缩至原体积的1/3；
(5)向浓缩后的清液中加入3倍量的95％乙醇，4℃静置过夜；
(6)对溶液进行抽滤，收集滤渣，冷冻干燥后即得。
本对比例为常规的直接回流提取法。
将实施例1-6、对比例1所得的白芨多糖胶的白芨多糖提取率及成分含量进行对比。
与常规回流提取法相比，本发明的白芨多糖胶的提取方法，在粗多糖提取率、多糖含量方面具有显著优势，并且还原糖含量更少，说明本方法保护了多糖，保护了多糖在提取过程中不被转化为还原糖，在降低蛋白质含量方面，与常规回流方法相比，本发明的方法只略有优势，但在实施例5、6中，加入了脱去蛋白步骤之后，可以显著降低蛋白质含量。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种白芨多糖胶提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将鲜白芨切碎成0.5-1.5cm的小块，加入3-5倍重量的水，研磨成浆；
(2)向白芨浆中加入2-3％的复合菌剂，33-37℃密闭静置发酵16-18h；
(3)向发酵后的白芨浆中加入0.7-1.2％的蛋白酶、1-1.5倍量的60-95％乙醇，加热回流提取；
(4)将提取后的白芨浆进行过滤，弃去滤液，取滤渣，得到滤渣a；
(5)向滤渣a中加入4-5倍重量的水，62-64℃加热回流提取1.5-2h，趁热进行过滤，得到滤液a与滤渣b；
(6)向滤渣b中加入2.5-3倍重量的水，90-98℃超声加热回流提取1-1.2h，趁热进行过滤，只取滤液，得到滤液b；
(7)将滤液a与滤液b合并，浓缩至体积为合并滤液的1/4-1/3；
(8)向浓缩后的溶液中加入1-2倍体积的90-95％乙醇溶液，0-5℃静置12h以上，收集沉淀；
(9)将沉淀用3-5倍水完全溶解，进行过滤，取滤液，得到滤液c；
(10)向滤液c中加入1-2倍体积的90-95％乙醇溶液，0-5℃静置12h以上，收集沉淀；
(11)将沉淀冷冻干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的白芨多糖胶提取方法，其特征在于，所述复合菌剂，是由能分解纤维素和果胶的微生物组成。
3.根据权利要求2所述的白芨多糖胶提取方法，其特征在于，所述复合菌剂，是由白色瘤胃球菌和生黄瘤胃球菌，按照1:3的活菌数目比混合而成。
4.根据权利要求2所述的白芨多糖胶提取方法，其特征在于，所述复合菌剂，是由生黄瘤胃球菌和产琥珀酸拟杆菌，按照1:1的活菌数目比混合而成。
5.根据权利要求1所述的白芨多糖胶提取方法，其特征在于，所述蛋白酶是中性蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的白芨多糖胶提取方法，其特征在于，所述步骤(11)，是将沉淀用去离子水完全溶解，加入20％Sevage试剂(将氯仿、正丁醇按照5：1的体积比混合而成)，振荡，离心至有机、无机液面交界处无白色混悬，除去有机层，收集水层，浓缩后冷冻干燥，即得。
7.根据权利要求1所述的白芨多糖胶提取方法，其特征在于，所述步骤(11)，是将沉淀用去离子水完全溶解，在-36.8℃冻结3h，在67.5℃解冻，反复8次，离心除去沉淀，浓缩清液后冷冻干燥，即得。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20171222 |
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