JP5229728B2 - アルギナーゼ活性促進剤、免疫賦活剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、及び痩身剤 - Google Patents
アルギナーゼ活性促進剤、免疫賦活剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、及び痩身剤 Download PDFInfo
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アルギナーゼ活性促進剤としてはアンズ果汁(特許文献1)、細胞賦活剤としてはヒトリシズカ抽出物(特許文献2)、抗老化剤としては金時草抽出物(特許文献3)、美白剤としてはクルミの種皮抽出物(特許文献4)、抗酸化剤としてはコウヤマキ抽出物(特許文献5)、痩身剤としてはグリコーゲン(特許文献6)等が知られている。
なお、キオン属植物抽出物を有効成分とするアルギナーゼ活性促進剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、美白剤、抗酸化剤、及び痩身剤に関する先行技術は認められない。
ハンゴンソウの全草を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の20倍量の50質量%エタノールを加え、室温で撹拌しながら2時間抽出した。得られた抽出液を濾過して不溶物を取り除き、減圧濃縮後、凍結乾燥を行って、エタノール抽出物を得た。
ハンゴンソウの全草を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の20倍量の精製水を加え、オートクレーブにより20分間、120℃に加温して抽出した。得られた抽出液から、温度の高い状態を保ちながら吸引濾過により不溶物を取り除いた後、凍結乾燥を行って、熱水抽出物を得た。
エゾオグルマの全草を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の20倍量の50質量%エタノールを加え、室温で撹拌しながら2時間抽出した。得られた抽出液を濾過して不溶物を取り除き、減圧濃縮後、凍結乾燥を行って、エタノール抽出物を得た。
エゾオグルマの全草を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の20倍量の精製水を加え、オートクレーブにより20分間、120℃に加温して抽出した。得られた抽出液から、温度の高い状態を保ちながら吸引濾過により不溶物を取り除いた後、凍結乾燥を行って、熱水抽出物を得た。
超臨界抽出装置に乾燥、粉砕したさせたエゾオグルマの全草を投入し、40℃において15MPaの気圧下で二酸化炭素の超臨界流体を用いて抽出した。抽出物を回収し、超臨界抽出物を得た。
ヒト皮膚角化細胞(HaCaT細胞)を1ウェル当たり2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)にウシ胎児血清(FBS)を5質量%添加したものを用いた。24時間後1.2mMCaCl2を含む5質量%FBS添加DMEM培地によって、各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物2若しくはエゾオグルマ抽出物2を含有するサンプル液に交換しさらに9日間培養した。培地は3日に1回交換した。培養終了後、培養上清を採取し、アルギナーゼ活性促進能の評価を行った。アルギナーゼはアルギニンを加水分解し、オルニチンと尿素を生成する。尿素はウレアーゼによってアンモニアに分解され、アンモニアはペンタシアノニトロシル鉄(III)酸ナトリウム二水和物(ニトロプルシッドナトリウム)存在下でサリチル酸、次亜塩素酸と反応し、インドフェノールが生成する。アルカリ性条件下でインドフェノールの吸収(570nm)を測定し、尿素濃度を求め、アルギナーゼ活性の定量を行った。尿素定量のため、和光純薬社製尿素窒素B−テストワコーを用いて測定を行い、検量線を作成した。また、BCAProteinAssayKitにて、各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量あたりのアルギナーゼ活性促進能を求めた。サンプルを添加しないブランクの値を100とした時の相対値により、アルギナーゼ活性促進能を評価した。結果は、表1、2に示した通りであり、ハンゴウソウ抽出物2、エゾオグルマ抽出物2には、高いアルギナーゼ活性促進作用が認められた。
ヒト急性単球白血病細胞株(THP−1)を1ウェル当り5.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には1質量%のFBSを添加したRpswell Park Memorial Institute培地(RPMI)を用いた。24時間後、Phorbol 12−Myristate 13−Acetate(PMA)を20ng/mLとなるように細胞培養液に添加した。さらに24時間後、1質量%FBS添加RPMI培地にて各濃度に調整したハンゴウソウ抽出物2若しくはエゾオグルマ抽出物2を含有するサンプル培養液に交換し、48時間培養した。次に生細胞数測定試薬SF(同仁化学研究所)1/10量を添加した1質量%FBS添加RPMI培地を、上清を除いた細胞に添加し、2時間培養した。混合後、450nmの吸光度を測定した。同時に濁度として650nmの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。抽出物無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を100とした時の相対値にて細胞賦活作用を算出した。その結果表3、4に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高い免疫賦活作用が認められた。
正常ヒト真皮線維芽細胞を1ウェル当り2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には1質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。24時間後、1質量%FBS添加DMEM培地にて表5に示す濃度に調整したハンゴンソウ抽出物2若しくはエゾオグルマ抽出物1を含有する培養液に交換し、さらに48時間培養した。次に400μg/mLとなるよう培地にて調整したMTT試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約2時間培養した。最後に2−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、550nmの吸光度を測定した。同時に濁度として650nmの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。線維芽細胞賦活作用は、抽出物無添加のブランクにおける細胞賦活作用を100とした相対値にて評価を行った。その結果表5、6に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いヒト真皮線維芽細胞賦活作用が認められた。
ヒト表皮角化細胞HaCaTを1ウェル当り2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。24時間後、5質量%FBS添加DMEM培地にて各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物2を含有する培養液に交換し、さらに24時間培養した。次に100μg/mlとなるよう培地にて調整したMTT試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約2時間培養した。最後に2−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、550nmの吸光度を測定した。同時に濁度として650nmの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価結果をハンゴンソウ抽出物2無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を100とした時の相対値にて評価を行った。その結果表7に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物には、高いヒト表皮角化細胞賦活作用が認められた。
正常ヒト真皮繊維芽細胞を1ウェル当り2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。24時間後、0.5質量%FBS添加DMEM培地にて各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物2若しくはエゾオグルマ抽出物2を含有する培養液に交換し、さらに24時間培養した。培養上清中に分泌されたタイプIコラーゲンの定量にはELISA法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し2,2’−アジノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)ジアンモニウム塩(ABTS)及び過酸化水素を添加し反応させた後、405nmの吸光度を測定した。PIERCE社製BCA Protein Assay Kitにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプIコラーゲン産生量を求めた。評価結果を抽出物2無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのタイプIコラーゲン産生量を100とした時の相対値にて評価を行った。その結果、表8、9に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高い真皮線維芽細胞コラーゲン産生促進作用が認められた。
正常ヒト真皮繊維芽細胞を1ウェル当り2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。24時間後、0.5重量%FBS添加DMEM培地にて各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物2又はエゾオグルマ抽出物3を含有する培養液に交換し、さらに3日間培養した。培養上清中に分泌されたヒアルロン酸の定量には、プロテオグリカンを用いた間接ELISA法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し2,2’−アジノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)ジアンモニウム塩(ABTS)及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて405nmの吸光度を測定した。PIERCE社製BCA Protein Assay Kitにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を求めた。抽出物無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を100とした相対値にてヒアルロン酸産生促進作用の評価を行った。その結果表10、11に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いヒアルロン酸産生促進作用が認められた。
正常ヒト真皮線維芽細胞を1ウェル当り4.0×104個となるように48ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には1重量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。24時間後、1%FBS添加DMEMによって各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物2又はエゾオグルマ抽出物2を含有する培養液に交換し、さらに24時間培養した。細胞上清を除去し洗浄し、細胞を超音波処理して細胞中のATPを溶出した。その際に細胞内にあるATP分解酵素の溶出を防ぐため、ATP分解酵素阻害剤(Cellstein Hoechst33342)を添加した。ATPの定量にはMolecular Probes社製 ATP determination kitを使用した。細胞溶解液を試験管に分注し、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し、化学発光を測定した。抽出物無添加のコントロールにおけるATP産生能を100とした相対値にてヒト真皮線維芽細胞ATP産生促進作用の評価を行った。その結果、表12、13に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いヒト真皮線維芽細胞ATP産生促進作用が認められた。
B16マウスメラノーマ細胞(B16F0細胞)を1ディッシュ当り18000個となるように90mmディッシュに播種した。播種培地には5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。24時間後、5質量%FBS添加DMEM培地にて各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物1若しくはエゾオグルマ抽出物1を含有する培養液に交換し、さらに5日間培養した。培養終了後、トリプシン処理にて細胞をはがし、1.5 mLマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記評価基準を基にその黒化状況を肉眼判定した。評価ではネガティブコントロールに5%重量FBS添加DMEM培地、ポジティブコントロールに50 mM乳酸ナトリウムを含有する5%重量FBS添加DMEM培地を用いた。これらの肉眼判定結果は判定5及び判定1とし、サンプル判定の指標とした。肉眼判定は下記に示す通り、5段階評価した。また同時に、沈殿物に組織溶解剤(商品名Solvable)を添加して煮沸し、室温に戻して分光光度計(HITACHI製分光光度計U−3010)により500nmの吸光度を測定し、総メラニン量を求めた。その結果、表14、15に示したとおりハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いメラニン産生抑制作用が認められた。
評価基準
判定1:ポジティブコントロールと同程度(ほぼ白色)
判定2:ポジティブコントロールより僅かに黒い(薄い褐色)
判定3:ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間(褐色)
判定4:ネガティブコントロールより僅かに白い(黒褐色)
判定5:ネガティブコントロールと同程度(ほぼ黒色)
正常ヒト表皮メラニン細胞を1ウェル当り3.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはMedium 254Sを用いた。24時間後、Medium 254Sによって各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物2若しくはエゾオグルマ抽出物3を含有する培養液に交換し、さらに48時間培養した。次に1質量%Triton−Xを含有するリン酸緩衝液75μLに交換し、細胞を完全に溶解させ、内50μLを粗酵素液として使用した。粗酵素液に基質となる50μLの0.05質量%L−ドーパ含有リン酸緩衝液を加え、37℃で2時間静置した。基質添加直後と反応終了時の405 nmの吸光度を測定し、生成されたドーパメラニン量は両測定値の差を次式に導入して求めた。
生成されたドーパメラニン量
={(反応後405nm値−反応前405nm値)−2.166}/5.238
また、PIERCE社製BCA Protein Assay Kitにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量を求めた。評価結果は抽出物無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量と比較した。表16、17に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用が認められた。
50重量%エタノールによって各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物1若しくはエゾオグルマ抽出物2を含有する溶液100μLに、0.2mM 1,1−ジフェニル−2−ピクリルヒドラジル(DPPH)エタノール溶液100μLを添加し、よく混合した後、室温、暗所にて10分間静置し、DPPHラジカルに由来する516nmの吸光度を測定した。試料無添加時の吸光度を(A)、試料添加時の吸光度を(B)とした時の、DPPHラジカル消去率を次式により算出した。その結果、表18、19に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いDPPHラジカル消去作用が認められた。
消去率(%)={1 −(B)/(A)}×100
0.25mM WST−1及び 1mM Hypoxanthineを含むHANK’S(+)溶液 75μLに、HANK’S(+)溶液にて表9に示した濃度に調整したハンゴンソウ抽出物1若しくはエゾオグルマ抽出物2を含有する溶液25μLを添加した。さらに、Xanthine Oxidase 25μL(0.0075 Units)を添加し、37℃にて15分間反応後、450nmの吸光度を測定した。試料無添加時の吸光度を(A)、試料添加時の吸光度を(B)とした時、スーパーオキサイドアニオン消去率を次式により算出した。その結果、表20、21に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いスーパーオキサイドアニオン消去作用が認められた。
消去率(%)={1 −(B)/(A)}×100
ヒト表皮角化細胞HaCaTを1ウェル当り2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には10質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。24時間後、10質量%FBS添加DMEM培地にて各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物2若しくはエゾオグルマそう抽出物2を含有する培養液に交換し、さらに24時間培養した。任意濃度のt−butylhydroperoxideを添加したHANK’S(+)溶液に交換し、2時間培養した。さらに、150μg/mLニュートラルレッドを含有するPBS(−)に交換し、37℃にて2時間培養した。次に1容量%酢酸を含む50容量%エタノール水溶液に交換し、細胞内に取りこまれたニュートラルレッドを抽出し、抽出液の540nmの吸光度を測定した。t−butylhydroperoxide無添加のコントロールにおける細胞生存率を100としたときの相対値にて評価した。その結果、表22、23に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物、エゾオグルマ抽出物には、高いヒト表皮角化細胞過酸化脂質耐性作用が認められた。
皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞Cryo HPRAD−SQを1ウェル当り5.0×103個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはPGM培地(10% FBS, 2 mM L−glutamine, 100 units/mL Penicilline, 100μg/mL Streptomycine含有)を用いた。48時間培養後、各濃度に調整したハンゴンソウ抽出物2を添加したPGM分化用培地(10 μg/mLインシュリン, 1 μM Dexamethasone, 200μM Indomethacin, 500μM Isobutylmethylxanthine含有)に交換し、脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導開始後、コントロール群が成熟して細胞内に多数の脂肪滴が蓄積されるまで、10〜14日間培養した。細胞を回収後、10容量%中性緩衝ホルムアルデヒド溶液を用いて細胞を固定した。PBS(−)にて洗浄後、0.5w/v%オイルレッド溶液を添加し、37℃で2時間培養した。PBS(−)にて洗浄後、メタノールを添加し、色素を抽出し、550nmの吸光度を測定した。同時に、濁度として650nmの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて中性脂肪蓄積抑制作用を評価した。結果は抽出物無添加のコントロールにおける中性脂肪蓄積量を100とした時の相対値にて評価した。その結果、表24に示したとおり、ハンゴンソウ抽出物は、高い中性脂肪蓄積抑制作用を示した。
Claims (5)
- ハンゴンソウ、エゾオグルマから選択される1種又は2種の植物抽出物を有効成分とするアルギナーゼ活性促進剤。
- ハンゴンソウ、エゾオグルマから選択される1種又は2種の植物抽出物を有効成分とする免疫賦活剤。
- ハンゴンソウ、エゾオグルマから選択される1種又は2種の植物抽出物を有効成分とする抗老化剤。
- ハンゴンソウ、エゾオグルマから選択される1種又は2種の植物抽出物を有効成分とする美白剤。
- ハンゴンソウ、エゾオグルマから選択される1種又は2種の植物抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
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