JP5339763B2 - 保湿剤、アルギナーゼ活性促進剤、肌荒れ防止、改善剤、抗炎症剤、美白剤、抗酸化剤、抗老化剤 - Google Patents
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Description
シロダモの葉の乾燥粉砕物100gを、2.0kgの50容量%エタノール水溶液に、分散させ、撹拌しながら室温にて2時間抽出した。抽出上清を濾別したのち、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、抽出物1を得た。
シロダモの葉の乾燥粉砕物100gを、2.0kgの熱水で20分間加熱抽出した。抽出上清を濾別したのち、凍結乾燥を行い、抽出物2を得た。
正常ヒト真皮繊維芽細胞を1ウェル当り2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に1質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したものを用いた。24時間後、1質量%FBS添加DMEM培地にて各濃度に調整したサンプル培養液に交換しさらに48時間培養した。
次にMTT試薬を400μg/mLとなるように培地にて調整し、上清を除いた細胞に添加し約2時間培養した。最後に2−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、マイクロプレートリーダーにて550nmの吸光度を測定した。同時に濁度として650nmの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価では、サンプル培養液の他にネガティブコントロールとして1質量%FBS添加DMEM培地を、ポジティブコントロールとして5質量%FBS添加DMEM培地を用いた。評価は試料無添加時のコントロールにおける細胞賦活作用を100とした時の相対値を求めて行った。結果は、表1に示した通りであり、シロダモ葉のエタノール抽出物は、有意な真皮線維芽細胞賦活作用が認められた。
正常ヒト真皮繊維芽細胞を1ウェル当り2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル(DMEM)培地に5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したものを用いた。24時間後、0.5質量%FBS添加DMEM培地にて各濃度に調整した抽出物1若しくは抽出物2を含有するサンプル培養液に交換しさらに24時間培養した。
培養上清中に分泌されたタイプ1コラーゲン量はELISA法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し2、2’−アジノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)ジアンモニウム塩(ABTS)及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて405nmの吸光度を測定した。評価ではサンプル培養液の他にネガティブコントロールとして0.5%FBS添加DMEM培地を用いた。
評価はネガティブコントロールにおける細胞賦活作用を100とした時の相対値を求めて行った。具体的には、PIERCE社製BCA Protein Assay Kitにてタンパク量を測定し単位細胞又は単位タンパク量当りのコラーゲン産生量を求め、ネガティブコントロールの単位当りI型コラーゲン産生量を100とした時の相対値を求めた。結果は、表2、表3に示した通りであり、シロダモ抽出物は、有意な真皮線維芽細胞I型コラーゲン産生促進作用が認められた。
正常ヒト真皮線維芽細胞を1ウェル当たり4.0×104個となるように48穴マイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル(DMEM)培地に1質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したものを用いた。24時間培養後、1質量%FBS添加DMEM培地にて各濃度に調整した抽出物1若しくは抽出物2を含有するサンプル培養液に交換しさらに24時間培養した。次いで48穴マイクロプレートから細胞上清を除去し、PBSで洗浄した後、5mM硫酸マグネシウム,100μM EDTA,25mM トリシン緩衝液,pH7.8を添加し、超音波処理にて細胞を破砕し、細胞中のATPを溶出した。作成した細胞溶解液を試験管に分注し、更に0.5mM ルシフェリン,1.25μg/ml ルシフェラーゼ,1mM DTT,5mM 硫酸マグネシウム,100μM EDTA,25mM トリシン緩衝液,pH7.8を添加して、生じた化学発光を発光スペクトル560nm(ヤマト社製コンパクトルミVS501)にて測定した。試料無添加のブランクの値を100とした相対値にてATP産生促進能を評価し、その結果を表4、表5に示した。
ヒト皮膚角化細胞(HaCaT細胞)を1ウェル当たり2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)にウシ胎児血清(FBS)を5質量%添加したものを用いた。24時間後1.2mMCaCl2を含む5質量%FBS添加DMEM培地によって、各濃度に調整した抽出物1若しくは抽出物2を含有するサンプル液に交換しさらに9日間培養した。培地は3日に1回交換した。培養終了後、培養上清を採取し、アルギナーゼ活性促進能の評価を行った。アルギナーゼはアルギニンを加水分解し、オルニチンと尿素を生成する。尿素はウレアーゼによってアンモニアに分解され、アンモニアはペンタシアノニトロシル鉄(III)酸ナトリウム二水和物(ニトロプルシッドナトリウム)存在下でサリチル酸、次亜塩素酸と反応し、インドフェノールが生成する。アルカリ性条件下でインドフェノールの吸収(570nm)を測定し、尿素濃度を求め、アルギナーゼ活性の定量を行った。尿素定量のため、和光純薬社製尿素窒素B−テストワコーを用いて測定を行い、検量線を作成した。また、BCAProteinAssayKitにて、各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量あたりのアルギナーゼ活性促進能を求めた。サンプルを添加しないブランクの値を100とした時の相対値により、アルギナーゼ活性促進能を評価した。結果は、表6、表7に示した通りであり、シロダモ抽出物は、高いアルギナーゼ活性促進作用が認められた。
製造例1若しくは製造例2を50質量%エタノール水溶液を用いて各濃度に調整し、96ウェルマイクロプレートに100μLずつ添加した。さらに0.2mMの1,1−ジフェニル−2−ピクリルヒドラジル(DPPH)エタノール溶液を100μLずつ添加し、充分に混合後室温、暗所にて10分間若しくは24時間静置後、516nmの吸光度を測定した。試料無添加のブランクの吸光度を(A)、試料を添加したときの吸光度を(B)としたとき、次式(2)の値をラジカル消去率とした。静置10分後の評価結果を表8、表9に、静置24時間後の評価結果を表10、表11に示した。表8〜11に示した通り、シロダモ抽出物は、高いDPPHラジカル消去作用を示した。
DPPHラジカル消去率={1−(B)/(A)}×100(%) (2)
0.25mM WST−1及び1mMハイポキサンチンを含有するHANK’S(+)溶液75μLに、製造例1若しくは製造例2をHANK’S(+)溶液を用いて各濃度に調整したサンプル溶液25μLを添加する。さらに、キサンチンオキシダーゼ25μL(0.0075ユニット)を添加し、37℃で15分間反応させた後、450nmの吸光度を測定した。なお、ポジティブコントロールとして100μg/mLに調整したケルセチンを測定した。サンプル溶液に替えてHANK’S(+)溶液のみを添加した場合の吸光度を(A)、サンプル溶液を添加した場合の吸光度を(B)としたとき、スーパーオキサイドアニオン消去率は次式(3)によって求めた。結果は、表12、表13に示した通り、シロダモ抽出物は、高いスーパーオキサイドアニオン消去率を示した。
スーパーオキサイドアニオン消去率(%)=[1−(B)/(A)]×100 (3)
ヒト表皮未全角化細胞(HaCaT細胞)を1ウェルあたり2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に10質量%のウシ胎児結成(FBS)を添加して用いた。24時間後、10質量%FBS添加DMEM培地にて各濃度に調整した抽出物1若しくは抽出物2を含有する培養液に培地を交換し、さらに24時間培養した。
t−butylhydroperoxideを添加したHANK’S(+)溶液に交換し、2時間培養した。さらに150μg/mLニュートラルレッドを含有するPBS(−)に交換し37℃で2時間培養した。続いて1w/v%酢酸を含有する50質量%エタノール水溶液に交換し、細胞内に取り込まれたニュートラルレッドを抽出し、抽出液の540nmの吸光度を測定した。評価は、t−butylhydroperoxide無添加のコントロールの細胞生存率を100とした時の相対値を求めて行った。結果は、表14、表15に示した通りであり、シロダモ抽出物は、有意な過酸化脂質耐性作用が認められた。
60ng/mLとなるよう調整したホスホリパーゼA2(PLA2)と、任意の濃度に調整した試料(抽出物1)、10mMとなるように調整したDTNB(5,5−dithio−bis−(2−nitrobenzoic acid))を各10μLずつ混合し、室温で10分間静置した。さらに基質として1.66mMのDiheptanoyl Thio−PCを添加し、室温で45分間反応させ、414nmの吸光度を測定した。また、PLA2溶液にかえてバッフアーのみを添加した場合の吸光度を測定し、両測定値の差を求めた。コントロールとして蒸留水を、ポジティブコントロールとしては、0.1mg/mLに調整したThioethoramid−PCを用いた。コントロールの値を(A)、試料添加時の値を(B)とした時、PLA2酵素阻害作用は次式(4)によって求められる。評価結果は、表16に示した通り、シロダモ抽出物は、高いホスホリパーゼA2阻害作用を示した。
PLA2酵素阻害率(%)={1−(B)/(A)}×100 (4)
B16マウスメラノーマ細胞を90mmディッシュ1ディッシュ当り1.8×104個となるように播種し、5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いて培養した。24時間後に5質量%FBS添加DMEM培地に抽出物2を添加して各濃度に調整したサンプル培養液に交換した。さらに5日間培養し、培養終了後にトリプシンにより細胞を剥離して回収した。回収した細胞を遠心し、細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記に示した判定基準によりその黒化状況を目視で判定した。評価では、抽出物2を添加せず5質量%FBS添加DMEM培地のみで培養し、ネガティブコントロールとし、抽出物2のかわりに50mM乳酸ナトリウムを添加して培養し、ポジティブコントロールとした。また同時に、沈殿物に組織溶解剤(商品名Solvable[パーキンエルマー製])を添加して煮沸し、室温に戻して分光光度計(日立社製分光光度計U−3010)により500nmの吸光度を測定した。評価結果は表17に示したとおり、シロダモ抽出物は、有意なメラニン産生抑制作用が認められた。
評価基準
判定1:ポジティブコントロールと同程度(ほぼ白色)
判定2:ポジティブコントロールより僅かに黒い(薄い褐色)
判定3:ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間(褐色)
判定4:ネガティブコントロールより僅かに白い(黒褐色)
判定5:ネガティブコントロールと同程度(ほぼ黒色)
(1)スクワラン 10.0(質量%)
(2)メチルフェニルポリシロキサン 4.0
(3)水素添加パーム核油 0.5
(4)水素添加大豆リン脂質 0.1
(5)モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン(20E.O.) 1.3
(6)モノステアリン酸ソルビタン 1.0
(7)グリセリン 4.0
(8)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(9)カルボキシビニルポリマー 0.15
(10)精製水 53.85
(11)アルギニン(1質量%水溶液) 20.0
(12)抽出物1 5.0
製法:(1)〜(6)の油相成分を80℃にて加熱溶解する。一方(7)〜(10)の水相成分を80℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、(11)と(12)を順次加え、均一に混合する。
(1)エタノール 15.0(質量%)
(2)ポリオキシエチレン(40E.O.)硬化ヒマシ油 0.3
(3)香料 0.1
(4)精製水 78.38
(5)クエン酸 0.02
(6)クエン酸ナトリウム 0.1
(7)グリセリン 1.0
(8)ヒドロキシエチルセルロース 0.1
(9)抽出物2 5.0
製法:(1)に(2)及び(3)を溶解する。溶解後、(4)〜(8)を順次添加した後、十分に攪拌し、(9)を加え、均一に混合する。
(1)スクワラン 10.0(質量%)
(2)ステアリン酸 2.0
(3)水素添加パーム核油 0.5
(4)水素添加大豆リン脂質 0.1
(5)セタノール 3.6
(6)親油型モノステアリン酸グリセリン 2.0
(7)グリセリン 10.0
(8)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(9)アルギニン(20質量%水溶液) 15.0
(10)精製水 40.7
(11)カルボキシビニルポリマー(1質量%水溶液) 15.0
(12)抽出物1 1.0
製法:(1)〜(6)の油相成分を80℃にて加熱溶解する。一方(7)〜(10)の水相成分を80℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、(11)を加え、冷却を開始し、40℃にて(12)を加え、均一に混合する。
(1)精製水 27.45(質量%)
(2)グリセリン 10.0
(3)ショ糖脂肪酸エステル 1.3
(4)カルボキシビニルポリマー(1質量%水溶液) 17.5
(5)アルギン酸ナトリウム(1質量%水溶液) 15.0
(6)モノラウリン酸ポリグリセリル 1.0
(7)マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル 3.0
(8)N-ラウロイル-L-グルタミン酸
ジ(フィトステリル−2−オクチルドデシル) 2.0
(9)硬化パーム油 2.0
(10)スクワラン(オリーブ由来) 1.0
(11)ベヘニルアルコール 0.75
(12)ミツロウ 1.0
(13)ホホバ油 1.0
(14)1、3−ブチレングリコール 10.0
(15)L−アルギニン(10質量%水溶液) 2.0
(16)抽出物1 5.0
製法:(1)〜(6)の水相成分を混合し、75℃にて加熱溶解する。一方、(7)〜(14)の油相成分を混合し、75℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、50℃にて(15)を加える。さらに40℃まで冷却し、(16)を加え、均一に混合する。
(1)カルボキシビニルポリマー 0.5(質量%)
(2)精製水 86.7
(3)水酸化ナトリウム(10質量%水溶液) 0.5
(4)エタノール 10.0
(5)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(6)香料 0.1
(7)抽出物2 2.0
(8)ポリオキシエチレン(60E.O.)硬化ヒマシ油 0.1
製法:(1)を(2)に加え、均一に攪拌した後、(3)を加える。均一に攪拌した後、(4)に予め溶解した(5)を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた(6)〜(8)を加え、均一に攪拌混合する。
(1)スクワラン 81.0(質量%)
(2)イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル 15.0
(3)精製水 3.0
(4)抽出物1 1.0
製法:(1)と(2)を均一に溶解する。これに、(3)と(4)を順次加え、均一に混合する。
(1)ステアリン酸 16.0(質量%)
(2)ミリスチン酸 16.0
(3)親油型モノステアリン酸グリセリン 2.0
(4)グリセリン 20.0
(5)水酸化ナトリウム 7.5
(6)ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン 1.0
(7)精製水 36.5
(8)抽出物2 1.0
製法:(1)〜(4)の油相成分を80℃にて加熱溶解する。一方(5)〜(7)の水相成分を80℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却を開始し、40℃にて(8)を加え、均一に混合する。
(1)スクワラン 10.0(質量%)
(2)セタノール 2.0
(3)グリセリントリ−2−エチルヘキサン酸エステル 2.5
(4)親油型モノステアリン酸グリセリル 1.0
(5)プロピレングリコール 11.0
(6)ショ糖脂肪酸エステル 1.3
(7)精製水 69.4
(8)酸化チタン 1.0
(9)ベンガラ 0.1
(10)黄酸化鉄 0.4
(11)香料 0.1
(12)抽出物1 1.2
製法:(1)〜(4)の油相成分を混合し、75℃にて加熱溶解する。一方、(5)〜(7)の水相成分を混合し、75℃にて加熱溶解し、これに(8)〜(10)の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、40℃にて(11)と(12)の成分を加え、均一に混合する。
(1)メチルポリシロキサン 2.0(質量%)
(2)スクワラン 5.0
(3)ミリスチン酸オクチルドデシル 5.0
(4)セタノール 1.0
(5)ポリオキシエチレン(20E.O.)
ソルビタンモノステアリン酸エステル 1.3
(6)モノステアリン酸ソルビタン 0.7
(7)1、3−ブチレングリコール 8.0
(8)キサンタンガム 0.1
(9)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(10)精製水 57.4
(11)酸化チタン 9.0
(12)タルク 7.4
(13)ベンガラ 0.5
(14)黄酸化鉄 1.1
(15)黒酸化鉄 0.1
(16)香料 0.1
(17)抽出物2 1.0
製法:(1)〜(6)の油相成分を混合し、75℃にて加熱溶解する。一方、(7)〜(10)の水相成分を混合し、75℃にて加熱溶解し、これに(11)〜(15)の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。乳化終了後に冷却を開始し、40℃にて(16)と(17)の成分を順次加え、均一に混合する。
(1)流動パラフィン 30.0(質量%)
(2)マイクロクリスタリンワックス 2.0
(3)ワセリン 5.0
(4)ジグリセリンオレイン酸エステル 5.0
(5)塩化ナトリウム 1.3
(6)塩化カリウム 0.1
(7)プロピレングリコール 3.0
(8)1、3−ブチレングリコール 5.0
(9)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(10)抽出物1 1.0
(11)精製水 47.4
(12)香料 0.1
製法:(5)と(6)を(11)の一部に溶解して50℃とし、50℃に加熱した(4)に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、70℃にて加熱溶解した(1)〜(3)に均一に分散する。これに(7)〜(10)を(11)の残部に70℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、40℃にて(12)を加え、均一に混合する。
(1)精製水 58.9(質量%)
(2)ポリビニルアルコール 12.0
(3)エタノール 17.0
(4)グリセリン 5.0
(5)ポリエチレングリコール(平均分子量1000) 2.0
(6)抽出物2 5.0
(7)香料 0.1
製法:(2)と(3)を混合し、80℃に加温した後、80℃に加温した(1)に溶解する。均一に溶解した後、(4)と(5)を加え、攪拌しながら冷却を開始する。40℃まで冷却し、(6)と(7)を加え、均一に混合する。
(1)香料 0.3(質量%)
(2)抽出物2 1.0
(3)炭酸水素ナトリウム 50.0
(4)硫酸ナトリウム 48.7
製法:(1)〜(4)を均一に混合する。
(1)抽出物2 8.0(質量%)
(2)エリスリトール 1.0
(3)クエン酸 0.1
(4)ステビア 0.01
(5)精製水 90.89
製法:(1)〜(5)を均一に混合する。
Claims (1)
- シロダモの抽出物を有効成分として含有する、美白剤。
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