JP5159131B2

JP5159131B2 - 皮膚外用剤、保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤

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Publication number: JP5159131B2
Application number: JP2007072420A
Authority: JP
Inventors: 耕一郎田村; 香織戸部; 浩子吉田; 健太郎八木
Original assignee: Noevir Co Ltd
Current assignee: Noevir Co Ltd
Priority date: 2007-03-20
Filing date: 2007-03-20
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2027-03-20
Also published as: JP2008231020A

Description

本発明は、高い保湿効果、抗老化効果、抗酸化効果、抗炎症効果、美白効果及び痩身効果を発揮する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤並びに皮膚外用剤に関する。

従来より、皮膚の美観を保つことに対する女性の関心は非常に高く、シワ、シミ、タルミなどは女性の肌に対する悩みの上位に常に位置する。これらの悩みのうち、シワやタルミは、加齢等による真皮線維芽細胞の機能低下や、それに伴うコラーゲンやエラスチン等の真皮マトリックスの減少や変性、さらには紫外線等の外来ストレスによる酸化障害などが重要な要因となっている。また、もう一方の大きな悩みである、皮膚の色黒は一部不明な点もあるがホルモンの異常や日光の紫外線の刺激によるメラニン色素の産生が原因であり、その中でも、シミやソバカスはメラニン色素が異常沈着することが、その要因である。

これまでの皮膚外用剤の分野では、上述の皮膚の美観を損なうような諸症状を防止、或いは改善するために、さまざまな細胞賦活剤や抗酸化剤、メラニン産生抑制剤の検索及び配合検討が成されてきた。

例えば、細胞賦活剤としては、ポンカンのエッセンス（特許文献１参照）、ツリガネニンジン属、クサギ及びそれらの抽出物（特許文献２参照）、有機溶媒によるクロレラ抽出物（特許文献３参照）等、抗酸化剤としては、キク科ヘテロテカ属植物抽出物（特許文献４参照）やカユンアンギンの抽出物（特許文献５参照）等、さらにメラニン産生抑制剤としては、ホンダワラの抽出物（特許文献６参照）、ショウガ属植物の抽出物（特許文献７参照）等が知られている。

特開２００１−１３１０４５号公報特開２０００−１７８１９８号公報特開平１１−３３５２９３号公報特開平１１−１８０８８６号公報特開平１０−１８２４１３号公報特開平１０−３３０２２０号公報

天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などが皮膚外用剤や飲食品などの分野に幅広く応用されている。しかし、天然由来成分の中には未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた保湿作用、細胞賦活作用、抗酸化作用、美白作用などを有する有効成分の開発が期待されていた。本発明は、このような有効成分を見出すためになされたものであり、皮膚外用剤や飲食品などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、皮膚外用剤や飲食品などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤を見出すために、天然由来の種々の物質について検討を行った。その結果、ハマベンケイソウ属植物の抽出物に優れた、保湿作用、抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用、美白作用及び痩身作用を見出し、さらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤並びにハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤及び痩身剤を提供するものである。

さらに本発明は、ハマベンケイソウ属植物ハマベンケイソウの抽出物を有効成分として含有する皮膚外用剤並びに、ハマベンケイソウ属植物ハマベンケイソウの抽出物を有効成分として含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤を提供するものである。

本発明によれば、優れた効果を有する皮膚外用剤、保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤を提供することができる。

本発明の原料として用いられる植物であるハマベンケイソウ属植物（Mertensia Rnth.は、ムラサキ科（Borahinaceae）に属する双子葉植物で、北半球の亜寒帯・寒帯地域に分布し、約４０種が知られている。本発明においてハマベンケイソウ属植物としては、ハマベンケイソウ（Mertensia maritima (L.) S. F. Gray subsp. asiatica Takeda ）、エゾルリソウ（Mertensia pterocarpa (Turcz.) Tatew. et Ohwi var. yezoensis Tatew. et Ohwi）、バージニアブルーベルズ（Mertensia virginica (L.) Pers. ex Link）、アルパインブルーベルズ（Mertensia alpina (Torr.) G. Don）、アスペンブルーベルズ（Mertensia arizonica Greene）、ビューティフルブルーベルズ（Mertensia bella Piper）、ショートスタイルブルーベルズ（Mertensia brevistyla S. Wats. ）、アイダホブルーベルズ（Mertensia campanulata A. Nels. ）、トールフリンジドブルーベルズ（Mertensia ciliata (James ex Torr.) G. Don 、Mertensia ciliata (James ex Torr.) G. Don var. ciliata 、Mertensia ciliata (James ex Torr.) G. Don var. stomatechoides (Kellogg) Jepson ）、ドルモンズブルーベルズ（Mertensia drummondii (Lehm.) G. Don ）、フランシスカンブルーベルズ（Mertensia franciscana Heller）、ロッキーマウンテンブルーベルズ（Mertensia humilis Rydb.）、プレイリーブルーベルズ（Mertensia lanceolata (Pursh) DC.、Mertensia lanceolata (Pursh) DC. var. brachyloba (Greene) A. Nels. 、Mertensia lanceolata (Pursh) DC. var. coriacea (A. Nels.) Higgins & Welsh 、Mertensia lanceolata (Pursh) DC. var. lanceolata、Mertensia lanceolata (Pursh) DC. var. secundorum Cockerell 、Mertensia maritima (L.) S.F. Gray var. asiatica (Takeda) Welsh 、Mertensia maritima (L.) S.F. Gray var. maritima -- ）、スモールブルーベルズ（Mertensia longiflora Greene）、マクドガルズブルーベルズ（Mertensia macdougalii Heller）、オイスターリーフ（Mertensia maritima (L.) S.F. Gray ）、オボロングリーフブルーベルズ（Mertensia oblongifolia (Nutt.) G. Don）、トールブルーベルズ（Mertensia paniculata (Ait.) G. Don 、Mertensia paniculata (Ait.) G. Don var. paniculata）、アラスカトールブルーベルズ（Mertensia paniculata (Ait.) G. Don var. alaskana (Britt.) L.O. Williams ）、ノーザンブルーベルズ（Mertensia paniculata (Ait.) G. Don var. borealis (J.F. Macbr.) L.O. Williams）、イーストウッズブルーベルズ（Mertensia paniculata (Ait.) G. Don var. eastwoodiae (J.F. Macbr.) Hulten ）、ブロードリーフブルーベルズ（Mertensia platyphylla Heller、Mertensia platyphylla Heller var. platyphylla 、Mertensia platyphylla Heller var. subcordata (Greene) L.O. Williams ）、シェイドブルーベルズ（Mertensia umbratilis Greenm.）等を用いることができる。本発明においては、これらのハマベンケイソウ属植物の中のハマベンケイソウを用いることが、本発明の効果の点から好ましい。

本発明におけるハマベンケイソウ属植物は、ハマベンケイソウ属植物の原体や乾燥物を用いてもよいが、各種溶媒を用いて抽出した抽出物を用いるのが好ましい。抽出には、ハマベンケイソウ属植物の茎、葉、花、種子、根、地下茎、果実、芽などのいずれの部位を用いても構わないが、有効性の点からは茎葉若しくは全草を用いるとよい。抽出の際は、生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。抽出は、抽出溶媒に浸漬するか、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌や抽出溶媒中でホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。

抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール、１、３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール、エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類、酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができ、これらより１種又は２種以上を選択して用いる。また、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界流体や亜臨界流体を用いてもよい。

ハマベンケイソウ属植物の上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもでき、これらの生理作用を損なわない範囲で脱色、脱臭、脱塩等の精製処理やカラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。ハマベンケイソウ属植物の葉の前記抽出物やその処理物及び分画物は、各処理及び分画後に凍結乾燥し、用時に溶媒に溶解して用いることもできる。

ハマベンケイソウ属植物の抽出物は、優れた保湿作用、抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用、美白作用、及び痩身作用を有し、ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤として利用することができる。ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分とする保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤は、皮膚に外用するだけではなく、毛髪に利用することや経口摂取も可能であり、食品、飲料、あるいは医薬品などにも応用することが可能である。

ハマベンケイソウ属植物の抽出物は、アルギナーゼ活性促進作用（保湿作用）、細胞賦活作用（抗老化作用、肌荒れ改善作用）、メラニン産生抑制作用（美白作用）、過酸化脂質耐性作用（抗酸化作用）、スーパーオキサイドアニオン消去作用（抗酸化作用）、ヒアルロニダーゼ阻害作用（抗炎症作用）、中性脂肪蓄積抑制作用（痩身作用）を発揮し、保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、及び痩身剤として有用である。

ハマベンケイソウ属植物の抽出物を皮膚外用剤に配合する際の配合量は、皮膚外用剤の種類や使用目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して０．０００１〜５０．０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００１〜２５．０質量％である。

ハマベンケイソウ属植物の抽出物を配合する皮膚外用剤の剤型は任意であり、例えば、ローションなどの可溶化系、クリームや乳液などの乳化系、カラミンローション等の分散系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填したエアゾール、軟膏剤、粉末、顆粒などの種々の剤型で提供することもできる。

なお、ハマベンケイソウ属植物の抽出物を配合する皮膚外用剤には、ハマベンケイソウ属植物の抽出物の他に、必要に応じて、通常医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪用化粧料及び洗浄料に配合される、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤、香料、樹脂、防菌防黴剤、アルコール類等を適宜配合することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤、細胞賦活剤、あるいは抗酸化剤との併用も可能である。

以下にハマベンケイソウ属植物抽出物の製造例、各作用を評価するための試験、皮膚外用剤や食品としての処方例、使用試験についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。

［抽出物１］
ハマベンケイソウの全草の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの５０容量％エタノール水溶液に、分散させ、撹拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出上清を濾別したのち、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、抽出物１を得た。

［抽出物２］
ハマベンケイソウの全草の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの熱水で２０分間加熱抽出した。抽出上清を濾別したのち、凍結乾燥を行い、抽出物２を得た。

上記抽出物１、抽出物２を用いて、アルギナーゼ活性促進作用、細胞賦活作用、メラニン産生抑制作用、過酸化脂質耐性作用、スーパーオキサイドアニオン消去作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用、中性脂肪蓄積抑制作用の評価を行った。なお各評価結果に記載した*及び**は、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を*で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を**でそれぞれ表したものである。

［アルギナーゼ活性促進作用］
ヒト皮膚角化細胞を１ウェル当たり２．０×１０⁴個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）にウシ胎児血清（ＦＢＳ）を５％添加したものを用いた。２４時間後１．２ｍＭＣａＣｌ₂を含む５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地によって、各濃度に調整した抽出物２を含有するサンプル液に交換しさらに９日間培養した。培地は３日に１回交換した。培養終了後、培養上清を採取し、アルギナーゼ活性促進能の評価を行った。アルギナーゼはアルギニンを加水分解し、オルニチンと尿素を生成する。尿素はウレアーゼによってアンモニアに分解され、アンモニアはペンタシアノニトロシル鉄（ＩＩＩ）酸ナトリウム二水和物（ニトロプルシッドナトリウム）存在下でサリチル酸、次亜塩素酸と反応し、インドフェノールが生成する。アルカリ性条件下でインドフェノールの吸収（５７０ｎｍ）を測定し、尿素濃度を求め、アルギナーゼ活性の定量を行った。尿素定量のため、和光純薬社製尿素窒素Ｂ−テストワコーを用いて同様の測定を行い、検量線を作成した。また、ＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙＫｉｔにて、各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量あたりのアルギナーゼ活性促進能を求めた。サンプルを添加しないブランクの値を１００とした時の相対値により、アルギナーゼ活性促進能を評価した。結果は、表１に示した通りであり、ハマベンケイソウ抽出物は、高いアルギナーゼ活性促進作用が認められた。

［真皮線維芽細胞賦活作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０^４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間後、１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整したサンプル培養液に交換しさらに４８時間培養した。
次にＭＴＴ試薬を４００μｇ／ｍＬとなるように培地にて調整し、上清を除いた細胞に添加し約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価は試料無添加時のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値を求めて行った。結果は、表２に示した通りであり、ハマベンケイソウ抽出物は、有意な真皮線維芽細胞賦活作用が認められた。

［真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０^４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整した抽出物１を含有するサンプル培養液に交換しさらに２４時間培養した。
培養上清中に分泌されたタイプ１コラーゲン量はＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２、２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。評価ではサンプル培養液の他にネガティブコントロールとして０．５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を、ポジティブコントロールとして５０μＭのＬ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩（ＶＣＰＭｇ）を含有する０．５重量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。
評価はコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値を求めて行った。PIERCE社製BCA Protein Assay Kitにてタンパク量を測定し単位細胞又は単位タンパク量当りのコラーゲン産生量を求め、ネガティブコントロールの単位当りコラーゲン産生量を１００とした時の相対値を求めて行った。結果は、表３に示した通りであり、ハマベンケイソウ抽出物は、有意な真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用が認められた。

［表皮細胞賦活作用］
ヒト表皮未全角化細胞（ＨａＣａＴｃｅｌｌ）を１ウェルあたり２．０×１０⁴個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児結成（ＦＢＳ）を添加して用いた。２４時間後、５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整した抽出物２を含有する培養液に培地を交換し、さらに２４時間培養した。
次にＭＴＴ試薬を１００μｇ／ｍＬとなるように培地にて調整し交換し約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価はコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値を求めて行った。結果は、表４に示した通りであり、ハマベンケイソウ抽出物は、有意な表皮細胞賦活作用が認められた。

［表皮細胞を用いた過酸化脂質耐性作用］
ヒト表皮未全角化細胞（ＨａＣａＴｃｅｌｌ）を１ウェルあたり２．０×１０⁴個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０質量％のウシ胎児結成（ＦＢＳ）を添加して用いた。２４時間後、１０質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整した抽出物２を含有する培養液に培地を交換し、さらに２４時間培養した。
ｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅを添加したＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液に交換し、２時間培養した。さらに１５０μｇ／ｍＬニュートラルレッドを含有するＰＢＳ（−）に交換し３７℃で２時間培養した。続いて１ｗ／ｖ％昨酸を含有する５０質量％エタノール水溶液に交換し、細胞内に取り込まれたニュートラルレッドを抽出し、抽出液の５４０ｎｍの吸光度を測定した。評価は、ｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ無添加のコントロールの細胞生存率を１００とした時の相対値を求めて行った。有意差検定は、抽出物２無添加の場合と、抽出物２を添加した場合の細胞生存率に有意差があるかどうかを検定した。結果は、表５に示した通りであり、ハマベンケイソウ抽出物は、有意な過酸化脂質耐性作用が認められた。特に抽出物２を１ｍｇ／ｍＬ添加したサンプルは、ｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ無添加のコントロールとほぼ同程度の高い細胞生存率を示した。

［スーパーオキサイドアニオン消去能評価作用］
０．２５ｍＭＷＳＴ−１及び１ｍＭハイポキサンチンを含有するＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液７５μＬ、ＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液にて各濃度に調整した抽出物１を含有するサンプル溶液２５μＬを添加する。さらに、キサンチンオキシダーゼ２５μＬ（０．００７５ユニット）を添加し、３７℃で１５分間反応させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。サンプル溶液に替えてＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液のみを添加した場合の吸光度を（Ａ）、サンプル溶液を添加した場合の吸光度を（Ｂ）としたとき、スーパーオキサイドアニオン消去率は次式によって求めた。
消去率（％）＝［１−（Ｂ）／（Ａ）］×１００
結果は、表６に示した通りであり、ハマベンケイソウ抽出物は、有意なスーパーオキサイドアニオン消去作用が認められた。

[中性脂肪蓄積抑制作用]
皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞ＣｒｙｏＨＰＲＡＤ−ＳＱ（三光純薬株式会社）を１ウェル当り１．０×１０^４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＰＧＭ培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ、１００μｇ／ｍＬＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ含有）を用いた。細胞がコンフルエントになる直前に抽出物１を添加したＰＧＭ−分化用培地（１０μｇ／ｍＬインスリン、１μＭｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、２００μＭｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ、５００μＭＩｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ含有）に交換し、脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導開始後、コントロール群が成熟して細胞内に多数の脂肪滴が蓄積されるまで、１０〜１４日間培養した。細胞を回収後、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド液を用いて細胞を固定した。ＰＢＳ（−）にて洗浄の後、０．５ｗ／ｖ％オイルレッドＯ溶液を添加し、３７℃で２時間培養した。ＰＢＳ（−）にて洗浄の後、メタノールを添加し、色素を抽出した。抽出後、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍ、６５０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定し、両測定値の差を用いて中性脂肪蓄積抑制作用の評価を行った。評価は、試料無添加のブランクにおける中性脂肪蓄積量を１００とした相対値を求めて行った。結果は、表７に示した通り、ハマベンケイソウ抽出物は、有意な中性脂肪蓄積抑制作用が認められた。

［メラニン産生抑制作用］
評価は、以下の手順で行った。Ｂ１６メラノーマ細胞を９０ｍｍディッシュ１ディッシュ当り１．８×１０^４個となるように播種し、５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。２４時間後に５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に抽出物２を添加して各濃度に調整した抽出物２添加培地に交換した。さらに５日間培養し、培養終了後にトリプシンにより細胞を剥離して回収した。回収した細胞を遠心し、細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記に示した判定基準によりその黒化状況を目視で判定した。評価では、抽出物２を添加せず５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地のみで培養し、ネガティブコントロールとし、抽出物２のかわりに５０ｍＭ乳酸ナトリウムを添加して培養し、ポジティブコントロールとした。また同時に、沈殿物に組織溶解剤（商品名Ｓｏｌｖａｂｌｅ[パーキンエルマー製]）を添加して煮沸し、室温に戻して分光光度計（日立社製分光光度計Ｕ−３０１０）により５００ｎｍの吸光度を測定した。評価結果は表８に示したとおり、ハマベンケイソウ抽出物は、有意なメラニン産生抑制作用が認められた。
評価基準
判定１：ポジティブコントロールと同程度（ほぼ白色）
判定２：ポジティブコントロールより僅かに黒い（薄い褐色）
判定３：ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間（褐色）
判定４：ネガティブコントロールより僅かに白い（黒褐色）
判定５：ネガティブコントロールと同程度（ほぼ黒色）

［ヒアルロニダーゼ阻害作用］
ヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍の緒由来）を０．９ｍｇ／ｍＬになるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、基質溶液とした。市販のヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来）を５，３００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、酵素溶液とした。酵素溶液は用事調製とした。試験管に緩衝液で各濃度に調製した抽出物１を含有するサンプル溶液０．１ｍＬ、及び酵素溶液０．０３ｍＬを試験管にとり、３７℃で２０分間反応させた。次に活性化剤を０．０６ｍＬ加え、３７℃で２０分間反応させた。さらに基質溶液を０．１５ｍＬ加え、３７℃で１時間反応させた。０．４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．０６ｍＬを加え反応を停止させた後すぐに氷冷し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）を０．０６ｍＬ添加し、３分間煮沸した後さらに氷冷した。ｐ−ＤＡＢＡ溶液を２．０ｍＬ添加し、３７℃で２０分間反応させた後、各試験管から９６ウェルマイクロプレートに移しかえ、マイクロプレートリーダーを用いて５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールには、サンプルを溶かすのに用いた緩衝溶液のみを加えたものを用いた。ヒアルロニダーゼの活性が阻害されると分解産物であるＮ−アセチルグルコサミンが減少し、ｐ−ＤＡＢＡによる吸光度が低くなる。このことを利用し、阻害活性は次式より求めた。評価結果は表９に示したとおり、ハマベンケイソウ抽出物は、有意なヒアルロニダーゼ阻害作用が認められた。
阻害率（％）＝（コントロール吸光度−サンプル吸光度）／コントロール吸光度×１００

本発明を実施した処方例を示す。

［処方例１］乳液
（１）スクワラン１０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン４．０
（３）水素添加パーム核油０．５
（４）水素添加大豆リン脂質０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）１．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン１．０
（７）グリセリン４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル０．１
（９）カルボキシビニルポリマー０．１５
（10）精製水５３．８５
（11）アルギニン（１質量％水溶液）２０．０
（12）抽出物１５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、（11）と（12）を順次加え、均一に混合する。

［処方例２］化粧水
（１）エタノール１５．０（質量％）
（２）ポリオキシエチレン（４０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油０．３
（３）香料０．１
（４）精製水７８．３８
（５）クエン酸０．０２
（６）クエン酸ナトリウム０．１
（７）グリセリン１．０
（８）ヒドロキシエチルセルロース０．１
（９）抽出物２５．０
製法：（１）に（２）及び（３）を溶解する。溶解後、（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。

［処方例３］クリーム
（１）スクワラン１０．０（質量％）
（２）ステアリン酸２．０
（３）水素添加パーム核油０．５
（４）水素添加大豆リン脂質０．１
（５）セタノール３．６
（６）親油型モノステアリン酸グリセリン２．０
（７）グリセリン１０．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル０．１
（９）アルギニン（２０質量％水溶液）１５．０
（10）精製水４０．７
（11）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液）１５．０
（12）抽出物１１．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、（11）を加え、冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。

［処方例４］美容液
（１）精製水２７．４５(質量％)
（２）グリセリン１０．０
（３）ショ糖脂肪酸エステル１．３
（４）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液）１７．５
（５）アルギン酸ナトリウム(１質量％水溶液) １５．０
（６）モノラウリン酸ポリグリセリル１．０
（７）マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル３．０
（８）N-ラウロイル-L-グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル）２．０
（９）硬化パーム油２．０
（10）スクワラン（オリーブ由来）１．０
（11）ベヘニルアルコール０．７５
（12）ミツロウ１．０
（13）ホホバ油１．０
（14）１、３−ブチレングリコール１０．０
（15）Ｌ−アルギニン（１０質量％水溶液）２．０
（16）抽出物１５．０
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（14）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、５０℃にて（15）を加える。さらに４０℃まで冷却し、（16）を加え、均一に混合する。

［処方例５］水性ジェル
（１）カルボキシビニルポリマー０．５（質量％）
（２）精製水８６．７
（３）水酸化ナトリウム（１０質量％水溶液）０．５
（４）エタノール１０．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル０．１
（６）香料０．１
（７）抽出物２２．０
（８）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油０．１
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解した（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。

［処方例６］クレンジング料
（１）スクワラン８１．０（質量％）
（２）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル１５．０
（３）精製水３．０
（４）抽出物１１．０
製法：（１）と（２）を均一に溶解する。これに、（３）と（４）を順次加え、均一に混合する。

［処方例７］洗顔フォーム
（１）ステアリン酸１６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸１６．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン２．０
（４）グリセリン２０．０
（５）水酸化ナトリウム７．５
（６）ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン１．０
（７）精製水３６．５
（８）抽出物２１．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却を開始し、４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。

［処方例８］メイクアップベースクリーム
（１）スクワラン１０．０(質量％)
（２）セタノール２．０
（３）グリセリントリ−２−エチルヘキサン酸エステル２．５
（４）親油型モノステアリン酸グリセリル１．０
（５）プロピレングリコール１１．０
（６）ショ糖脂肪酸エステル１．３
（７）精製水６９．４
（８）酸化チタン１．０
（９）ベンガラ０．１
（10）黄酸化鉄０．４
（11）香料０．１
（12）抽出物１１．２
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（10）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。

［処方例９］乳液状ファンデーション
（１）メチルポリシロキサン２．０(質量％)
（２）スクワラン５．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル５．０
（４）セタノール１．０
（５）ポリオキシエチレン(２０Ｅ．Ｏ．)
ソルビタンモノステアリン酸エステル１．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン０．７
（７）１、３−ブチレングリコール８．０
（８）キサンタンガム０．１
（９）パラオキシ安息香酸メチル０．１
（10）精製水５７．４
（11）酸化チタン９．０
（12）タルク７．４
（13）ベンガラ０．５
（14）黄酸化鉄１．１
（15）黒酸化鉄０．１
（16）香料０．１
（17）抽出物２１．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（10）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（11）〜（15）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（16）と（17）の成分を順次加え、均一に混合する。

［処方例１０］油中水型エモリエントクリーム
（１）流動パラフィン３０．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス２．０
（３）ワセリン５．０
（４）ジグリセリンオレイン酸エステル５．０
（５）塩化ナトリウム１．３
（６）塩化カリウム０．１
（７）プロピレングリコール３．０
（８）１、３−ブチレングリコール５．０
（９）パラオキシ安息香酸メチル０．１
（10）抽出物１１．０
（11）精製水４７．４
（12）香料０．１
製法：（５）と（６）を（11）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに（７）〜（10）を（11）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。

［処方例１１］パック
（１）精製水５８．９(質量％)
（２）ポリビニルアルコール１２．０
（３）エタノール１７．０
（４）グリセリン５．０
（５）ポリエチレングリコール（平均分子量１０００）２．０
（６）抽出物２５．０
（７）香料０．１
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却を開始する。４０℃まで冷却し、（６）と（７）を加え、均一に混合する。

［処方例１２］入浴剤
（１）香料０．３(質量％)
（２）抽出物２１．０
（３）炭酸水素ナトリウム５０．０
（４）硫酸ナトリウム４８．７
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。

［処方例１５］飲料
（１）抽出物２８．０(質量％)
（２）エリスリトール１．０
（３）クエン酸０．１
（４）ステビア０．０１
（５）精製水９０．８９
製法：（１）〜（５）を均一に混合する。

Claims

ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する、保湿剤。
ハマベンケイソウ属植物の抽出物を有効成分として含有する、痩身剤。
ハマベンケイソウ属ハマベンケイソウの抽出物を有効成分として含有する、保湿剤。
ハマベンケイソウ属ハマベンケイソウの抽出物を有効成分として含有する、痩身剤。