JP5656348B2 - 保湿剤、抗老化剤、抗酸化剤、免疫賦活剤、美白剤、及び皮膚外用剤、機能性経口組成物 - Google Patents
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Description
ヨツバヒヨドリを乾燥させて粉砕し、サンプル質量の20倍量の50質量%エタノールを加え、室温で撹拌しながら2時間抽出した。得られた抽出液を濾過して不溶物を取り除き、減圧濃縮後、凍結乾燥を行って、エタノール抽出物を得た。
ヨツバヒヨドリを乾燥させて粉砕し、サンプル質量の20倍量の精製水を加え、オートクレーブにより20分間、120℃に加温して抽出した。得られた抽出液から、温度の高い状態を保ちながら吸引濾過により不溶物を取り除いた後、凍結乾燥を行って、熱水抽出物を得た。
超臨界抽出装置に乾燥、粉砕したさせたヨツバヒヨドリを投入し、40℃において15MPaの気圧下で二酸化炭素の超臨界流体を用いて抽出した。抽出物を回収し、超臨界抽出物を得た。
保湿作用の評価は、表1に示すヨツバヒヨドリ抽出物を試料とし、健常人前腕部を用いて行った。各試料を前腕部3×4cm2の範囲に24μLずつ塗布し、塗布前、塗布15分後、30分後、60分後、及び120分後の角質水分量を測定した。角質水分量の測定は、SKICON−200(アイ・ビイ・エス株式会社製)を用い、各塗布部位の5点における角質水分量を測定した。塗布部5点の測定値を平均し、塗布前の角質水分量を1とした相対値で表2に示した。また、精製水をネガティブコントロール、一般的な保湿剤であるグリセリン(0.1%水溶液)をポジティブコントロールとして同様に評価を行った。結果は、表2に示したとおりであり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高い保湿作用が認められた。
ヒト皮膚角化細胞(HaCaT細胞)を1ウェル当たり2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)にウシ胎児血清(FBS)を5質量%添加したものを用いた。24時間後1.2mMCaCl2を含む5質量%FBS添加DMEM培地によって、各濃度に調整した抽出物2を含有するサンプル液に交換しさらに9日間培養した。培地は3日に1回交換した。培養終了後、培養上清を採取し、アルギナーゼ活性促進能の評価を行った。アルギナーゼはアルギニンを加水分解し、オルニチンと尿素を生成する。尿素はウレアーゼによってアンモニアに分解され、アンモニアはペンタシアノニトロシル鉄(III)酸ナトリウム二水和物(ニトロプルシッドナトリウム)存在下でサリチル酸、次亜塩素酸と反応し、インドフェノールが生成する。アルカリ性条件下でインドフェノールの吸収(570nm)を測定し、尿素濃度を求め、アルギナーゼ活性の定量を行った。尿素定量のため、和光純薬社製尿素窒素B−テストワコーを用いて測定を行い、検量線を作成した。また、BCAProteinAssayKitにて、各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量あたりのアルギナーゼ活性促進能を求めた。サンプルを添加しないブランクの値を100とした時の相対値により、アルギナーゼ活性促進能を評価した。結果は、表3に示した通りであり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高いアルギナーゼ活性促進作用が認められた。
正常ヒト真皮繊維芽細胞を1ウェル当り2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。24時間後、0.5重量%FBS添加DMEM培地にて表4に示す濃度になるように抽出物6を添加したサンプル培養液に交換し、さらに3日間培養した。培養上清中に分泌されたヒアルロン酸の定量には、プロテオグリカンを用いた間接ELISA法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し2,2’−アジノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)ジアンモニウム塩(ABTS)及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて405nmの吸光度を測定した。PIERCE社製BCA Protein Assay Kitにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を求めた。試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を100とした相対値にてヒアルロン酸産生促進作用の評価を行った。その結果表4に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高いヒアルロン酸産生促進作用が認められた。
正常ヒト真皮線維芽細胞を1ウェル当り2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には1質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。24時間後、1質量%FBS添加DMEM培地にて表5に示す濃度に調整した抽出物2を含有する培養液に交換し、さらに48時間培養した。次に400μg/mLとなるよう培地にて調整したMTT試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約2時間培養した。最後に2−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、550nmの吸光度を測定した。同時に濁度として650nmの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。線維芽細胞賦活作用は、抽出物2無添加のブランクにおける細胞賦活作用を100とした相対値にて評価を行った。その結果表5に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高いヒト真皮線維芽細胞賦活作用が認められた。
正常ヒト真皮繊維芽細胞を1ウェル当り2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。24時間後、0.5質量%FBS添加DMEM培地にて表6に示す濃度に調整した抽出物2を含有する培養液に交換し、さらに24時間培養した。培養上清中に分泌されたタイプIコラーゲンの定量にはELISA法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し2,2’−アジノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)ジアンモニウム塩(ABTS)及び過酸化水素を添加し反応させた後、405nmの吸光度を測定した。PIERCE社製BCA Protein Assay Kitにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプIコラーゲン産生量を求めた。評価結果は抽出物2無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのタイプIコラーゲン産生量を100とした時の相対値にて評価した。その結果、表6に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高い真皮線維芽細胞コラーゲン産生促進作用が認められた。
ヒト表皮角化細胞HaCaTを1ウェル当り2.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。24時間後、0.5質量%FBS添加DMEM培地にて表7に示す濃度に調整した抽出物3を含有する培養液に交換し、さらに5日間培養した。培養上清中に分泌されたタイプIVラーゲンの定量には、タイプIVラーゲンに対するモノクローナル抗体(認識部位:α2鎖)及びビオチン化ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチELISA法を用い、最後はアビジン化ホースラディッシュペルオキシダーゼに対し3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンを添加し反応させた後、650nmの吸光度を測定した。PIERCE社製BCA Protein Assay Kitにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのIVコラーゲン産生量を求めた。評価結果は、抽出物3無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのタイプIVコラーゲン産生量を100とした時の相対値にて評価した。その結果、表7に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高いヒト表皮角化細胞におけるタイプIVコラーゲン産生促進作用が認められた。
50重量%エタノールによって表8に示した濃度に調整した抽出物2を含有する溶液100μLに、0.2mM 1,1−ジフェニル−2−ピクリルヒドラジル(DPPH)エタノール溶液100 μLを添加し、よく混合した後、室温、暗所にて10分間静置し、DPPHラジカルに由来する516nmの吸光度を測定した。抽出物2無添加時の吸光度を(A)、抽出物2添加時の吸光度を(B)とした時の、DPPHラジカル消去率を次式により算出した。その結果、表8に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高いDPPHラジカル消去作用が認められた。
消去率(%)={1 −(B)/(A)}×100
0.25 mM WST−1及び 1 mM Hypoxanthineを含むHANK’S(+)溶液 75μLに、HANK’S(+)溶液にて表9に示した濃度に調整した抽出物1を含有する溶液25μLを添加した。さらに、Xanthine Oxidase 25μL(0.0075 Units)を添加し、37℃にて15分間反応後、450 nmの吸光度を測定した。抽出物1無添加時の吸光度を(A)、抽出物1添加時の吸光度を(B)とした時、スーパーオキサイドアニオン消去率を次式により算出した。その結果、表9に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高いスーパーオキサイドアニオン消去作用が認められた。
消去率(%)={1 −(B)/(A)}×100
ヒト急性単球白血病細胞株(THP−1)を1ウェル当り5.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には1質量%のFBSを添加したRpswell Park Memorial Institute培地(RPMI)を用いた。24時間後、Phorbol 12−Myristate 13−Acetate(PMA)を20ng/mLとなるように細胞培養液に添加した。さらに24時間後、1質量%FBS添加RPMI培地にて各濃度に調整した抽出物3を含有するサンプル培養液に交換し、48時間培養した。次に生細胞数測定試薬SF(同仁化学研究所)1/10量を添加した1質量%FBS添加RPMI培地を、上清を除いた細胞に添加し、2時間培養した。混合後、450nmの吸光度を測定した。同時に濁度として650nmの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。抽出物3無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を100とした時の相対値にて細胞賦活作用を算出した。その結果表10に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高い免疫細胞賦活作用が認められた。
正常ヒト表皮メラニン細胞を1ウェル当り3.0×104個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはMedium 254Sを用いた。24時間後、Medium 254Sによって表11に示す濃度に調整した抽出物3を含有する培養液に交換し、さらに48時間培養した。次に1質量%Triton−Xを含有するリン酸緩衝液75μLに交換し、細胞を完全に溶解させ、内50μLを粗酵素液として使用した。粗酵素液に基質となる50μLの0.05質量%L−ドーパ含有リン酸緩衝液を加え、37℃で2時間静置した。基質添加直後と反応終了時の405nmの吸光度を測定し、生成されたドーパメラニン量は両測定値の差を次式に導入して求めた。
生成されたドーパメラニン量
={(反応後405nm値−反応前405nm値)−2.166}/5.238
また、PIERCE社製BCA Protein Assay Kitにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量を求めた。評価結果は抽出物3無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量と比較した。表11に示したとおり、ヨツバヒヨドリ抽出物には、高いヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用が認められた。
B16マウスメラノーマ細胞(B16F0細胞)を1ディッシュ当り18000個となるように90mmディッシュに播種した。播種培地には5質量%のウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を用いた。24時間後、5質量%FBS添加DMEM培地にて表12に示した濃度に調整した抽出物7含有培養液に交換し、さらに5日間培養した。培養終了後、トリプシン処理にて細胞をはがし、1.5mLマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記評価基準を基にその黒化状況を肉眼判定した。評価ではネガティブコントロールに5%重量FBS添加DMEM培地、ポジティブコントロールに50mM乳酸ナトリウムを含有する5%重量FBS添加DMEM培地を用いた。これらの肉眼判定結果は判定5及び判定1とし、サンプル判定の指標とした。肉眼判定は下記に示す通り、5段階評価した。また同時に、沈殿物に組織溶解剤(商品名Solvable)を添加して煮沸し、室温に戻して分光光度計(HITACHI製分光光度計U−3010)により500nmの吸光度を測定し、総メラニン量を求めた。その結果、表12に示したとおりヨツバヒヨドリ抽出物には、高いメラニン産生抑制作用が認められた。
評価基準
判定1:ポジティブコントロールと同程度(ほぼ白色)
判定2:ポジティブコントロールより僅かに黒い(薄い褐色)
判定3:ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間(褐色)
判定4:ネガティブコントロールより僅かに白い(黒褐色)
判定5:ネガティブコントロールと同程度(ほぼ黒色)
(1)スクワラン 10.0(質量%)
(2)メチルフェニルポリシロキサン 4.0
(3)水素添加パーム核油 0.5
(4)水素添加大豆リン脂質 0.1
(5)モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン(20E.O.) 1.3
(6)モノステアリン酸ソルビタン 1.0
(7)グリセリン 4.0
(8)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(9)カルボキシビニルポリマー 0.15
(10)精製水 53.85
(11)アルギニン(1質量%水溶液) 20.0
(12)抽出物4 5.0
製法:(1)〜(6)の油相成分を80℃にて加熱溶解する。一方(7)〜(10)の水相成分を80℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、(11)と(12)を順次加え、均一に混合する。
(1)エタノール 15.0(質量%)
(2)ポリオキシエチレン(40E.O.)硬化ヒマシ油 0.3
(3)香料 0.1
(4)精製水 78.38
(5)クエン酸 0.02
(6)クエン酸ナトリウム 0.1
(7)グリセリン 1.0
(8)ヒドロキシエチルセルロース 0.1
(9)抽出物4 5.0
製法:(1)に(2)及び(3)を溶解する。溶解後、(4)〜(8)を順次添加した後、十分に攪拌し、(9)を加え、均一に混合する。
(1)スクワラン 10.0(質量%)
(2)ステアリン酸 2.0
(3)水素添加パーム核油 0.5
(4)水素添加大豆リン脂質 0.1
(5)セタノール 3.6
(6)親油型モノステアリン酸グリセリン 2.0
(7)グリセリン 10.0
(8)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(9)アルギニン(20質量%水溶液) 15.0
(10)精製水 36.7
(11)カルボキシビニルポリマー(1質量%水溶液) 15.0
(12)抽出物1 5.0
製法:(1)〜(6)の油相成分を80℃にて加熱溶解する。一方(7)〜(10)の水相成分を80℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、(11)を加え、冷却を開始し、40℃にて(12)を加え、均一に混合する。
(1)精製水 27.45(質量%)
(2)グリセリン 10.0
(3)ショ糖脂肪酸エステル 1.3
(4)カルボキシビニルポリマー(1質量%水溶液) 17.5
(5)アルギン酸ナトリウム(1質量%水溶液) 15.0
(6)モノラウリン酸ポリグリセリル 1.0
(7)マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル 3.0
(8)N-ラウロイル-L-グルタミン酸
ジ(フィトステリル−2−オクチルドデシル) 2.0
(9)硬化パーム油 2.0
(10)スクワラン(オリーブ由来) 1.0
(11)ベヘニルアルコール 0.75
(12)ミツロウ 1.0
(13)ホホバ油 1.0
(14)1、3−ブチレングリコール 10.0
(15)L−アルギニン(10質量%水溶液) 2.0
(16)抽出物4 5.0
製法:(1)〜(6)の水相成分を混合し、75℃にて加熱溶解する。一方、(7)〜(14)の油相成分を混合し、75℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、50℃にて(15)を加える。さらに40℃まで冷却し、(16)を加え、均一に混合する。
(1)カルボキシビニルポリマー 0.5(質量%)
(2)精製水 78.7
(3)水酸化ナトリウム(10質量%水溶液) 0.5
(4)エタノール 10.0
(5)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(6)香料 0.1
(7)抽出物1 10.0
(8)ポリオキシエチレン(60E.O.)硬化ヒマシ油 0.1
製法:(1)を(2)に加え、均一に攪拌した後、(3)を加える。均一に攪拌した後、(4)に予め溶解した(5)を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた(6)〜(8)を加え、均一に攪拌混合する。
(1)スクワラン 77.0(質量%)
(2)イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル 15.0
(3)精製水 3.0
(4)抽出物4 5.0
製法:(1)と(2)を均一に溶解する。これに、(3)と(4)を順次加え、均一に混合する。
(1)ステアリン酸 16.0(質量%)
(2)ミリスチン酸 16.0
(3)親油型モノステアリン酸グリセリン 2.0
(4)グリセリン 20.0
(5)水酸化ナトリウム 7.5
(6)ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン 1.0
(7)精製水 31.5
(8)抽出物5 6.0
製法:(1)〜(4)の油相成分を80℃にて加熱溶解する。一方(5)〜(7)の水相成分を80℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却を開始し、40℃にて(8)を加え、均一に混合する。
(1)スクワラン 10.2(質量%)
(2)セタノール 2.0
(3)グリセリントリ−2−エチルヘキサン酸エステル 2.5
(4)親油型モノステアリン酸グリセリル 1.0
(5)プロピレングリコール 11.0
(6)ショ糖脂肪酸エステル 1.3
(7)精製水 65.4
(8)酸化チタン 1.0
(9)ベンガラ 0.1
(10)黄酸化鉄 0.4
(11)香料 0.1
(12)抽出物2 5.0
製法:(1)〜(4)の油相成分を混合し、75℃にて加熱溶解する。一方、(5)〜(7)の水相成分を混合し、75℃にて加熱溶解し、これに(8)〜(10)の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、40℃にて(11)と(12)の成分を加え、均一に混合する。
(1)メチルポリシロキサン 2.0(質量%)
(2)スクワラン 5.0
(3)ミリスチン酸オクチルドデシル 5.0
(4)セタノール 1.0
(5)ポリオキシエチレン(20E.O.)
ソルビタンモノステアリン酸エステル 1.3
(6)モノステアリン酸ソルビタン 0.7
(7)1、3−ブチレングリコール 8.0
(8)キサンタンガム 0.1
(9)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(10)精製水 53.4
(11)酸化チタン 9.0
(12)タルク 7.4
(13)ベンガラ 0.5
(14)黄酸化鉄 1.1
(15)黒酸化鉄 0.1
(16)香料 0.1
(17)抽出物4 5.0
製法:(1)〜(6)の油相成分を混合し、75℃にて加熱溶解する。一方、(7)〜(10)の水相成分を混合し、75℃にて加熱溶解し、これに(11)〜(15)の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。乳化終了後に冷却を開始し、40℃にて(16)と(17)の成分を順次加え、均一に混合する。
(1)流動パラフィン 30.0(質量%)
(2)マイクロクリスタリンワックス 2.0
(3)ワセリン 5.0
(4)ジグリセリンオレイン酸エステル 5.0
(5)塩化ナトリウム 1.3
(6)塩化カリウム 0.1
(7)プロピレングリコール 3.0
(8)1、3−ブチレングリコール 5.0
(9)パラオキシ安息香酸メチル 0.1
(10)抽出物5 5.0
(11)精製水 43.4
(12)香料 0.1
製法:(5)と(6)を(11)の一部に溶解して50℃とし、50℃に加熱した(4)に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、70℃にて加熱溶解した(1)〜(3)に均一に分散する。これに(7)〜(10)を(11)の残部に70℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、40℃にて(12)を加え、均一に混合する。
(1)精製水 58.9(質量%)
(2)ポリビニルアルコール 12.0
(3)エタノール 17.0
(4)グリセリン 5.0
(5)ポリエチレングリコール(平均分子量1000) 2.0
(6)抽出物1 5.0
(7)香料 0.1
製法:(2)と(3)を混合し、80℃に加温した後、80℃に加温した(1)に溶解する。均一に溶解した後、(4)と(5)を加え、攪拌しながら冷却を開始する。40℃まで冷却し、(6)と(7)を加え、均一に混合する。
(1)香料 0.3(質量%)
(2)抽出物4 5.0
(3)炭酸水素ナトリウム 46.0
(4)硫酸ナトリウム 48.7
製法:(1)〜(4)を均一に混合する。
(1)抽出物4 8.0(質量%)
(2)エリスリトール 1.0
(3)クエン酸 0.1
(4)ステビア 0.01
(5)精製水 90.89
製法:(1)〜(5)を均一に混合する。
(1)抽出物4 0.30(質量部)
(2)還元麦芽糖水飴 0.53
(3)トウモロコシデンプン 0.15
(4)グリセリン脂肪酸エステル 0.02
製法:(1)〜(3)を篩過して混合し、さらに(4)を添加して混合した。打錠機にて打錠を行い、全量300mgの錠剤を得た。
Claims (1)
- ヨツバヒヨドリ(Eupatorium glehni)の葉若しくは花の、水及び/又はエタノール抽出物を有効成分とする保湿剤。
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