CN101195839A - 白芨多糖胶精制工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于天然植物多糖胶深加工技术领域，公开了白芨多糖胶精制工艺。该工艺步骤是将白芨粗多糖用热醇洗涤，加水复溶，加入蛋白酶酶解，灭酶，离心，收集上清液，加入乙醇醇沉，再用复合溶液洗涤，过滤，烘干，贮存。该工艺制得的产品纯度高，有良好的溶解性能，拓宽了产品应用范围；该工艺用酶量小，原料易得，成本低，易于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于天然植物多糖胶深加工技术领域，涉及一种白芨多糖胶精制工艺，特别是涉及白芨多糖胶生物酶法精制和溶剂处理相结合的精制纯化工艺。
背景技术
白芨[Blettila striata(Thunb.)Reichb.f.]兰科白芨属植物，又称小白芨、莲及草、雪如末等，是药食两用传统中药资源，千百年来一直作为传统中药使用，其主要功能是敛疮止血、补肺、消肿生肌等。白芨鳞茎中大量水溶液性多糖，其化学成分是葡萄甘露聚糖，是白芨胶(或称白芨多糖胶)的主要功能性成分。其地下鳞茎含有30％以上的葡甘聚糖，其甘露糖和葡萄糖两种糖基的比例大约为4∶1，平均分子量在280万，白芨多糖胶是一种优良的天然增稠剂，是安全性较高的医药原料、性能卓越的药用辅料和有相当发展前景的生物医学材料。此外，白芨多糖胶还可应用于日化产品中，替代化学增稠剂，并具有减少刺激性、保护皮肤、延缓衰老等功能。白芨多糖的提取和精制工艺主要有水提法，乙醇一水提法，连续逆流提取法，这些方法提取所得产品得率一般不高，且产品的纯度较低，粗白芨多糖纯度一般低于80％，色泽略黄，且带有药味，作为食品添加剂或医药材料还需要进行精制。大大限制了白芨多糖胶在食品和医药上的应用。
白芨作为我国的特有药食两用植物资源，研究条件得天独厚，但迄今为止，国内有关白芨多糖纯化精制的文献不是很多，更值得一提的是，尚没有对白芨多糖中非糖类杂质的系统研究报道，国外对于白芨多糖胶的研究可谓凤毛麟角，几乎没有涉足者。虽然文献报道和相关研究不甚丰富，对于白芨葡甘聚糖纯化带来了极大的不便和困难，同时也为研究白芨纯化技术的必要性提供了契机。在实践上，有人采用单纯采用乙醇多次沉淀、乙醚和丙酮类有机溶剂洗涤等措施均能够显著提高其纯度，而活性碳、高岭土等介质吸附操作效果较差。但单独所使用复合溶剂洗涤沉淀法，有机溶剂消耗量大，成本较高，进一步提高纯度要依靠层析技术、酶法精制或特殊化学处理手段来实现。
白芨鳞茎多糖直接使用时感官不良，一般提取工艺仅能够生产75％左右的粗多糖，因带有较为典型的药味，且颜色偏深，在食品加工中受到限制，提高白芨葡甘聚糖的纯度能够较好地解决上述问题，但因白芨多糖胶溶液粘度大，且色素、多酚、蛋白等杂质与多糖呈键合状态，一般精制手段难以实现。粗白芨多糖在脱水干燥后，溶解性能降低，尤其是采用醇沉淀-干燥工艺，速溶问题是一个很大的缺陷。其原因除了上面提高的杂质高外，还与多糖胶较高的分子量有关。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物酶法精制和溶剂处理相结合的白芨多糖胶精制纯化工艺。
本发明技术方案的理论基础：(1)侧链基团对杂质的缠绕作用较大，通过蛋白酶进行修建；(2)蛋白酶可以起到部分脱除糖蛋白作用，在去除蛋白基团的同时，也使结合到蛋白上的部分杂质予以去除；(3)通过复合溶剂处理，使脂类、色素类成分予以清除。课题的技术难点是酶法修剪，体现在酶的筛选、条件优化。
未经处理的白芨多糖，分子量可达到200万以上，其溶解需要充分的溶涨后才能较为彻底。本发明通过对白芨多糖分子的适度降解，来提高溶解性能，其适度降解作用主要体现在2个方面，一是对蒂合大分子进行酶法剪切，切除分子间联接的蛋白，二是对主链进行调整。在此基础上，结合溶剂的分步沉淀获得组分相对均一的多糖组分，提高产品的速溶性能，拓宽应用范围。
白芨胶的主要成分为多糖(特别是葡萄甘露聚糖)，故本发明所称白芨多糖胶、白芨多糖、白芨葡甘聚糖均可代表白芨胶。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
白芨多糖胶精制工艺，该工艺包括下列步骤：
a.白芨粗多糖加入60-70％乙醇65-75℃洗涤，冷却，过滤，95～98％乙醇洗涤三次，真空抽滤；
b.按25～30ml水/g洗涤后的衡干重白芨粗多糖的比例加入水复溶；
c.加入蛋白酶，根据蛋白酶适宜pH及温度条件下酶解15-25h；
d.灭酶，离心，收集上清液，加入3-5倍上清液体积的乙醇，醇沉3-5h；
e.洗涤，95-98％乙醇洗涤2-3次，丙酮洗涤2-3次，乙醚洗涤2-3次，真空抽滤；
f.烘干，贮存。
所述白芨多糖胶精制工艺，其步骤a中白芨粗多糖与60-70％乙醇比例按重量体积比(g/ml)为1∶3～5。
所述白芨多糖胶精制工艺，其中蛋白酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶中的一种或多种。
所述白芨多糖胶精制工艺，其步骤c中加入的乙醇浓度为95～98％。
工艺过程详述如下：
白芨粗多糖预处理：白芨粗多糖颜色较深，具有典型的中药味，其中含有还原糖、蛋白质、色素等杂质，所以需要对连续逆流提取的白芨多糖用热醇洗涤以初步脱色除杂。称取白芨粗提物，按物料重量体积比1∶3～5加入浓度为70％的乙醇溶液(例：白芨多糖胶100g，70％乙醇300～500ml，下同)，设定水浴温度至70℃，加热0.5～1.5h，冷却，真空抽滤，用浓度为95％的乙醇洗涤三次。
白芨多糖的复溶：白芨粗多糖胶液粘度大，溶解性不佳，工业生产上需要确定其最佳溶剂用量，以节约成本。本实验选择溶剂水加入量梯度分别为10ml，20ml，30ml/g衡干重白芨粗多糖。10ml水加入量的水成白芨溶液粘度偏大，比较粘稠，转移困难。20ml水成溶液粘度适中，30ml溶液比较稀，成水状，可随意转移，综合考虑白芨胶溶液的溶解特性，选取25～30ml溶剂水/g洗涤后的衡干重白芨粗多糖。
最佳酶解工艺的确定：大多多糖的提取是以水溶液为主，加入酸、碱、盐或者酶等物质，加入乙醇、季铵盐等阳离子表面活性剂，使多糖沉淀出来。由于白芨粗多糖中主要杂质为蛋白质，通常除蛋白的方法有：酶解法、sevag法，三氯乙酸法、盐酸法。再经透析除去小分子，达到基本纯化的目的。
目前的分级方法有：1.沉淀法包括乙醇沉淀，含盐溶液沉淀法，季铵盐沉淀法；2.电泳法；3.离子交换，凝胶过滤。考虑到白芨葡甘聚糖胶作为药食兼用的添加剂的产品应具有安全性高的特点，及保持并提高其高粘度的理化特性，本发明选择温和的酶法工艺进行蛋白脱除。
蛋白酶水解：把白芨多糖胶置于200ml锥形瓶中，按30ml/g干重加入溶剂水，不断搅拌，使之溶解，待其完全溶解后，分别参照各酶的最佳作用条件，设定水浴锅温度，并调整pH到最佳作用范围内。从加入蛋白酶开始计时，酶解15-25h。
离心醇沉：蛋白酶水解后的白芨胶水成液，在水浴中70～80℃灭酶10min，用高速冷冻离心机6000r/min，离心15min。倾出上清液，加入3～5倍上清液体积的95％乙醇搅拌，醇沉4h。
真空抽滤：真空抽滤后的白芨胶用95％的乙醇洗涤2次，丙酮洗涤3次，乙醚洗涤3次，滤干。
烘干贮存：滤干后的白芨胶其内含有一定的水分，为便于保存期间，需要在烘箱中进行干燥处理。设定烘箱温度为60℃，烘2h。
本发明的有益效果：
处理后白芨葡甘聚糖的粘度基本上不受影响，具有相当高的粘度。准确称取干重为4g的白芨葡甘聚糖溶于200mL的蒸馏水中配制浓度为2％白芨葡甘聚糖溶液。用内径为1mm毛细管粘度计，两次测定的时间分别为4min22sec85，4min19sec52。粘度平均值为17.55mm2/s。
本法制得的产品纯度高，有良好的溶解性能成膜性能优于羧甲基纤维素钠和聚乙烯醇，在食品添加剂工业上是一种优良的天然增稠剂、乳化剂和稳定剂。溶解性能好，解决白芨粗多糖直接使用溶解性不佳现象，提高了增溶性能，拓宽了产品应用范围，可以形成高浓度、低粘度型胶液，有突出的抗盐和抗酸性能，受pH、无机离子、温度等因素影响较少，适合复杂组成的食品加工；具有多重功能和良好的复配特性；安全性高，生物相容性好。用酶量小，原料易得，价格低廉，为白芨胶的生物化学方法精制纯化找到了一条商业化的的新途径，对于白芨胶的深度纯化加工以及大规模工业化生产，拓展其作为特色资源在现代食品加工及医药领域的应用范围具有极为深远的意义。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1：中性蛋白酶处理白芨葡甘聚糖胶工艺
称取白芨粗多糖，按物料重量体积比1∶4加入浓度为70％的乙醇溶液(即白芨粗多糖100g，70％乙醇400ml)，设定水浴温度至70℃，加热1h，然后冷却。真空抽滤，用浓度为95％的乙醇洗涤三次。准确称取乙醇洗涤后衡干重白芨粗多糖样品，按30ml水/g洗涤后衡干重白芨粗多糖的比例加入水，置于50℃水浴中，不断搅拌，使之充分溶解，按洗涤后衡干重白芨粗多糖重量的0.5％加入中性蛋白酶，调节pH6.5-7.0，50℃完全水解20h。酶解液70℃灭酶处理10min，用高速冷冻离心机6000r/min，离心15min。倾出上清液，加入4倍上清液体积的95％乙醇，醇沉4h后真空抽滤，真空抽滤后的白芨胶用纯度为95％的乙醇洗涤2次，丙酮洗涤3次，乙醚洗涤3次，滤干。60℃烘干2h后贮存。
样品多糖含量的测定：
样品溶液的配制：准确称取未纯化白芨粗多糖及纯化后的白芨多糖胶干燥品0.125g充分搅拌溶解，定容至250ml；用移液管取10ml，准确定容至100ml(此时溶液浓度在50ppm左右)，备用。
| 管号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 标准糖/ml | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| 水/ml | 1 | 0.9 | 0.8 | 0.7 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
以试剂空白为参比样，吸取样品液各1ml，按照上述步骤操作，测定吸光值，以标准曲线计算多糖纯度。多糖含量
注：c为测定样品溶液中的糖含量，N为原样品溶液的稀释倍数，V为原样品溶液的体积。
测定的白芨粗多糖和处理后的白芨多糖吸光度分别为：0.146，0.170。
根据公式计算出未纯化及纯化的白芨多糖的含量分别为：85％，97.8％。
纯化多糖的粘度测定：准确称取干重为4g的纯化后的白芨多糖溶于200mL的蒸馏水中配制浓度为2％白芨多糖溶液。用内径为1mm毛细管粘度计运动粘度为17.55mm2/s。
精制后白芨葡甘聚糖纯度(97.8％)大于95％；黏均分子量在10～20×104；2％胶液粘度＜100cp；稳定分散pH范围3.5～8.5，抗盐粘度大于2.0％；其他指标达均到食品添加剂通用标准规定，弥补目前食品添加剂中低分子量、抗酸、抗盐天然增稠剂的不足。
实施例2-4
所用蛋白酶见表1，工艺流程及其他参数同实施例1。
表1
| 酶种类 | 最适温度(℃) | pH范围 | 建议用量(％) | |
| 实施例2 | 木瓜蛋白酶 | 55 | 5.5±0.5 | 0.2 |
| 实施例3 | 碱性蛋白酶 | 65 | 7.0-8.0 | 0.6 |
| 实施例4 | 复合蛋白酶 | 48 | 8.0±0.5 | 0.15 |
Claims (4)
1.白芨多糖胶精制工艺，其特征于该工艺包括下列步骤：
a.白芨粗多糖加入60-70％乙醇65-75℃洗涤，冷却，过滤，95～98％乙醇洗涤三次，真空抽滤；
b.按25～30ml水/g洗涤后的衡干重白芨粗多糖的比例加入水复溶；
c.加入蛋白酶，根据蛋白酶适宜pH及温度条件下酶解15-25h；
d.灭酶，离心，收集上清液，加入3-5倍上清液体积的乙醇，醇沉3-5h；
e.洗涤，95-98％乙醇洗涤2-3次，丙酮洗涤2-3次，乙醚洗涤2-3次，真空抽滤；
f.烘干，贮存。
2.根据权利要求1所述白芨多糖胶精制工艺，其特征在于步骤a中白芨粗多糖与60-70％乙醇比例按重量体积比(g/ml)为1∶3～5。
3.根据权利要求1所述白芨多糖胶精制工艺，其特征在于蛋白酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述白芨多糖胶精制工艺，其特征在于步骤c中加入的乙醇浓度为95～98％。
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