JP2024505861A - オリゴガラクツロン酸多糖、複合体及びその調製方法並びにその使用 - Google Patents

オリゴガラクツロン酸多糖、複合体及びその調製方法並びにその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、オリゴガラクツロン酸多糖、複合体、及びその調製方法、並びにその使用を提供する。本発明は、前処理して安定な水溶性ペクチンゲルを得る工程１と、アルカリ加水分解-マイクロ波法で処理する工程２と、脱メトキシ基化処理を行う工程３と、限外濾過膜で精製する工程４とを含むホモガラクツロナン多糖の調製方法を提供する。本発明は、さらにこの多糖類を用いた複合体及びその調製方法並びにその使用を提供する。本発明に係る複合体は医療効果に優れていて、しかもその調製方法が簡単で、収率が高く、低コストである。【選択図】図３

Description

本出願は、２０２１年９月８日に中国国家知識産権局へ提出された、出願番号が２０２１１１０５０１３４．０であり、発明の名称が「ホモガラクツロナン多糖、複合体及びその調製方法並びにその使用」である中国特許出願に基づいた優先権を主張し、その内容全体が援用により本明細書に組み込まれる。
本発明は多糖類の分野に関し、特にホモガラクツロナン多糖、複合体及びその調製方法並びにその使用に関する。
オリゴガラクツロン酸多糖（Ｈｏｍｏｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｎ,ＨＧ）は、リンゴの滓、ヒマワリの花托（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）、柑橘類の皮、レモンの皮などを原料として作製された「変性シトラスペクチン」（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｉｔｒｕｓ ｐｅｃｔｉｎ，ＭＣＰ）から抽出されたペクチン多糖であり、加水分解されて低エステル化されると、分子量がより小さくて分岐鎖がない繊維になる。その繊維は、化学成分が均一で溶けやすく、経口服用されやすい。
低分子シトラスペクチン（ＬＣＰ）は、米国サントレー社が柑橘類の皮を原料として製造した「変性シトラスペクチン」に相次ぐ次世代製品であり、化学成分が不安定な混合物であり、その分子量が１０ｋＤａ～２０ｋＤａにわたり、エステル化度が１０％～２５％の範囲である。低分子シトラスペクチンＬＣＰは、ラムガラクツロナンＩ(Ｒｈａｍｎｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｎ Ｉ，ＲＧＩ)、ラムガラクツロナンＩＩ(Ｒｈａｍｎｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｎ ＩＩ，ＲＧＩＩ)、ホモガラクツロナン(Ｈｏｍｏｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｎ，ＨＧ)およびキシロガラクツロナン(Ｘｙｌｏｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｎ，ＸＧ)、アラビナン（Ａｒａｂｉｎａｎ）、アラビノガラクタンＩ、およびアラビノガラクタンＩＩなどの糖鎖を含む、さまざまな多糖類の混合物である。
従来の文献には、ガレクチン(Ｇａｌｅｃｔｉｎ-３)が血液中の腫瘍細胞間の凝集、腫瘍細胞とマトリックスとの間の識別及び接着を直接媒介できることが報告された。また、Ｇａｌｅｃｔｉｎ-３は、さまざまな高転移性腫瘍細胞により高発現され、Ｇａｌｅｃｔｉｎ-３の高発現が原発腫瘍でも転移性腫瘍病変でも検出され、その発現の増加が腫瘍の増殖や転移と正の相関を示し、特定の腫瘍悪性腫瘍に対する診断マーカーとして使用される可能性があることが確認された。したがって、Ｇａｌｅｃｔｉｎ-３で媒介される接着・凝集作用を阻害またはブロックすることによって、癌転移の治療・制御を図る可能性があると考えられている。
ＭＣＰは、Ｇａｌｅｃｔｉｎ-３の高親和性リガンドであり、体内のＧａｌｅｃｔｉｎ-３リガンドに対して競合阻害する作用がある。Ｐｌａｔｔら(Ｐｌａｔｔ Ｄ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｕｎｇ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ of Ｂ１６-Ｆ１ ｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｉｔｒｕｓ ｐｅｃｔｉｎ[Ｊ].ＪＮＣＩ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ,１９９２,８４(６)：４３８)によるインビトロでの細胞凝集試験及び細胞接着試験では、ＭＣＰが細胞表面でのＧａｌｅｃｔｉｎ-３を阻害することで細胞間の相互識別及び接着機能を抑制し得ることが確認された。ＭＣＰが一定の濃度に達すると、腫瘍細胞表面でのＧａｌｅｃｔｉｎ-３はほぼＭＣＰに結合して阻害されるので、細胞間の相互識別や凝集がブロックされることが可能になる。幾つかの動物試験によると、ＭＣＰが腫瘍の増殖や転移を効果的に抑制できることが確認された。
本特許出願に記載されているオリゴガラクツロン酸多糖は酸化ストレスや慢性炎症を媒介する炎症因子Ｇａｌｅｃｔｉｎ-３や免疫細胞ＭＤＳＣに対して、インビトロでＭＤＳＣの増殖に拮抗し、インビボで脾臓内でのＭＤＳＣの蓄積を抑制し、全身性慢性炎症を軽減する作用を持つことについて、本発明の出願前に一切開示も報告もなかった。
本発明は、医薬品、食品またはヘルスケア製品として、Ｇａｌｅｃｔｉｎ-３関連のＭＤＳＣ細胞の分化や凝集、ＭＤＳＣに制御される下流Ｔ細胞や好中球の割合変化及び機能変化、ならびにそれによって誘発される全身性の酸化ストレス、慢性炎症、フリーラジカル損傷及び早期老化疾患を解消するために用いられるオリゴガラクツロン酸多糖の用途、を提供することを目的とする。オリゴガラクツロン酸多糖は、化学構造式が次のとおりである。
本発明の発明者らは、化合物ＨＧが、ＭＤＳＣ細胞表面上のＧａｌｅｃｔｉｎ-３リガンドに拮抗することによって、インビトロでＭＤＳＣ細胞の増殖に拮抗し、インビボで脾臓内でのＭＤＳＣの蓄積を抑制する役割を発揮し、ＭＤＳＣによって誘発される酸化ストレス、慢性炎症、フリーラジカル損傷及び早期老化疾患のコントロールを実現できることを見い出した。このような化合物は、単独で使用される場合、その自体が人体に顕著な毒性や副作用を生じない。オリゴガラクツロン酸多糖は、プレバイオティクスとして、腸内のプロバイオティクスに栄養を与えたり、糖や脂質の代謝調節を支えたりする役割を持っている。従来の文献には、オリゴガラクツロン酸多糖及びその誘導体に関する報告が発見されなかった。
上記の課題を解決するために、本発明は、抗炎症作用を有するオリゴガラクツロン酸多糖及びその調製方法並びにその使用を提供することを目的とする。
上記の目的を達成するために、本発明は、以下の工程：
(１)アルカリ分解-マイクロ波法による前処理、
(２)酵素法/酵母発酵法による分解、
(３)孔径が１～１０ｎｍであり、０．０５～０．５ＭＰａの低差圧を維持しながら高フラックス抽出を維持し、カットオフ分子量が１０３～１０４である限外濾過膜による高度抽出、
（４）低温で乾燥させ、精製されたオリゴガラクツロン酸多糖を得ることを含むオリゴガラクツロン酸多糖の調製方法を提供する。
本発明は、分子量が３ｋＤａ～７ｋＤａであり、エステル化度が５％～１５％であるオリゴガラクツロン酸多糖６１０～７１０重量部と、オウギ２５～３５重量部と、炒りサンザシ５～２５重量部と、赤いナツメ５～２５重量部と、チンピ６～２０重量部とを含むオリゴガラクツロン酸多糖の複合体を提供する。
好ましい一実施形態において、前記オリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、分子量が３ｋＤａ～７ｋＤａであり、エステル化度が５％～１５％であるオリゴガラクツロン酸多糖６２０～６４０重量部と、オウギ２０～３０重量部と、炒りサンザシ５～１５重量部と、赤いナツメ５～１５重量部と、チンピ６～１５重量部とを含む。
好ましい一実施形態において、本発明は、オリゴガラクツロン酸多糖６２５重量部と、オウギ２５重量部と、炒りサンザシ１０重量部と、赤いナツメ１０重量部と、チンピ８重量部とを含む、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体を提供する。
前記オリゴガラクツロン酸多糖中のガラクツロン酸は、ＨＧの電荷、酸性アルカリ性、溶解性、粘度などの特性に影響を与え、しかも体内の吸収や分布などの薬学的特性にも影響を与えることができる。エステル化度が高いほど、溶解度が低くなる。エステル化度が低くなると、オリゴガラクツロン酸多糖の生体利用率の向上に寄与する。
また、本発明は、オレンジの皮を前処理して安定な水溶性ペクチンゲルを得る工程１と；ｐＨを１２．０～１３．０に制御しながら、８０～１００°０までマイクロ波で加熱する条件下で、前記安定な水溶性ペクチンゲルに水酸化ナトリウムを加えて、結合切断水溶性ペクチンゲルを形成するアルカリ加水分解－マイクロ波法による処理の工程２と；前記結合切断水溶性ペクチンゲルに対して脱メトキシ基化処理を行い、粗製脱メトキシ基化水溶性ペクチンゲルを得る脱メトキシ基化処理の工程３と；孔径が１～１０ｎｍであり、０．０５～０．５ＭＰａの低差圧を維持しながら高フラックスの抽出を保持し、カットオフ分子量が１０３～１０４である限外濾過膜を使用して高度抽出を行う限外濾過膜精製の工程４とを含む、オリゴガラクツロン酸多糖の調製方法を提供する。
好ましい一実施形態において、工程３において、前記脱メトキシ基化処理は、具体的に、凍結・乾燥・濃縮を経て、粗製ペクチンの濃度が１０～２０ｇ／Ｌとなるように調整し、ＮａＯＨを加えてｐＨを９～１０に維持しながら、４℃で８～４８時間反応させて脱メチル化を行い、その後に１０％の氷酢酸を使用して酸性度を調整し、反応を終了させることにより行われる。好ましい一実施形態においては、工程３の後に、前記粗製脱メトキシ基化水溶性ペクチンゲルに対して粗抽出処理を行い、また粗抽出処理後のホモガラクツロン酸の含有量が７０％を超える場合には、酵素分解処理を行うが、ホモガラクツロン酸の含有量が７０％未満である場合には、酵母発酵処理を行う。好ましい一実施形態においては、工程４の後に、減圧下での回転蒸発濃縮、低温下での乾燥処理がさらに含まれる。
本発明の好ましい実施形態において、任意選択的に、前記酵素分解処理には、まず、等電点法による脱タンパク質を行い、酢酸緩衝液のｐＨ値を４．５に調整し、ペクチンの最終濃度が２～５ｗｔ％となるように調整し；また、リアーゼ（ＰＬ、酵素活性が３２Ｕ/ｇ）、特異的エンドポリガラクツロナーゼ (Ｅｎｄｏ-ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅｓ,ｅｎｄｏ-ＰＧ,Ｅ.Ｃ.３.２.１.１５、４２１２Ｕ/ｇ)、ペクチンエステラーゼ (ＰＥ,Ｅ.Ｃ.３.１.１.１１、６６．７Ｕ/ｇ)及びプロトペクチナーゼを含む固形化ペクチナーゼを加え、ｐＨを３．０～６．０に制御し、４５°５（最大６０°０）で６０～９０分間維持する。また、本発明の好ましい実施形態において、任意選択的に、前記酵母発酵処理には、２ｗｔ％のスクロース溶液に酒醸用造活性乾酵母を加えて、均一に撹拌し、２５～３０°５で２～４時間置いたままで活性化させ、そして、１～５ｗｔ％の活性化させた酵母を濃度が２～５ｗｔ％のペクチン水溶液に加えて、３０°０で２４～４８時間発酵させる。
本発明に係る前記オリゴガラクツロン酸多糖は、ガラクツロン酸の含有量が９３～９８％であり、エステル化度が１２～１４％である。
本発明では、オリゴガラクツロン酸多糖が抗慢性炎症および白血球増加の効果を有することを見い出した上で、伝統的な中国漢方医薬の理論を基盤とし、脾気虚弱、営気や衛気に効くようないくつかの生薬を配合し、疾患を鑑別・治療する過程中に、分量や種類の加減を重ねて調合をアレンジすることによって、消化促進、抗炎症、免疫力向上など総合的な作用を有する前記方剤を完成することに至った。
オリゴガラクツロン酸多糖は、免疫細胞表面のガレクチン（Ｇａｌｅｃｔｉｎ）ファミリーリガンドに拮抗することによって、ＭＤＳＣ細胞、Ｔ細胞、好中球の機能調節を発揮し、ＭＤＳＣ細胞を中心とした上下流の免疫細胞の総合的な作用によって誘発された慢性炎症、全身性の炎症に対する拮抗作用を実現することができる。このような化合物は、免疫調節機能を持っている一方、白血球を増加させる機能も持っているため、化学療法における血液毒性を軽減することができ、かつ単独で使用しても人体に顕著な毒性や副作用はない。
本発明に使用されるオリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、君臣佐使という中国漢方医薬の理論に基づいて配合されたものであって、抗菌作用や抗炎症作用を発揮する従来の漢方薬とは異なり、性質も味も寒涼性ではなく、「攻」の役目を取らずに、「臣薬」として核心成分であるＨＧを補助する役割を果たし、それによって脾胃の働きを高めて気を補い、これによる抗慢性炎症の機能をサポートし、身体全体の機能を強化し、ＨＧによる抗炎症や抗酸化ストレス効果を高めることが期待できる。
ＭＣＰ/ＬＣＰは主として、体内の重金属の除去や腫瘍転移の制御などに対して機能しており、ＭＤＳＣやＴｒｅｇなどの炎症性サイトカインＧａｌｅｃｔｉｎの酸化ストレスや慢性炎症反応に対するものではなく、ＭＣＰ/ＬＣＰが化学治療マウスの白血球に対する増加効果を有するという報告もない。ＨＧに漢方薬のオウギ、サンザシ、赤ナツメ、チンピを配合することは、その抗慢性炎症効果を高め、補気、脾の健全、湿気取りなどの観点からＨＧの効能を高め、１＋１>２という相乗効果を実現するためである。それに対して、漢方薬だけで抗炎症や抗酸化ストレスの目的を達成しようとする場合は、中国漢方医学の理論に従い、性質も味も寒冷性で、主に「攻」と「殺」の役目をもつ生薬を配合する必要になるため、脾胃の失調や気血の不足などの多くの副作用が起きる恐れがある。そこで、本発明では、中国漢方医学の理論に基づいて、ＨＧを「君薬」とし、サンザシ、赤ナツメ、チンピを「臣薬」とし、これら３つの生薬による脾胃の改善、補気、脾の健全、湿気取りを働かせることによって、ＨＧによる抗炎症効果を高めるようにした。
オウギは、臨床的に使用量が少量であり、３０～６０ｇ/日の用量で単独で使用され、粉末にして直接服用されてもよく、水で煮詰めた後エキスペーストとすることもあり、血圧の上昇、白血球の生成、抗炎症作用を明らかに有するが、この場合は、その益気固表や利尿消腫の効果が捨てられている。オウギは、ＨＧの補佐臣薬とすれば、経口利用性の向上を図ることができ、ただし、ＨＧによる炎症細胞の拮抗作用を高めることではなく、ＨＧの欠点を補うという目的で使用されている。
漢方薬複合物において、オウギは主成分であり、補助薬である赤ナツメは脾臓を健全にし、気血を補い、他の生薬の機能を調節し、気と血のバランスを取らせるために配合されている。サンザシは、活血や血行を良くし、食欲増進や消化を良くし、気の巡りを良くするために用いられ、主に食欲促進、気の巡りや活血を良くするために配合されている。生サンザシは、ビタミンＣやフラボノイドも豊富に含有するため、西洋医学の理論から活血や血管拡張のメカニズムが裏付けられており、オウギの主な機能の強化、炎症の抵抗、白血球の増加という役目が図れる。また、チンピによれば、気の巡りを良くし、気機の疎通を促進し、他の生薬の効用メカニズムを強化し、脾胃停滞や食欲不振などの問題を解決することができる。
このように、チンピは気の巡りを良くし、サンザシは血行を促進し、赤ナツメは血を補い、オウギは気を補うようにそれぞれの役割を利用することにより、ＨＧの吸収性をより効果的に促進し、体内でのＨＧの働き効率を向上させるのに役立つ。
任意選択的に、このオリゴガラクツロン酸多糖の複合体において、オリゴガラクツロン酸多糖の使用量は、重量部として、６１０部、６２０部、６３０部、６４０部、６５０部、６６０部、６７０部、６８０部、６９０部、７００部、７１０部および６１０～７１０ 部のうちの任意値であってもよく;オウギの使用量は、２５部、３０部、３５部および２５～３５部のうちの任意値であってもよく; 炒りサンザシの使用量は、５部、６部、７部、８部、９部、１０部、１１部、１２部、１３部、１４部、１５部、１６部、１７部、１８部、１９部、２０部、２１部、２２部、２３部、２４部、２５部、および５～２５部のうちの任意値であってもよく；赤ナツメの使用量は、５部、６部、７部、８部、９部、１０部、１１部、１２部、１３部、１４部、１５部、１６部、１７部、１８部、１９部、２０部、２１部、２２部、２３部、２４部、２５部および５～２５部のうちの任意値であってもよく；チンピの使用量は、６部、７部、８部、９部、１０部、１１部、１２部、１３部、１４部、１５部、１６部、１７部、１８部、１９部、２０部および６～２０部のうちの任意値であってもよい。
前記赤ナツメは、種を取り除きスライスして得られた赤ナツメのスライスであることが好ましい。
また、本発明は、
オウギ、炒りサンザシ、赤いナツメ、チンピを前処理してから水に浸漬させた後、３０～６０分間煮詰め、ろ過することによりエキスペーストを得る工程と、
前記エキスペーストとオリゴガラクツロン酸多糖とを混合して、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体を得る工程とを含む、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の調製方法を提供する。
前記前処理は、順番に行われた洗浄、超音波粉砕、篩い分けを含むことが好ましい。
前記浸漬は、固液体積比が１：５～１５であり、浸漬時間が２０～６０分であることが好ましい。
また、前記浸漬は、任意選択的に固液体積比が１：５、１：１０、１：１５、および１：５～１５のうちの任意値であってもよく、時間が２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、および２０～６０分のうちの任意値であってもよい。
前記煮詰めの時間は３０～９０分であることが好ましい。
また、前記煮詰めの時間は、任意選択的に３０分、４０分、５０分、６０分、７０分、８０分、９０分および３０～９０分のうちの任意値であってもよい。
また、本発明は、慢性炎症関連の疾患を治療するための医薬品、食品またはヘルスケア製品の調製におけるオリゴガラクツロン酸多糖の複合体の使用を提供する。前記慢性炎症関連の疾患には、ＭＤＳＣ関連の慢性炎症、酸化ストレス、フリーラジカル損傷、白血球減少症およびＴ細胞サブセットの不均衡が含まれている。
好ましい一実施形態において、前記オリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、哺乳動物に対して無毒であり（米国ＦＤＡでは変性ペクチンの上限服用量について規制されていない）、しかも哺乳動物の慢性炎症関連の疾患の予防または治療のために直接使用されてもよく、あるいは薬学的に許容される担体等と混合して製剤化されることもできる。
薬学的に許容される担体としては、例えば、担体として一般に使用される様々な有機または無機担体物質が挙げられ、固形製剤に対して賦形剤、潤滑剤、結合剤または崩壊剤を添加することができ、液体製剤に対して溶媒、増溶剤、緩衝剤を添加することができる。必要に応じて、防腐剤、甘味料、着色料、酸化防止剤等の添加剤を添加してもよい。
賦形剤は、乳糖、スクロース、マンニトール、ソルビトール、デンプン、デキストリン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等からなる群より選択されることがある。
潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム等からなる群より選択されることがある。
結合剤は、スクロース、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等からなる群より選択されることがある。
溶媒は、滅菌水、蒸留水、エタノール、プロピレングリコール、コーン油、オリーブ油等からなる群より選択されることがある。
増溶剤は、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、マンニトール、トレハロース、コレステロール、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウム等からなる群より選択されることがある。
緩衝剤は、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液からなる群より選択されることがある。
防腐剤は、クロロブタノール、ベンジルアルコール、ソルビン酸、フェニルエチルアルコール等からなる群より選択されることがある。
甘味料は、サッカリンナトリウム、アスパルテーム、アセスルファムカリウム等からなる群より選択されることがある。
酸化防止剤は、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩等からなる群より選択されることがある。
本発明に係るオリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、乳剤、懸濁剤、エアゾール剤、注射剤等の形態とすることができる。
慢性炎症関連の疾患を治療するための医薬品の調製における前記オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の使用においては、前記オリゴガラクツロン酸多糖の複合製剤が、前記医薬品の全質量に対して５～９５質量％を占めている。
前記オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の用量は、１００～５００ｍｇ／ｋｇ体重/日であり、好ましく１５０～３００ｍｇ／ｋｇ体重/日である。前記オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の服用頻度は、１日１回、１日２回または１日３回である。前記オリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、３日間以上連続して服用されることができ、好ましくは、３日～１００日間連続して服用される。
好ましい一実施形態において、前記オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の用量は、２００～４００ｍｇ／ｋｇ体重/日である。
好ましい一実施形態において、前記オリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、服用頻度が、１日１回、１日２回、１日３回、または１日４回であり、５～８０日間連続して服用されることができる。
従来技術と比較して、本発明は以下の有益な効果を有する。
本発明に係るオリゴガラクツロン酸多糖は、明確な免疫細胞標的を有し、抗炎症因子、抗慢性炎症、抗酸化フリーラジカルの効果を有するとともに、白血球レベルを増加する役割を持っている組成物である。本発明に係るオリゴガラクツロン酸多糖は、ＭＤＳＣ細胞関連の慢性炎症に拮抗することができ、オウギ、炒りサンザシ、赤ナツメ、チンピと相乗的に働き、より優れた抗慢性炎症効果をもっている。健康な方に使用される場合は、酸化ストレス、慢性炎症、フリーラジカル損傷又は早期老化疾患の軽減、サブヘルス状態の軽減が図れる。がん患者に使用される場合は、腫瘍微小環境における免疫抑制効果を解消し、末梢血および腫瘍浸潤リンパ球内のＣＤ８エフェクターＴ細胞の割合を増加させることが図れるため、身体の抗腫瘍免疫力を強化する同時に白血球を増加させ、化学療法における血液毒性を軽減する効果がある。
本発明に係るオリゴガラクツロン酸多糖の複合体の調製方法は、プロセスが簡単で、収率が高く、低コストである。
本発明に係るオリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、医薬品、食品またはヘルスケア製品等に幅広く利用されることができる。
以下、説明されるように、本発明は、以下の技術案を提供する。
１．ペクチンを含む果皮および／または果滓を提供する工程１と、
工程１で得られた原料をアルカリ性水溶液と接触させてアルカリ処理を行い、混合物のｐＨを１１以上に維持して結合切断水溶性ペクチンゲルを得る工程２と、
任意選択的に工程２で得られた結合切断水溶性ペクチンゲルを、ｐＨ９～１１、０～８℃温度下で少なくとも２時間続いて濃縮させた後、ｐＨを６～８の中性付近に調整し、前記結合切断水溶性ペクチンゲルに対して脱メトキシ基化処理を行うことで粗製脱メトキシ基化水溶性ペクチンゲルを得る工程３と、
任意選択的にカチオン性交換樹脂を使用して、前記水溶性ペクチンゲルを粗抽出する工程４と、
高分子量不純物を除去する工程５と、を含み、
工程２において、前記アルカリ処理は、好ましくｐＨが１２～１３であり、好ましく少なくとも３０分間、例えば３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０分間続けられ、
工程３において、前記濃縮は、好ましく凍結乾燥法で行われ、粗製ペクチンの濃度が好ましく少なくとも５ｇ／Ｌ、例えば１０、１５、２０、２５、３０または４０ｇ／Ｌ、具体的に１０～２０ｇ／Ｌの範囲になるまで行われ、好ましくｐＨを９～１０とし、好ましく２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、６０、又は７２時間以上続けられ、
工程４において、前記カチオン性交換樹脂は、例えば、スルホン酸基又はＤＥＡＥ基を持つカチオン性交換樹脂であり、
工程５において、前記高分子量不純物の除去には、好ましくカットオフ分子量が少なくとも１０３～１０４Ｄａである限外濾過膜を使用し、例えば、孔径が１～１０ｎｍであり、０．０５～０．５ＭＰａの低差圧を維持しながら高フラックスの抽出を維持し、カットオフ分子量が１０３～１０４Ｄａである限外濾過膜を使用する、オリゴガラクツロン酸多糖の調製方法。
２．工程２を実施する前に、前記果皮に対して酸処理を行うことで安定な水溶性ペクチンゲルを得ることをさらに含み、
前記酸処理は、好ましくｐＨが５～６で行われ、好ましく１０～６０分間、例えば１０、１５、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７５、９０または１２０分間続けられる、技術案１に記載の方法。
３．工程２のアルカリ処理において、マイクロ波で好ましく少なくとも５０℃、例えば６０、７０、８０、９０または１００℃まで加熱することをさらに含む、技術案１または２に記載の方法。
４．工程２のアルカリ処理を行う前またはその後に、セルラーゼ酵素分解処理を行うことをさらに含み、前記酵素分解処理は、好ましくセルラーゼ１～１０ｍｇ／ｇを添加し、酵素分解温度を室温から４０℃まで、例えば３８℃にした条件下で、少なくとも３０分間、例えば３０、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２０または１５０分間続けられる、技術案１から３のいずれか１項に記載の方法。
５．前記果皮および／または果滓は、柑橘類、ナシ類、ブドウ類、ウリ科、バショウ科の果実またはヒマワリの花托、例えば、タンジェリン、ミカン、オレンジ、キンカン、レモン、ザボン、枳金柑（英名：Ｃｉｔｒｕｍｑｕａｔ、学名：Ｒｕｔａ Ｃｉｔｒｕｍｑｕａｔ Ｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ）、リンゴ、ナシ、ビワ、サンザシ、アンズ、プラム、ウメ、モモ、キウイ、バナナ、ブドウ、スイカ、ヒマワリに由来する、技術案１から４のいずれか１項に記載の方法。
６．工程４で得られた粗抽出物に対しては、該粗抽出物中のホモガラクツロン酸の含有量が７０％以上である場合に酵素分解処理を行い、または粗抽出物中のホモガラクツロン酸の含有量が７０％未満である場合に酵母発酵処理を行うことをさらに含み、
前記酵素分解処理には、ペクチンの最終濃度を２～５ｗｔ％に調整し、ｐＨ４．５で等電点脱タンパク質を行った後に、脱タンパク質で得られた生成物に固形化ペクチナーゼ（ただし、該固形化ペクチナーゼは、リアーゼ（ＰＬ、酵素活性が３２Ｕ/ｇ）、特異的エンドポリガラクツロナーゼ(Ｅｎｄｏ-ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅｓ、ｅｎｄｏ-ＰＧ、Ｅ.Ｃ.３.２.１.１５、４２１２Ｕ/ｇ)、ペクチンエステラーゼ(ＰＥ、Ｅ.Ｃ.３.１.１.１１、６６.７Ｕ/ｇ)及びプロトペクチナーゼを含む）を添加し、ｐＨを３．０～６．０に制御し、分解時間を少なくとも３０分間、例えば３０、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０分間以上とし、好ましく温度を少なくとも３７℃以上、例えば４０、４２、４５、５０、５５または６０℃とし、
前記酵母発酵処理には、ペクチンの最終濃度を２～５ｗｔ％に調整し、活性化されたサッカロミセス・セレビシエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）１～５ｗｔ％を加え、好ましく発酵温度を室温から３５℃まで、例えば３０℃とし、発酵時間を好ましく少なくとも１２時間、例えば１２、１８、２４、３６、４８時間以上とする、技術案１から５のいずれか１項に記載の方法。
７．アルカリ性ｐＨがそれぞれ独立して、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＣａＯＨ及びそれらの混合物からなる群より選ばれる強アルカリ剤で達成され、および／または
酸性ｐＨがそれぞれ独立して、例えば塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、亜硫酸、酢酸及びそれらの混合物からなる群より選ばれる希酸で達成される、技術案１から６のいずれか１項に記載の方法。
８．その中のガラクツロン酸の含有量が少なくとも９０％、例えば９３～９８％であり、エステル化度が例えば１２～１４％であり、かつ／または、分子量が３ｋＤａ～８ｋＤａであるオリゴガラクツロン酸多糖が得られる、技術案１から７のいずれか１項に記載の方法。
９．技術案１から８のいずれか１項に記載のオリゴガラクツロン酸多糖を含有する食用組成物であって、
好ましくは、技術案１から８のいずれか１項に記載のオリゴガラクツロン酸多糖６１０～７１０重量部、ならびに
オウギ（ａｓｔｒａｇａｌｉ ｒａｄｉｘ）２５～３５重量部、炒りサンザシ（ｆｒｉｅｄ ｃｒａｔａｅｇｉｆｒｕｃｔｕｓ）５～２５重量部、赤いナツメ（ｊｕｊｕｂａｅ ｆｒｕｃｔｕｓ）５～２５重量部、及びチンピ（ｃｉｔｒｉ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａｅ ｐｅｒｉｃａｒｐｉｕｍ）６～２０重量部を含むか、それらの成分から調製される、食用組成物。
１０．オウギ、炒りサンザシ、赤いナツメ、チンピを前処理してから水に浸漬させ、少なくとも１５分間、例えば１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２０分間以上煮詰めた後、ろ過することによりエキスペーストを得る工程と、
前記エキスペーストとオリゴガラクツロン酸多糖とを混合して、前記食用組成物を得る工程とを含む、技術案９に記載の組成物を調製するための方法。
１１．前記浸漬用の固液体積比が１：５～１５であり、浸漬時間が２０～６０分である、技術案１０に記載の方法。
１２．慢性炎症関連の疾患を治療するために、好ましく医薬品、食品またはヘルスケア製品の形態として用いられる、技術案１から８のいずれか１項に記載の方法によって調製されたオリゴガラクツロン酸多糖、技術案９に記載の食用組成物
以下に説明されるように、本発明は、以下の技術案をさらに提供する。
１．オレンジの皮を前処理して安定な水溶性ペクチンゲルを得る工程１と、
ｐＨを１２．０～１３．０に制御しながら、８０～１００３までマイクロ波で加熱する条件下で、前記安定な水溶性ペクチンゲルに水酸化ナトリウムを加えて、結合切断水溶性ペクチンゲルを形成するアルカリ加水分解－マイクロ波法による処理の工程２と、
前記結合切断水溶性ペクチンゲルに対して脱メトキシ基化処理を行い、粗製脱メトキシ基化水溶性ペクチンゲルを得る脱メトキシ基化処理の工程３と、
孔径が１～１０ｎｍであり、０．０５～０．５ＭＰａの低差圧を維持しながら高フラックスの抽出を保持し、カットオフ分子量が１０３～１０４である限外濾過膜を使用して高度抽出を行う限外濾過膜精製の工程４とを含む、ことを特徴とするオリゴガラクツロン酸多糖の調製方法。
２．工程３において、前記脱メトキシ基化処理は、具体的に、凍結・乾燥・濃縮を経て、粗製ペクチンの濃度が１０～２０ｇ／Ｌとなるように調整し、ＮａＯＨを加えてｐＨを９～１０に維持しながら、４℃で８～４８時間反応させて脱メチル化を行い、その後に１０％の氷酢酸を使用して酸性度を調整し、反応を終了させることにより行われ、
工程３の後に、前記粗製脱メトキシ基化水溶性ペクチンゲルに対して粗抽出処理を行い、また粗抽出処理後のホモガラクツロン酸の含有量が７０％を超える場合には、酵素分解処理を行うが、ホモガラクツロン酸の含有量が７０％未満である場合には、酵母発酵処理を行い、
工程４の後に、減圧下での回転蒸発濃縮、低温下での乾燥処理がさらに含まれる、ことを特徴とする技術案１に記載のオリゴガラクツロン酸多糖の調製方法。
３．前記酵素分解処理には、まず、等電点法による脱タンパク質を行い、酢酸緩衝液のｐＨ値を４．５に調整し、ペクチンの最終濃度が２～５ｗｔ％となるように調整し；そして、リアーゼ（ＰＬ、酵素活性が３２Ｕ/ｇ）、特異的エンドポリガラクツロナーゼ (Ｅｎｄｏ-ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅｓ,ｅｎｄｏ-ＰＧ,Ｅ.Ｃ.３.２.１.１５、４２１２Ｕ/ｇ)、ペクチンエステラーゼ (ＰＥ,Ｅ.Ｃ.３.１.１.１１、６６．７Ｕ/ｇ)及びプロトペクチナーゼを含む固形化ペクチナーゼを加え、ｐＨを３．０～６．０に制御し、４５℃（最大６０℃）で６０～９０分間維持し、
前記酵母発酵処理には、２ｗｔ％のスクロース溶液に酒醸用造活性乾酵母を加えて、均一に撹拌し、２５～３０℃で２～４時間置いたままで活性化させ；そして、１～５ｗｔ％の活性化させた酵母を濃度が２～５ｗｔ％のペクチン水溶液に加えて、３０℃で２４～４８時間発酵させる、ことを特徴とする技術案２に記載のオリゴガラクツロン酸多糖の調製方法。
４．前記オリゴガラクツロン酸多糖は、ガラクツロン酸の含有量が９３～９８％であり、エステル化度が１２～１４％である、ことを特徴とする技術案１～３のいずれか１項に記載のオリゴガラクツロン酸多糖の調製方法。
５．技術案１から４のいずれか１項に記載のオリゴガラクツロン酸多糖６１０～７１０重量部、および
オウギ２５～３５重量部、炒りサンザシ５～２５重量部、赤いナツメ５～２５重量部およびチンピ６～２０重量部を含むオリゴガラクツロン酸多糖の複合体であって、
前記オリゴガラクツロン酸多糖の分子量が３ｋＤａ～８ｋＤａである、ことを特徴とするオリゴガラクツロン酸多糖の複合体。
６．オウギ、炒りサンザシ、赤いナツメ、チンピを前処理してから水に浸漬させた後、３０～６０分間煮詰め、ろ過することによりエキスペーストを得る工程と、
前記エキスペーストとオリゴガラクツロン酸多糖とを混合して、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体を得る工程とを含む、ことを特徴とする技術案５に記載のオリゴガラクツロン酸多糖の複合体の調製方法。
７．前記前処理は、順番に行われた洗浄、超音波粉砕、篩い分けを含む、ことを特徴とする技術案６に記載の調製方法。
８．前記浸漬は、固液体積比が１：５～１５であり、浸漬時間が２０～６０分である、技術案６に記載の調製方法。
９．前記煮詰め時間が３０～９０分である、技術案６に記載の調製方法。
１０．慢性炎症関連疾患を治療するための医薬品、食品またはヘルスケア製品の調製における、技術案５に記載のオリゴガラクツロン酸多糖の複合体、および技術案６～９のいずれか１項に記載の方法によって調製されたオリゴガラクツロン酸多糖の複合体、の使用。
添付の図面は、本発明の例示的な実施形態を示し、その説明とともに本発明の原理を解釈するために使用されている。なお、それらの図面は、本発明をより一層理解するために本明細書に含まれて本明細書の一部を構成する。
図１は、インビトロ試験で、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体がマウス線維芽細胞の増殖に毒性作用を生じなかったことを示している。 図２は、４Ｔ１細胞のコロニー形成をトリパンブルー染色で定性分析した対比写真を示している。 図３は、マウス乳癌４Ｔ１移植腫瘍の化学療法による治療モデル試験におけるＭＤＳＣ細胞の割合の対比図を示している。 図４は、マウス乳癌４Ｔ１移植腫瘍の化学療法による治療モデル試験における免疫抑制細胞ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ細胞のレベルの対比図を示している。 図５は、マウス乳癌４Ｔ１移植腫瘍の化学療法による治療モデル試験における免疫活性化細胞Ｔｈ１、Ｔｈ１７およびＣＤ８＋キラーＴ細胞のレベルの対比図を示している。 図６は、マウス乳癌４Ｔ１移植腫瘍の化学療法による治療モデル試験における好中球の割合の対比図を示している。 図７は、ＬＰＳにより誘導されるマウスの慢性炎症試験におけるマウス体重曲線の対比図を示している。 図８は、ＬＰＳにより誘導されるマウスの慢性炎症試験における免疫抑制細胞ＭＤＳＣおよびＴｒｅｇ細胞のレベルの対比図を示している。 図９は、ＬＰＳにより誘導されるマウスの慢性炎症試験における免疫活性化細胞Ｔｈ１、Ｔｈ１７およびＣＤ８＋キラーＴ細胞のレベルの対比図を示している。
以下で、添付の図面および実施形態を参照しながら、本発明をより詳細に説明する。ここで説明される具体的な実施形態が本発明を限定するものではなく、関連する内容を解釈するためにのみ使用されることは、理解されるであろう。なお、説明の便宜上、添付の図面には、本発明に関連する部分のみが示されている。
なお、矛盾しない限り、本発明の実施形態および実施形態における特徴を互いに組み合わせ得ることに留意されたい。以下で添付の図面を参照しながら、実施形態と組み合わせて本発明について詳細に説明する。
[実施例１]
ホモガラクツロナン多糖の調製：
（１）オレンジの皮を洗浄し、煮沸して脱色させ、石油エーテルで２回脱エステル化することで、柑橘系精油やナリンギンなどの副産物を得、その後、後続の工程での粗製ペクチン性多糖の放出を促進するために、超音波で粉砕して皮の細胞壁構造を効率的に破壊した。
（２）酸化前処理：破砕した果皮を希塩酸または亜硫酸で溶解し、ｐＨを５．０～６．０に制御し、３０分保持した後、安定な水溶性ペクチンゲルを形成し、滓を濾して取り去った。
（３）酵素分解：６ｍｇ／ｇのセルラーゼを加え、温度を３８℃に維持しながら、７０分間酵素分解した。
(４)アルカリ加水分解-マイクロ波法：密閉した培養槽内で、粗製ペクチンゲル水溶液に４ｍｏｌ/ＬのＮａＯＨを等量に加え、ｐＨを１２．０～１３．０に制御し、マイクロ波で８０～１００°０まで加熱させ（マイクロ波エネルギーにより、水分子を共振させ、長鎖多糖類の共有結合を前もって切断し、後に続く酵素加水分解や微生物発酵工程にかかる時間を短縮し原料消費を削減することが可能となる）、４０～１２０分撹拌した後、室温まで急速に冷却させた。
(５)脱メトキシル化:凍結、乾燥および濃縮を行い、粗製ペクチンの濃度が１０～２０ ｇ/Ｌとなるように調整し、ＮａＯＨを添加し、ｐＨを９～１０に維持しながら、４℃で８～４８時間反応させて脱メチル化を行い、その後に１０％の氷酢酸を使用して酸性度を調整し、反応を終了させた。
(６)粗製ペクチンに対して厳格な品質管理を行い、「ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆｆイオン交換カラム＋ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０ ゲルクロマトグラフィーカラム法」を用いて粗抽出を行い、そしてＨＰＬＣ法またはＭＡＬＬＳ-ＨＰＧＰＣ法を用いて、得られたＨＧの分子量およびエステル化度を測定した。
(７)粗製ペクチン製品は、分子量が均一で、化学的性質が安定し、粗ＨＧの含有量が７０％以上にも達した場合、酵素分解法により分解させるが、粗ＨＧの含有量が７０％未満である場合、酵母発酵法を使用する。
（８）酵素分解法による分解：まず、等電点法による脱タンパク質を行い、酢酸緩衝液でｐＨを４．５に調整し、ペクチンの最終濃度を２～５％に調整した。固形化ペクチナーゼ：リアーゼ（ＰＬ、酵素活性が３２Ｕ/ｇ）、特異的エンドポリガラクツロナーゼ(Ｅｎｄｏ-ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅｓ,ｅｎｄｏ-ＰＧ、Ｅ.Ｃ.３．２.１.１５、４２１２Ｕ/ｇ)、ペクチンエステラーゼ(ＰＥ、Ｅ.Ｃ.３.１.１.１１、６６．７Ｕ/ｇ)及びプロトペクチナーゼを添加し、ｐＨを３．０～６．０に制御しながら、４５°５（最大６０°０）で６０～９０分間維持した。
（９）粗ＨＧの含有量が７０％未満であるので、脱タンパク質工程を予めに行わずに、サッカロミセス・セレビシエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発酵法を使用して発酵分解時間を延長させた。即ち、２％のスクロース溶液に酒醸用造活性乾酵母を加えて、均一に撹拌し、２５～３０°５で２～４時間置いたままで活性化させ、そして、１～５ｗｔ％の活性化済みの酵母を濃度が２～５％のペクチン水溶液中に加えて、３０°０で２４～４８時間発酵させた。
（１０）限外濾過膜による精製：限外濾過膜を使用して高度抽出を行った。ここでは、前記限外濾過膜は、孔径が１～１０ｎｍであり、０．０５～０．５ＭＰａの低差圧を保持しながら高フラックス抽出を連続的に行い、カットオフ分子量が１０３～１０４であった。
（１１）６０～７０°０で減圧下で回転蒸発濃縮させ、低温で乾燥させて、分子量が８ｋＤａの精製オリゴガラクツロン酸多糖を得た。
ｍ-ヒドロキシビフェニル比色分析法によりガラクツロン酸の含有量を測定し、容積分析法によりエステル化度を測定した結果、ガラクツロン酸は、含有量が９５％、エステル化度が１２％であった。
[実施例２]
ホモガラクツロナン多糖の調製：
（１）リンゴの皮を濯いだ。
（２）アルカリ加水分解：果皮４００ｇを２Ｌの水に溶解させ、３ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨを４００ｍｌ加えて、３０分撹拌し、室温まで冷却させた。
（３）酵素分解：５ｍｇ／ｇのセルラーゼを加え、温度を３８℃に維持し、酵素分解時間を９０分とした。
（４）粗ＨＧの含有量が７０％未満であるので、脱タンパク質工程を予めに行わずに、サッカロミセス・セレビシエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発酵法を使用して発酵分解時間を延長させた。即ち、２％のスクロース溶液に酒醸用造活性乾酵母を加えて、均一に撹拌し、２５～３０°５で２～４時間置いたままで活性化させた。１～５ｗｔ％の活性化済みの酵母を、濃度が２～５％のペクチン水溶液中に加えて、３０°０で２４～４８時間発酵させた。
（５）限外濾過膜を使用して高度抽出を行った。ここでは、前記限外濾過膜は、孔径が１～１０ｎｍであり、０．０５～０．５ＭＰａの低差圧を保持しながら高フラックス抽出を連続的に行い、カットオフ分子量が１０３～１０４であった。
（６）低温で乾燥させて、分子量が６ｋＤａの精製オリゴガラクツロン酸多糖を得た。
ｍ-ヒドロキシビフェニル比色分析法によりガラクツロン酸の含有量を測定し、容積分析法によりエステル化度を測定した結果、ガラクツロン酸の含有量が９３％、エステル化度が１４％であった。
[実施例３]
実施例１で調製したオリゴガラクツロン酸多糖を使用した。
オリゴガラクツロン酸多糖６２５重量部と、オウギ２５重量部と、炒りサンザシ１０重量部、赤ナツメ１０重量部、およびチンピ８重量部を用意した。
オウギ、炒りサンザシ、赤ナツメ、チンピを洗浄し、超音波で粉砕し、篩いにかけ、１０倍の再蒸留水に３０分間浸漬させ、弱火で１時間煮詰めた後、ろ過して、エキスペーストを作製した。その後、このエキスペーストをオリゴガラクツロン酸多糖と十分に混ぜて粉剤にした。
[対比例１]
実施例１で調製したオリゴガラクツロン酸多糖を使用した。
炒りサンザシ、赤ナツメおよびチンピを加えずに、実施例３の方法に従ってオリゴガラクツロン酸多糖の複合体を調製した。
[実施例４]
実施例１で調製したオリゴガラクツロン酸多糖を使用した。オリゴガラクツロン酸多糖６００重量部、オウギ３５重量部、炒りサンザシ１０重量部、赤ナツメ２０重量部、およびチンピ６重量部を用意した。
オウギ、炒りサンザシ、赤ナツメ、チンピを洗浄し、超音波で粉砕し、篩いにかけた後、５倍の再蒸留水に４０分間浸漬させ、弱火で０．５時間煮詰めた後、滓を濾して取り去り、エキスペーストを作製した。その後、このエキスペーストをオリゴガラクツロン酸多糖と十分に混ぜて錠剤にした。
[実施例５]
実施例１で調製したオリゴガラクツロン酸多糖を使用した。
オリゴガラクツロン酸多糖７００重量部、オウギ２０重量部、炒りサンザシ２０重量部、赤ナツメ１０重量部、チンピ１５重量部を用意した。
オウギ、炒りサンザシ、赤ナツメ、チンピを洗浄し、超音波で粉砕し、篩いにかけた後、１０倍の再蒸留水に６０分間浸漬させ、弱火で１．５時間煮詰めた後、滓を濾して取り去り、エキスペーストを作製した。その後、このエキスペーストをオリゴガラクツロン酸多糖と十分に混ぜてカプセルにした。
[実施例６] 毒性作用がなかった
実施例３におけるオリゴガラクツロン酸多糖の複合体（以下、ＨＧ＋漢方薬の複合物という）は、最適な比率に従って配合されたものであり、オリゴガラクツロン酸多糖６２５重量部と、オウギ２５重量部と、炒りサンザシ１０重量部と、赤ナツメ１０重量部と、チンピ８重量部とを含有する。
（１）インビトロ試験において、本出願のオリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、マウス線維芽細胞の増殖に対して有意な毒性作用を示さなかった。
Ｂａｌｂ／ｃ系マウス尾部由来の線維芽細胞１マウス尾部５を９６ウェル細胞培養プレート内に無菌的に接種し、３ウェルあたりに濃度が維のオリゴガラクツロン酸多糖の複合体の完全細胞培養液１６４０を接種し、他の３ウェルに２０の生理食塩水を入れて対照群とし、最終容量を０．２ｍｌとし、２４時間おきに細胞培養を終了させ、培養細胞の生存率をＭＴＴ法によって測定した。その結果を図１に示した。
（２）インビトロ試験において、本出願のオリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、マウス４Ｔ１乳癌細胞に対して有意な殺傷効果を示さなかった。
６ウェル細胞培養プレート内にＢａｌｂ/ｃ系マウス４Ｔ１乳がん細胞を無菌的に１ウェルに１線がん細４個接種し、様々な濃度のオリゴガラクツロン酸多糖の複合体を含む完全細胞培養液１６４０（濃度がそれぞれに０．０１、０．１、１．０、１０．０、１００．０合物である）を２ｍｌ加えた。対照群には、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体を含まない生理食塩水２０照組を使用した。４８時間経過後に細胞培養を終了させ、トリパンブルーで染色し、４Ｔ１細胞が形成したコロニーの密度及び大きさを定性的に分析したところ、有意差が見られなかった。その結果を図２に示した。
[実施例７]
対数増殖期のマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７を５以Ｗ２３個／８０２６のＤＭＥＭ完全培地の密度で９６ウェル培養プレート内に接種し、ブランク群、対照群、さまざまな濃度のサンプル群を設置し、１群に６つの並行ウェルを設定し、３７°７で、５％(ｖ/ｖ)ＣＯ２インキュベーター内で培養した。一晩培養し、翌日に細胞密度が５０～６０％に達した時、培地およびさまざまな濃度のオリゴガラクツロン酸多糖の複合体（実施例３で得られたオリゴガラクツロン酸多糖の複合体）をそれぞれに加えて８時間で前処理した。
ブランク対照群には、１００μｌのＤＭＥＭ完全培地のみを加えた。
陽性対照群には、ＬＰＳの最終濃度が５００ｎｇ/ｍｌとなるように、各ウェルにＬＰＳを含む完全培地１００μｌを加えて培養した。
処理群１には、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の最終濃度が２酸多糖複合物となるように、培地中にオリゴガラクツロン酸多糖の複合体を含むＤＥＭＥ完全培地を１００基加えた。
処理群２には、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の最終濃度が４酸多糖複合物となるように、培地中にオリゴガラクツロン酸多糖の複合体を含むＤＥＭＥ完全培地を１００基加えた。
処理群３には、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の最終濃度が８酸多糖複合物となるように、培地中にオリゴガラクツロン酸多糖の複合体を含むＤＥＭＥ完全培地を１００基加えた。
処理群４には、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の最終濃度が１６酸多糖複合物となるように、培地中にオリゴガラクツロン酸多糖の複合体を含むＤＥＭＥ完全培地を１００基加えた。
ＬＰＳの最終濃度が５００ｎｇ/ｍｌとなるように、処理群１～４の各ウェルにＬＰＳを含む完全培地 ２０全培を加えて、１６時間処理した。培養終了後、ＭＴＴ法を用いて培養後のＲＡＷ２６４．７細胞の生存率を測定した。
マイクロプレートリーダーでＡ５５０ｎｍにおける吸光度を読み取り、ブランク群の平均値を相対細胞生存率１００％として、各群の相対細胞生存率を算出した（各群について、試験を６回繰り返して、得られた６組の平均値を測定結果とした）。
[実施例８]
以下、本出願のオリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、インビトロで慢性炎症関連の免疫抑制細胞であるＭＤＳＣ細胞およびＴｒｅｇ細胞の増殖および分化に拮抗する効果があったことが確認された。
（１）オリゴガラクツロン酸多糖の複合体を経口投与したことにより、腫瘍担持マウスの脾臓内のＭＤＳＣ細胞の割合が有意に減少していたことが確認された。
腫瘍担持マウスにオリゴガラクツロン酸多糖の複合体を経口投与した試験の終了時点に、マウスの脾臓細胞を抽出し、フロー分析を行った結果、処理群（５-ＦＵ＋オリゴガラクツロン酸多糖の複合体）では、免疫抑制細胞ＭＤＳＣの割合が有意に減少していたことが観察された。その結果を図３に示した。
（２）インビトロ培養において、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体によって免疫抑制細胞ＭＤＳＣとＴｒｅｇ細胞の分化率が減少していたことが確認された。
１細胞培６の腫瘍担持マウスの脾臓細胞を４８ウェル細胞培養プレート内に培養した。対照群には１ウェルあたりに２０μｌの生理食塩水を加えた。処理群には、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の濃度を１０アルドン酸多多糖とし、最終容量を１ｍｌとした。４８時間経過後に細胞培養を終了させた。そして、フローサイトメトリーでＩＦＮ+Ｔｈ１細胞、ＩＬ-１７ａ+Ｔｈ１７細胞、およびＣＤ８＋キラーＴ細胞の割合、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ抑制性Ｔｒｅｇ細胞の割合、およびＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ-１＋抑制性ＭＤＳＣ細胞の割合を検出した。その結果を図４及び図５に示した。
（３）インビトロ培養において、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体によって、免疫陽性エフェクター細胞であるＴｈ１、Ｔｈ１７、およびＣＤ８＋キラーＴ細胞の分化率が増加していたことが見られた。その結果を図５に示した。
[実施例９]
オリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、白血球を増加させ、化学療法の血液毒性を軽減する効果があったことが確認された。
腫瘍担持マウスの脾臓内に、５-ＦＵ+オリゴガラクツロン酸多糖の複合体による処理群では、好中球の割合が、５-ＦＵによる化学療法群と比較して増加していた。その結果を図６に示した。
[実施例１０] ＬＰＳにより誘導されるマウスの慢性炎症試験
８～１０週齢の雌Ｂａｌｂ/ｃマウスをランダムに、１群に８匹、５群に分けた。
ブランク群には、１００の生理食塩水を腹腔内注射した。
陽性対照群及び処理群には、低用量ＬＰＳを０日目から２１日目まで８回腹腔内注射した（０．５ｍｇ/ｋｇ体重、５０、ｍ、３日に１回）。
オリゴガラクツロン酸多糖による治療群には、低用量ＬＰＳを腹腔内注射し（０．５ｍｇ／ｋｇ体重、５０、ｍ、３日に１回）、０日目から、毎日にオリゴガラクツロン酸多糖（実施例１）を２ｇ／ｋｇ体重／日の投与量で経口投与した。
オリゴガラクツロン酸多糖+オウギによる治療群には、低用量ＬＰＳを腹腔内注射し（０．５ｍｇ／ｋｇ体重、５０、ｍ、３日に１回）、０日目から、毎日にオリゴガラクツロン酸多糖+オウギ(対比例１)を２．０３ｇ／ｋｇ体重／日の投与量で経口投与した。
オリゴガラクツロン酸多糖の複合体による治療群には、低用量ＬＰＳを腹腔内注射し（０．５ｍｇ／ｋｇ体重、５０、ｍ、３日に１回）、０日目から、毎日にオリゴガラクツロン酸多糖の複合体（実施例３）を２．１７ｇ／ｋｇ体重／日の投与量で経口投与した。
２２日目（２１日間の腹腔内注射＋経口投与後）：
（１）ブランク群では、マウスの精神状態が正常で、摂食量および水分用量が正常であり、摂食や運動や排泄行動に明らかな異常は見られなかった。
（２）陽性対照群では、マウスの精神状態が悪く、倦怠感がありそうで、摂食量および水分用量が減少し、刺激に対する反応が遅く、だるくて怒りっぽくなり、体重の減少が顕著で、脱毛が生じ、排尿に明らかな異常が見られなかったが、大便に水分が多く軟らかく、偶にはドロ状、粘液や膿や血液が混じっていた。
（３）オリゴガラクツロン酸多糖による治療群（ＨＧによる治療群）では、マウスの精神状態が改善し、摂食量および水分用量がほぼ正常に戻り、体重が緩やかに増加し、薄毛が余りにも見られず、排尿に明らかな異常が見られず、大便が基本的に正常の形になり、偶には粘液便が見られた。
（４）オリゴガラクツロン酸多糖＋オウギによる治療群（ＨＧ＋オウギによる治療群）では、マウスの精神状態が改善し、摂食量および水用量がほぼ正常に戻り、体重が正常に徐々に増加し、薄毛は余りにも見られず、排尿には明らかな異常が見られず、大便が正常の形になり、偶には粘液便が見られた。
（５）オリゴガラクツロン酸多糖の複合体による治療群（ＨＧ＋漢方薬複合物による治療群）では、精神状態が良好であり、摂食量および水分用量が正常で、活発に動き、体重増加が正常で、毛色がつやつやとし、大便が正常の形になり、楕円形で顆粒状、黄褐色、硬めの質感で、粘液や膿や血液はなかった。
試験過程中に、各群におけるマウスの体重成長曲線を記録した結果から、陽性対照群において慢性炎症による発症が明らかに悪くなったこと、およびＨＧ、ＨＧ＋オウギ、ＨＧ＋漢方薬複合物による治療が有効であったことが見られた。その結果を図７に示した。
ＬＰＳにより誘導されるマウスの慢性炎症試験の終了時点で、マウス脾臓細胞を取り出し、フロー分析した。その結果、陽性対照群では、低濃度ＬＰＳを長期にわたって腹腔内に注射したことにより、脾臓免疫抑制細胞であるＭＤＳＣ細胞とＴｒｅｇ細胞が有意に増加していたこと；オリゴガラクツロン酸多糖による治療群、およびオリゴガラクツロン酸多糖＋オウギによる治療群では、ＬＰＳ処理によって引き起された慢性炎症に起因したＭＤＳＣ細胞とＴｒｅｇ細胞の割合の増加が減少していたこと；オリゴガラクツロン酸多糖の複合体による治療群では、オリゴガラクツロン酸多糖による治療群、及びオリゴガラクツロン酸多糖＋オウギによる治療群と比較して、ＬＰＳ慢性炎症に起因した免疫抑制細胞ＭＤＳＣとＴｒｅｇ細胞の増加がより一層有意に減少していたこと、が示された。その結果を図８に示した。
[実施例１１]
ＬＰＳによって誘導されるマウスの慢性炎症試験の終了時点で、マウス脾臓細胞を取り出し、フローサイトメトリーでＩＦＮｇ+Ｔｈ１細胞、ＩＬ-１７ａ+Ｔｈ１７細胞およびＣＤ８＋キラーＴ細胞の割合を検出した。その結果を図９に示した。
図９には、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体によって免疫促進性（正）エフェクター細胞Ｔｈ１、Ｔｈ１７、およびＣＤ８＋キラーＴ細胞の分化率が増加していたことが示されている。
上記の試験から明らかなように、本出願によるオリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、インビトロ試験において、マウス線維芽細胞に対して有意な殺傷効果を示さなかったうえで、免疫細胞の分化を制御することもでき、ＣＤ４制御性Ｔ細胞の割合を減少させたり、ＭＤＳＣ細胞の割合を減少させたりする作用を持っていた。オリゴガラクツロン酸多糖をマウスに経口投与した後、インビボでＭＤＳＣ細胞関連の慢性炎症に対する拮抗、末梢血中のＣＤ４ Ｔｒｅｇ細胞の割合の減少、ＣＤ８ Ｔ細胞の割合の上昇が可能になり、またインビボでマウス４Ｔ１乳がん移植腫瘍の化学療法モデルに引き起こした白血球の減少に拮抗して、白血球を有意に増加できる機能を示し、腫瘍を接種した部位の浸潤リンパ球内のＭＤＳＣ細胞の割合を減少させ、ＣＤ８Ｔ細胞の割合を増加させることができた。
特に、ＬＰＳによって誘導されるマウスの慢性炎症試験では、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体をマウスに経口投与した後、インビボでＭＤＳＣ細胞関連の慢性炎症に拮抗し、末梢血中のＣＤ４ Ｔｒｅｇ細胞の割合を減少させ、ＣＤ８ Ｔ細胞の割合を上昇させることができた。特に、オリゴガラクツロン酸多糖と比較して、本出願によるオリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、ＭＤＳＣ細胞関連の慢性炎症に拮抗し、末梢血中のＣＤ４ Ｔｒｅｇ細胞の割合を減少させ、ＣＤ８ Ｔ細胞の割合を増加させるという良好な効果を示した。
なお、本発明の実施例は、本発明における上記の技術案を好適に例示する役割で用いられ、本発明における上記の多糖類の調製における具体的な工程または工程の組み合わせに該当すれば、本発明に記載された実施例および対比例の効果の範囲を含むものとすることに留意されたい。
したがって、本出願によるオリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、免疫力の強化、肝臓の保護、抗慢性炎症、抗酸化ストレス、老化防止などの新たな機能を有することから、医薬品、食品またはヘルスケア製品の調製に使用されると、この医薬品、食品またはヘルスケア製品は、ＭＤＳＣ関連の慢性炎症の治療に使用することが可能になり、白血球の上昇、化学療法の血液毒性の軽減といった治療効果も図れる。
本明細書の記載において、「一実施例/形態」、「いくつかの実施例／形態」、「例」、「具体例」、「いくつかの例」などの用語は、その実施例/形態または例と組み合わせて記載された具体的な特徴、構造、材料または特性が、本出願の少なくとも１つの実施例／形態または例に含まれることを意味することが意図されている。本明細書において、上記の用語の概略的な表現は必ずしも同じ実施例／形態または例を指すとは限らない。しかも、ここに記載された具体的な特徴、構造、材料または特性は、いずれか１つまたは複数の実施例／形態または例において適切な方法で組み合わせ得る。また、互いに矛盾しない限り、当業者なら、本明細書に記載された異なる実施例／形態または例と、異なる実施例態／形態または例の特徴とを結合したり組み合わせたりする可能性がある。
さらに、「第１」や「第２」などの用語は、記述のためにのみ使用されており、相対的な重要性を示したり暗示したり、示された技術的特徴の数を暗黙的に指定したりするものとして解釈されるべきではない。したがって、「第１」や「第２」として限定される特徴は、少なくとも１つのこの特徴を明示的または暗黙的に含み得る。本明細書の記載において、「複数」とは、別段に明確な限定がない限り、２つ、３つなど少なくとも２つを意味することが意図されている。
上記の実施形態は本発明を明確に説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことは、当業者に理解されるべきであろう。当業者であれば上記の開示に加えて他の変更や補正を行い得るが、これらの変更や補正は依然として本発明の範囲内に含まれるものとする。
また、本発明は、オレンジの皮を前処理して安定な水溶性ペクチンゲルを得る工程１と；ｐＨを１２．０～１３．０に制御しながら、８０～１００℃までマイクロ波で加熱する条件下で、前記安定な水溶性ペクチンゲルに水酸化ナトリウムを加えて、結合切断水溶性ペクチンゲルを形成するアルカリ加水分解－マイクロ波法による処理の工程２と；前記結合切断水溶性ペクチンゲルに対して脱メトキシ基化処理を行い、粗製脱メトキシ基化水溶性ペクチンゲルを得る脱メトキシ基化処理の工程３と；孔径が１～１０ｎｍであり、０．０５～０．５ＭＰａの低差圧を維持しながら高フラックスの抽出を保持し、カットオフ分子量が１０３～１０４である限外濾過膜を使用して高度抽出を行う限外濾過膜精製の工程４とを含む、オリゴガラクツロン酸多糖の調製方法を提供する。
本発明の好ましい実施形態において、任意選択的に、前記酵素分解処理には、まず、等電点法による脱タンパク質を行い、酢酸緩衝液のｐＨ値を４．５に調整し、ペクチンの最終濃度が２～５ｗｔ％となるように調整し；また、リアーゼ（ＰＬ、酵素活性が３２Ｕ/ｇ）、特異的エンドポリガラクツロナーゼ (Ｅｎｄｏ-ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅｓ,ｅｎｄｏ-ＰＧ,Ｅ.Ｃ.３.２.１.１５、４２１２Ｕ/ｇ)、ペクチンエステラーゼ (ＰＥ,Ｅ.Ｃ.３.１.１.１１、６６．７Ｕ/ｇ)及びプロトペクチナーゼを含む固形化ペクチナーゼを加え、ｐＨを３．０～６．０に制御し、４５℃（最大６０℃）で６０～９０分間維持する。また、本発明の好ましい実施形態において、任意選択的に、前記酵母発酵処理には、２ｗｔ％のスクロース溶液に酒醸用造活性乾酵母を加えて、均一に撹拌し、２５～３０℃で２～４時間置いたままで活性化させ、そして、１～５ｗｔ％の活性化させた酵母を濃度が２～５ｗｔ％のペクチン水溶液に加えて、３０℃で２４～４８時間発酵させる。
以下に説明されるように、本発明は、以下の技術案をさらに提供する。
１．オレンジの皮を前処理して安定な水溶性ペクチンゲルを得る工程１と、
ｐＨを１２．０～１３．０に制御しながら、８０～１００℃までマイクロ波で加熱する条件下で、前記安定な水溶性ペクチンゲルに水酸化ナトリウムを加えて、結合切断水溶性ペクチンゲルを形成するアルカリ加水分解－マイクロ波法による処理の工程２と、
前記結合切断水溶性ペクチンゲルに対して脱メトキシ基化処理を行い、粗製脱メトキシ基化水溶性ペクチンゲルを得る脱メトキシ基化処理の工程３と、
孔径が１～１０ｎｍであり、０．０５～０．５ＭＰａの低差圧を維持しながら高フラックスの抽出を保持し、カットオフ分子量が１０３～１０４である限外濾過膜を使用して高度抽出を行う限外濾過膜精製の工程４とを含む、ことを特徴とするオリゴガラクツロン酸多糖の調製方法。
[実施例１]
ホモガラクツロナン多糖の調製：
（１）オレンジの皮を洗浄し、煮沸して脱色させ、石油エーテルで２回脱エステル化することで、柑橘系精油やナリンギンなどの副産物を得、その後、後続の工程での粗製ペクチン性多糖の放出を促進するために、超音波で粉砕して皮の細胞壁構造を効率的に破壊した。
（２）酸化前処理：破砕した果皮を希塩酸または亜硫酸で溶解し、ｐＨを５．０～６．０に制御し、３０分保持した後、安定な水溶性ペクチンゲルを形成し、滓を濾して取り去った。
（３）酵素分解：６ｍｇ／ｇのセルラーゼを加え、温度を３８℃に維持しながら、７０分間酵素分解した。
(４)アルカリ加水分解-マイクロ波法：密閉した培養槽内で、粗製ペクチンゲル水溶液に４ｍｏｌ/ＬのＮａＯＨを等量に加え、ｐＨを１２．０～１３．０に制御し、マイクロ波で８０～１００℃まで加熱させ（マイクロ波エネルギーにより、水分子を共振させ、長鎖多糖類の共有結合を前もって切断し、後に続く酵素加水分解や微生物発酵工程にかかる時間を短縮し原料消費を削減することが可能となる）、４０～１２０分撹拌した後、室温まで急速に冷却させた。
(５)脱メトキシル化:凍結、乾燥および濃縮を行い、粗製ペクチンの濃度が１０～２０ｇ/Ｌとなるように調整し、ＮａＯＨを添加し、ｐＨを９～１０に維持しながら、４℃で８～４８時間反応させて脱メチル化を行い、その後に１０％の氷酢酸を使用して酸性度を調整し、反応を終了させた。
(６)粗製ペクチンに対して厳格な品質管理を行い、「ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆｆイオン交換カラム＋ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０ ゲルクロマトグラフィーカラム法」を用いて粗抽出を行い、そしてＨＰＬＣ法またはＭＡＬＬＳ-ＨＰＧＰＣ法を用いて、得られたＨＧの分子量およびエステル化度を測定した。
(７)粗製ペクチン製品は、分子量が均一で、化学的性質が安定し、粗ＨＧの含有量が７０％以上にも達した場合、酵素分解法により分解させるが、粗ＨＧの含有量が７０％未満である場合、酵母発酵法を使用する。
（８）酵素分解法による分解：まず、等電点法による脱タンパク質を行い、酢酸緩衝液でｐＨを４．５に調整し、ペクチンの最終濃度を２～５％に調整した。固形化ペクチナーゼ：リアーゼ（ＰＬ、酵素活性が３２Ｕ/ｇ）、特異的エンドポリガラクツロナーゼ(Ｅｎｄｏ-ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅｓ,ｅｎｄｏ-ＰＧ、Ｅ.Ｃ.３．２.１.１５、４２１２Ｕ/ｇ)、ペクチンエステラーゼ(ＰＥ、Ｅ.Ｃ.３.１.１.１１、６６．７Ｕ/ｇ)及びプロトペクチナーゼを添加し、ｐＨを３．０～６．０に制御しながら、４５℃（最大６０℃）で６０～９０分間維持した。
（９）粗ＨＧの含有量が７０％未満であるので、脱タンパク質工程を予めに行わずに、サッカロミセス・セレビシエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発酵法を使用して発酵分解時間を延長させた。即ち、２％のスクロース溶液に酒醸用造活性乾酵母を加えて、均一に撹拌し、２５～３０℃で２～４時間置いたままで活性化させ、そして、１～５ｗｔ％の活性化済みの酵母を濃度が２～５％のペクチン水溶液中に加えて、３０℃で２４～４８時間発酵させた。
（１０）限外濾過膜による精製：限外濾過膜を使用して高度抽出を行った。ここでは、前記限外濾過膜は、孔径が１～１０ｎｍであり、０．０５～０．５ＭＰａの低差圧を保持しながら高フラックス抽出を連続的に行い、カットオフ分子量が１０３～１０４であった。
（１１）６０～７０℃で減圧下で回転蒸発濃縮させ、低温で乾燥させて、分子量が８ｋＤａの精製オリゴガラクツロン酸多糖を得た。
[実施例２]
ホモガラクツロナン多糖の調製：
（１）リンゴの皮を濯いだ。
（２）アルカリ加水分解：果皮４００ｇを２Ｌの水に溶解させ、３ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨを４００ｍｌ加えて、３０分撹拌し、室温まで冷却させた。
（３）酵素分解：５ｍｇ／ｇのセルラーゼを加え、温度を３８℃に維持し、酵素分解時間を９０分とした。
（４）粗ＨＧの含有量が７０％未満であるので、脱タンパク質工程を予めに行わずに、サッカロミセス・セレビシエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発酵法を使用して発酵分解時間を延長させた。即ち、２％のスクロース溶液に酒醸用造活性乾酵母を加えて、均一に撹拌し、２５～３０℃で２～４時間置いたままで活性化させた。１～５ｗｔ％の活性化済みの酵母を、濃度が２～５％のペクチン水溶液中に加えて、３０℃で２４～４８時間発酵させた。
（５）限外濾過膜を使用して高度抽出を行った。ここでは、前記限外濾過膜は、孔径が１～１０ｎｍであり、０．０５～０．５ＭＰａの低差圧を保持しながら高フラックス抽出を連続的に行い、カットオフ分子量が１０３～１０４であった。
（６）低温で乾燥させて、分子量が６ｋＤａの精製オリゴガラクツロン酸多糖を得た。
ｍ-ヒドロキシビフェニル比色分析法によりガラクツロン酸の含有量を測定し、容積分析法によりエステル化度を測定した結果、ガラクツロン酸の含有量が９３％、エステル化度が１４％であった。
（１）インビトロ試験において、本出願のオリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、マウス線維芽細胞の増殖に対して有意な毒性作用を示さなかった。
Ｂａｌｂ／ｃ系マウス尾部由来の線維芽細胞１×１０ ５ 個を９６ウェル細胞培養プレート内に無菌的に接種し、３ウェルあたりに濃度が１０μｇ／ｍｌのオリゴガラクツロン酸多糖の複合体の完全細胞培養液１６４０を接種し、他の３ウェルに２０％の生理食塩水を入れて対照群とし、最終容量を０．２ｍｌとし、２４時間おきに細胞培養を終了させ、培養細胞の生存率をＭＴＴ法によって測定した。その結果を図１に示した。
（２）インビトロ試験において、本出願のオリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、マウス４Ｔ１乳癌細胞に対して有意な殺傷効果を示さなかった。
６ウェル細胞培養プレート内にＢａｌｂ/ｃ系マウス４Ｔ１乳がん細胞を無菌的に１ウェルに１×１０ ４ 個接種し、様々な濃度のオリゴガラクツロン酸多糖の複合体を含む完全細胞培養液１６４０（濃度がそれぞれに０．０１、０．１、１．０、１０．０、１００．０μｇ／ｍｌである）を２ｍｌ加えた。対照群には、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体を含まない生理食塩水２０μlを使用した。４８時間経過後に細胞培養を終了させ、トリパンブルーで染色し、４Ｔ１細胞が形成したコロニーの密度及び大きさを定性的に分析したところ、有意差が見られなかった。その結果を図２に示した。
[実施例７]
対数増殖期のマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７を５×１０ ３ 個/８０μlのＤＭＥＭ完全培地の密度で９６ウェル培養プレート内に接種し、ブランク群、対照群、さまざまな濃度のサンプル群を設置し、１群に６つの並行ウェルを設定し、３７℃で、５％(ｖ/ｖ)ＣＯ２インキュベーター内で培養した。一晩培養し、翌日に細胞密度が５０～６０％に達した時、培地およびさまざまな濃度のオリゴガラクツロン酸多糖の複合体（実施例３で得られたオリゴガラクツロン酸多糖の複合体）をそれぞれに加えて８時間で前処理した。
ブランク対照群には、１００μｌのＤＭＥＭ完全培地のみを加えた。
陽性対照群には、ＬＰＳの最終濃度が５００ｎｇ/ｍｌとなるように、各ウェルにＬＰＳを含む完全培地１００μｌを加えて培養した。
処理群１には、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の最終濃度が２μｇ／ｍｌとなるように、培地中にオリゴガラクツロン酸多糖の複合体を含むＤＥＭＥ完全培地を１００μｌ加えた。
処理群２には、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の最終濃度が４μｇ／ｍｌとなるように、培地中にオリゴガラクツロン酸多糖の複合体を含むＤＥＭＥ完全培地を１００μｌ加えた。
処理群３には、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の最終濃度が８μｇ／ｍｌとなるように、培地中にオリゴガラクツロン酸多糖の複合体を含むＤＥＭＥ完全培地を１００μｌ加えた。
処理群４には、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の最終濃度が１６μｇ／ｍｌとなるように、培地中にオリゴガラクツロン酸多糖の複合体を含むＤＥＭＥ完全培地を１００μｌ加えた。
ＬＰＳの最終濃度が５００ｎｇ/ｍｌとなるように、処理群１～４の各ウェルにＬＰＳを含む完全培地 ２０μｌを加えて、１６時間処理した。培養終了後、ＭＴＴ法を用いて培養後のＲＡＷ２６４．７細胞の生存率を測定した。
[実施例８]
以下、本出願のオリゴガラクツロン酸多糖の複合体は、インビトロで慢性炎症関連の免疫抑制細胞であるＭＤＳＣ細胞およびＴｒｅｇ細胞の増殖および分化に拮抗する効果があったことが確認された。
（１）オリゴガラクツロン酸多糖の複合体を経口投与したことにより、腫瘍担持マウスの脾臓内のＭＤＳＣ細胞の割合が有意に減少していたことが確認された。
腫瘍担持マウスにオリゴガラクツロン酸多糖の複合体を経口投与した試験の終了時点に、マウスの脾臓細胞を抽出し、フロー分析を行った結果、処理群（５-ＦＵ＋オリゴガラクツロン酸多糖の複合体）では、免疫抑制細胞ＭＤＳＣの割合が有意に減少していたことが観察された。その結果を図３に示した。
（２）インビトロ培養において、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体によって免疫抑制細胞ＭＤＳＣとＴｒｅｇ細胞の分化率が減少していたことが確認された。
１×１０ ６ 個の腫瘍担持マウスの脾臓細胞を４８ウェル細胞培養プレート内に培養した。対照群には１ウェルあたりに２０μｌの生理食塩水を加えた。処理群には、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体の濃度を１０μｇ／ｍｌとし、最終容量を１ｍｌとした。４８時間経過後に細胞培養を終了させた。そして、フローサイトメトリーでＩＦＮｇ +Ｔｈ１細胞、ＩＬ-１７ａ+Ｔｈ１７細胞、およびＣＤ８＋キラーＴ細胞の割合、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉ抑制性Ｔｒｅｇ細胞の割合、およびＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ-１＋抑制性ＭＤＳＣ細胞の割合を検出した。その結果を図４及び図５に示した。
（３）インビトロ培養において、オリゴガラクツロン酸多糖の複合体によって、免疫陽性エフェクター細胞であるＴｈ１、Ｔｈ１７、およびＣＤ８＋キラーＴ細胞の分化率が増加していたことが見られた。その結果を図５に示した。
[実施例１０] ＬＰＳにより誘導されるマウスの慢性炎症試験
８～１０週齢の雌Ｂａｌｂ/ｃマウスをランダムに、１群に８匹、５群に分けた。
ブランク群には、１００μｌの生理食塩水を腹腔内注射した。
陽性対照群及び処理群には、低用量ＬＰＳを０日目から２１日目まで８回腹腔内注射した（０．５ｍｇ/ｋｇ体重、５０μｌ、３日に１回）。
オリゴガラクツロン酸多糖による治療群には、低用量ＬＰＳを腹腔内注射し（０．５ｍｇ／ｋｇ体重、５０μｌ、３日に１回）、０日目から、毎日にオリゴガラクツロン酸多糖（実施例１）を２ｇ／ｋｇ体重／日の投与量で経口投与した。
オリゴガラクツロン酸多糖+オウギによる治療群には、低用量ＬＰＳを腹腔内注射し（０．５ｍｇ／ｋｇ体重、５０μｌ、３日に１回）、０日目から、毎日にオリゴガラクツロン酸多糖+オウギ(対比例１)を２．０３ｇ／ｋｇ体重／日の投与量で経口投与した。
オリゴガラクツロン酸多糖の複合体による治療群には、低用量ＬＰＳを腹腔内注射し（０．５ｍｇ／ｋｇ体重、５０μｌ、３日に１回）、０日目から、毎日にオリゴガラクツロン酸多糖の複合体（実施例３）を２．１７ｇ／ｋｇ体重／日の投与量で経口投与した。
上記の実施形態は本発明を明確に説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことは、当業者に理解されるべきであろう。当業者であれば上記の開示に加えて他の変更や補正を行い得るが、これらの変更や補正は依然として本発明の範囲内に含まれるものとする。
本発明の具体的態様は以下のとおりである。
[態様１]
ペクチンを含む果皮および／または果滓を提供する工程１と、
工程１で得られた原料をアルカリ性水溶液と接触させてアルカリ処理を行い、混合物のｐＨを１１以上に維持して結合切断水溶性ペクチンゲルを得る工程２と、
任意選択的に工程２で得られた結合切断水溶性ペクチンゲルを、ｐＨ９～１１、０～８℃温度下で少なくとも２時間続いて濃縮させた後、ｐＨを６～８の中性付近に調整し、前記結合切断水溶性ペクチンゲルに対して脱メトキシ基化処理を行うことで粗製脱メトキシ基化水溶性ペクチンゲルを得る工程３と、
任意選択的にカチオン性交換樹脂を使用して、前記水溶性ペクチンゲルを粗抽出する工程４と、
高分子量不純物を除去する工程５と、を含む方法であって、
工程２において、前記アルカリ処理は、好ましくｐＨが１２～１３であり、好ましく少なくとも３０分間、例えば３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０分間続けられ、
工程３において、前記濃縮は、好ましく凍結乾燥法で行われ、粗製ペクチンの濃度が好ましく少なくとも５ｇ／Ｌ、例えば１０、１５、２０、２５、３０または４０ｇ／Ｌ、具体的に１０～２０ｇ／Ｌの範囲になるまで行われ、好ましくｐＨを９～１０とし、好ましく２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、６０、又は７２時間以上続けられ、
工程４において、前記カチオン性交換樹脂は、例えば、スルホン酸基又はＤＥＡＥ基を持つカチオン性交換樹脂であり、
工程５において、前記高分子量不純物の除去には、好ましくカットオフ分子量が少なくとも１０ ３ ～１０ ４ Ｄａである限外濾過膜を使用し、例えば、孔径が１～１０ｎｍであり、０．０５～０．５ＭＰａの低差圧を維持しながら高フラックスの抽出を維持し、カットオフ分子量が１０ ３ ～１０ ４ Ｄａである限外濾過膜を使用する、オリゴガラクツロン酸多糖の調製方法。
[態様２]
工程２を実施する前に、前記果皮に対して酸処理を行うことで安定な水溶性ペクチンゲルを得ることをさらに含む方法であって、
前記酸処理は、好ましくｐＨが５～６で行われ、好ましく１０～６０分間、例えば１０、１５、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７５、９０または１２０分間続けられる、態様１に記載の方法。
[態様３]
工程２のアルカリ処理において、マイクロ波で好ましく少なくとも５０℃、例えば６０、７０、８０、９０または１００℃まで加熱することをさらに含む、態様１または２に記載の方法。
[態様４]
工程２のアルカリ処理を行う前またはその後に、セルラーゼ酵素分解処理を行うことをさらに含む方法であって、
前記酵素分解処理は、好ましくセルラーゼ１～１０ｍｇ／ｇを添加し、酵素分解温度を室温から４０℃まで、例えば３８℃にした条件下で、少なくとも３０分間、例えば３０、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２０または１５０分間続けられる、態様１から３のいずれか１項に記載の方法。
[態様５]
前記果皮および／または果滓は、柑橘類、ナシ類、ブドウ類、ウリ科、バショウ科の果実、又はヒマワリの花托に由来し、例えば、タンジェリン、ミカン、オレンジ、キンカン、レモン、ザボン、枳金柑（Ｃｉｔｒｕｍｑｕａｔ）、リンゴ、ナシ、ビワ、サンザシ、アンズ、プラム、ウメ、モモ、キウイ、バナナ、ブドウ、スイカ、ヒマワリに由来する、態様１から４のいずれか１項に記載の方法。
[態様６]
工程４で得られた粗抽出物に対しては、該粗抽出物中のホモガラクツロン酸の含有量が７０％以上である場合に酵素分解処理を行い、または粗抽出物中のホモガラクツロン酸の含有量が７０％未満である場合に酵母発酵処理を行うことをさらに含む方法であって、
前記酵素分解処理には、ペクチンの最終濃度を２～５ｗｔ％に調整し、ｐＨ４．５で等電点脱タンパク質を行った後に、脱タンパク質で得られた生成物に固形化ペクチナーゼ（ただし、該固形化ペクチナーゼは、リアーゼ（ＰＬ、酵素活性が３２Ｕ/ｇ）、特異的エンドポリガラクツロナーゼ(Ｅｎｄｏ-ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅｓ、ｅｎｄｏ-ＰＧ、Ｅ.Ｃ.３.２.１.１５、４２１２Ｕ/ｇ)、ペクチンエステラーゼ(ＰＥ、Ｅ.Ｃ.３.１.１.１１、６６.７Ｕ/ｇ)及びプロトペクチナーゼを含む）を添加し、ｐＨを３．０～６．０に制御し、分解時間を少なくとも３０分間、例えば３０、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０分間以上とし、好ましく温度を少なくとも３７以上、例えば４０、４２、４５、５０、５５または６０°０とし、
前記酵母発酵処理には、ペクチンの最終濃度を２～５ｗｔ％に調整し、活性化されたサッカロミセス・セレビシエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）１～５ｗｔ％を加え、好ましく発酵温度を室温から３５まで、例えば３０°０とし、発酵時間を好ましく少なくとも１２時間、例えば１２、１８、２４、３６、４８時間以上とする、態様１から５のいずれか１項に記載の方法。
[態様７]
アルカリ性ｐＨがそれぞれ独立して、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＣａＯＨ及びそれらの混合物からなる群より選ばれる強アルカリ剤で達成され、および／または
酸性ｐＨがそれぞれ独立して、例えば塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、亜硫酸、酢酸及びそれらの混合物からなる群より選ばれる希酸で達成される、態様１から６のいずれか１項に記載の方法。
[態様８]
その中のガラクツロン酸の含有量が少なくとも９０％、例えば９３～９８％であり、エステル化度が例えば１２～１４％であり、かつ／または、分子量が３ｋＤａ～８ｋＤａであるオリゴガラクツロン酸多糖が得られる、態様１から７のいずれか１項に記載の方法。
[態様９]
態様１から８のいずれか１項に記載のオリゴガラクツロン酸多糖を含有する食用組成物であって、
好ましくは、態様１から８のいずれか１項に記載のオリゴガラクツロン酸多糖６１０～７１０重量部、ならびに
オウギ（ａｓｔｒａｇａｌｉ ｒａｄｉｘ）２５～３５重量部、炒りサンザシ（ｆｒｉｅｄ ｃｒａｔａｅｇｉｆｒｕｃｔｕｓ）５～２５重量部、赤いナツメ（ｊｕｊｕｂａｅ ｆｒｕｃｔｕｓ）５～２５重量部、及びチンピ（ｃｉｔｒｉ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａｅ ｐｅｒｉｃａｒｐｉｕｍ）６～２０重量部を含むか、それらの成分から調製される、食用組成物。
[態様１０]
オウギ、炒りサンザシ、赤いナツメ、チンピを前処理してから水に浸漬させ、少なくとも１５分間、例えば１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２０分間以上煮詰めた後、ろ過することによりエキスペーストを得る工程と、
前記エキスペーストとオリゴガラクツロン酸多糖とを混合して、前記食用組成物を得る工程とを含む、態様９に記載の組成物を調製するための方法。
[態様１１]
前記浸漬は、固液体積比が１：５～１５であり、浸漬時間が２０～６０分である、態様１０に記載の方法。
[態様１２]
慢性炎症関連の疾患を治療するために、好ましく医薬品、食品またはヘルスケア製品の形態として用いられる、態様１から８のいずれか１項に記載の方法によって調製されたオリゴガラクツロン酸多糖、態様９に記載の食用組成物。

Claims (12)

  1. ペクチンを含む果皮および／または果滓を提供する工程１と、
    工程１で得られた原料をアルカリ性水溶液と接触させてアルカリ処理を行い、混合物のｐＨを１１以上に維持して結合切断水溶性ペクチンゲルを得る工程２と、
    任意選択的に工程２で得られた結合切断水溶性ペクチンゲルを、ｐＨ９～１１、０～８℃温度下で少なくとも２時間続いて濃縮させた後、ｐＨを６～８の中性付近に調整し、前記結合切断水溶性ペクチンゲルに対して脱メトキシ基化処理を行うことで粗製脱メトキシ基化水溶性ペクチンゲルを得る工程３と、
    任意選択的にカチオン性交換樹脂を使用して、前記水溶性ペクチンゲルを粗抽出する工程４と、
    高分子量不純物を除去する工程５と、を含む方法であって、
    工程２において、前記アルカリ処理は、好ましくｐＨが１２～１３であり、好ましく少なくとも３０分間、例えば３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０分間続けられ、
    工程３において、前記濃縮は、好ましく凍結乾燥法で行われ、粗製ペクチンの濃度が好ましく少なくとも５ｇ／Ｌ、例えば１０、１５、２０、２５、３０または４０ｇ／Ｌ、具体的に１０～２０ｇ／Ｌの範囲になるまで行われ、好ましくｐＨを９～１０とし、好ましく２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、６０、又は７２時間以上続けられ、
    工程４において、前記カチオン性交換樹脂は、例えば、スルホン酸基又はＤＥＡＥ基を持つカチオン性交換樹脂であり、
    工程５において、前記高分子量不純物の除去には、好ましくカットオフ分子量が少なくとも１０３～１０４Ｄａである限外濾過膜を使用し、例えば、孔径が１～１０ｎｍであり、０．０５～０．５ＭＰａの低差圧を維持しながら高フラックスの抽出を維持し、カットオフ分子量が１０３～１０４Ｄａである限外濾過膜を使用する、オリゴガラクツロン酸多糖の調製方法。
  2. 工程２を実施する前に、前記果皮に対して酸処理を行うことで安定な水溶性ペクチンゲルを得ることをさらに含む方法であって、
    前記酸処理は、好ましくｐＨが５～６で行われ、好ましく１０～６０分間、例えば１０、１５、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７５、９０または１２０分間続けられる、請求項１に記載の方法。
  3. 工程２のアルカリ処理において、マイクロ波で好ましく少なくとも５０℃、例えば６０、７０、８０、９０または１００℃まで加熱することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 工程２のアルカリ処理を行う前またはその後に、セルラーゼ酵素分解処理を行うことをさらに含む方法であって、
    前記酵素分解処理は、好ましくセルラーゼ１～１０ｍｇ／ｇを添加し、酵素分解温度を室温から４０℃まで、例えば３８℃にした条件下で、少なくとも３０分間、例えば３０、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２０または１５０分間続けられる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記果皮および／または果滓は、柑橘類、ナシ類、ブドウ類、ウリ科、バショウ科の果実、又はヒマワリの花托に由来し、例えば、タンジェリン、ミカン、オレンジ、キンカン、レモン、ザボン、枳金柑（Ｃｉｔｒｕｍｑｕａｔ）、リンゴ、ナシ、ビワ、サンザシ、アンズ、プラム、ウメ、モモ、キウイ、バナナ、ブドウ、スイカ、ヒマワリに由来する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 工程４で得られた粗抽出物に対しては、該粗抽出物中のホモガラクツロン酸の含有量が７０％以上である場合に酵素分解処理を行い、または粗抽出物中のホモガラクツロン酸の含有量が７０％未満である場合に酵母発酵処理を行うことをさらに含む方法であって、
    前記酵素分解処理には、ペクチンの最終濃度を２～５ｗｔ％に調整し、ｐＨ４．５で等電点脱タンパク質を行った後に、脱タンパク質で得られた生成物に固形化ペクチナーゼ（ただし、該固形化ペクチナーゼは、リアーゼ（ＰＬ、酵素活性が３２Ｕ/ｇ）、特異的エンドポリガラクツロナーゼ(Ｅｎｄｏ-ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅｓ、ｅｎｄｏ-ＰＧ、Ｅ.Ｃ.３.２.１.１５、４２１２Ｕ/ｇ)、ペクチンエステラーゼ(ＰＥ、Ｅ.Ｃ.３.１.１.１１、６６.７Ｕ/ｇ)及びプロトペクチナーゼを含む）を添加し、ｐＨを３．０～６．０に制御し、分解時間を少なくとも３０分間、例えば３０、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０分間以上とし、好ましく温度を少なくとも３７以上、例えば４０、４２、４５、５０、５５または６０°０とし、
    前記酵母発酵処理には、ペクチンの最終濃度を２～５ｗｔ％に調整し、活性化されたサッカロミセス・セレビシエ（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）１～５ｗｔ％を加え、好ましく発酵温度を室温から３５まで、例えば３０°０とし、発酵時間を好ましく少なくとも１２時間、例えば１２、１８、２４、３６、４８時間以上とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. アルカリ性ｐＨがそれぞれ独立して、例えばＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＣａＯＨ及びそれらの混合物からなる群より選ばれる強アルカリ剤で達成され、および／または
    酸性ｐＨがそれぞれ独立して、例えば塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、亜硫酸、酢酸及びそれらの混合物からなる群より選ばれる希酸で達成される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. その中のガラクツロン酸の含有量が少なくとも９０％、例えば９３～９８％であり、エステル化度が例えば１２～１４％であり、かつ／または、分子量が３ｋＤａ～８ｋＤａであるオリゴガラクツロン酸多糖が得られる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 請求項１から８のいずれか１項に記載のオリゴガラクツロン酸多糖を含有する食用組成物であって、
    好ましくは、請求項１から８のいずれか１項に記載のオリゴガラクツロン酸多糖６１０～７１０重量部、ならびに
    オウギ（ａｓｔｒａｇａｌｉ ｒａｄｉｘ）２５～３５重量部、炒りサンザシ（ｆｒｉｅｄ ｃｒａｔａｅｇｉｆｒｕｃｔｕｓ）５～２５重量部、赤いナツメ（ｊｕｊｕｂａｅ ｆｒｕｃｔｕｓ）５～２５重量部、及びチンピ（ｃｉｔｒｉ ｒｅｔｉｃｕｌａｔａｅ ｐｅｒｉｃａｒｐｉｕｍ）６～２０重量部を含むか、それらの成分から調製される、食用組成物。
  10. オウギ、炒りサンザシ、赤いナツメ、チンピを前処理してから水に浸漬させ、少なくとも１５分間、例えば１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、６０、７０、７５、８０、９０、１００、１２０分間以上煮詰めた後、ろ過することによりエキスペーストを得る工程と、
    前記エキスペーストとオリゴガラクツロン酸多糖とを混合して、前記食用組成物を得る工程とを含む、請求項９に記載の組成物を調製するための方法。
  11. 前記浸漬は、固液体積比が１：５～１５であり、浸漬時間が２０～６０分である、請求項１０に記載の方法。
  12. 慢性炎症関連の疾患を治療するために、好ましく医薬品、食品またはヘルスケア製品の形態として用いられる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法によって調製されたオリゴガラクツロン酸多糖、請求項９に記載の食用組成物。
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