CN104873533A

CN104873533A - 小分子柑橘果胶的用途

Info

Publication number: CN104873533A
Application number: CN201510217571.5A
Authority: CN
Inventors: 袁瑛; 张苏展; 沈彦伟; 谭纯文; 李晶晶; 曹莹; 郑树
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2015-09-02

Abstract

本发明公开了一种小分子柑橘果胶的新用途，利用小分子柑橘果胶制备具有免疫调节、协同化疗药物增效减毒的抗肿瘤辅助药物，或具有抗肿瘤辅助作用的保健品。该化合物单独使用时并不直接杀伤肿瘤细胞，不具备抗肿瘤作用，但其可作为辅助药物，协同化疗药物使用，能通过其拮抗免疫细胞表面及肿瘤组织细胞表面的配体而发挥对T细胞、MDSC细胞的免疫调节功能，辅助增强抗肿瘤效应，实现对肿瘤化疗的增敏、减毒功效。本发明对已知化合物——小分子柑橘果胶发掘了新的医疗用途，开辟了一个新的应用领域。

Description

小分子柑橘果胶的用途

技术领域

本发明涉及小分子柑橘果胶的用途，尤其涉及一种小分子柑橘果胶的新用途。

背景技术

柑橘果胶的开发和利用已有较长历史，在明朝李时珍《本草纲目》中就有记录：“橘皮，苦能泻能燥，辛能散，温能和，其治百病，总是取其理气燥湿之功。”经晒干或者阴干干制以后的中药陈皮，有理气健脾、温胃散寒、燥湿化痰的功效。小分子柑橘果胶（Low-molecular-weight Citrus Pectin，LCP）是美国圣特莱公司继以橘皮为原料的“改良果胶”（Modified citrus pectin，MCP）之后的第二代产品。（Pratima Nangia-Makker, Victor Hogan, Yuichiro Honjo, Sara Baccarini, Larry Tait, Robert Bresalier, Avraham Raz. Inhibition of Human Cancer Cell Growth and Metastasis in Nude Mice by Oral Intake of Modified Citrus Pectin. J Natl Cancer Inst, Vol. 94, No. 24, December 18, 2002.）小分子柑橘果胶为柑橘果胶水解降酯后生成的一种水溶性小分子量、无支链纤维多糖及糖蛋白，化学成分均一，可口服吸收。其化学结构式如下：

已知的小分子柑橘果胶作为保健食品主要作用为：通过肠道排除铅等重金属；调节胃肠道功能，改善便秘、腹泻等症状；控制血糖、血脂和血压；护胃、解酒等。小分子柑橘果胶对糖、脂代谢的调节作用及螯合体内重金属驱铅排铅等功能，在已有的专利及文献中得到过详细阐述，此处不再赘述。然而，尚未看到小分子柑橘果胶应用于抗肿瘤制药领域的报道，更未涉及过小分子柑橘果胶可具有免疫调节功能，及对联合化疗时达到化疗药物增敏减毒作用，辅助增强抗肿瘤效应、减低化疗毒副作用的功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种小分子柑橘果胶的新用途，利用小分子柑橘果胶制备具有免疫调节、协同化疗药物增效减毒的抗肿瘤辅助药物，或保健品。

本发明的小分子柑橘果胶的新用途：所述的小分子柑橘果胶作为原料用于制备抗肿瘤辅助药物的用途；或者所述的小分子柑橘果胶作为原料用于制备具有抗肿瘤辅助作用的保健品的用途。

本发明所述的“辅助”是指：该化合物单独使用时并不直接杀伤肿瘤细胞，不具备抗肿瘤作用，但其可作为辅助药物，协同化疗药物使用，能通过其拮抗免疫细胞表面及肿瘤组织细胞表面的配体Galectin-3而发挥对T细胞、MDSC细胞的免疫调节功能，辅助增强抗肿瘤效应，实现对肿瘤化疗的增敏、减毒功效。

实验部分

下列实验部分中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人编著的《分子克隆：实验手册》中所述的实验条件，或按照试剂或试剂盒制造商提供的实验条件。

1、LCP对细胞的毒杀作用实验

（1）在96孔细胞培养板内无菌接种Balb/c小鼠乳腺癌4T1细胞，每孔接种0.1 ml含1×10⁵ 细胞完全细胞培养液1640。

（2）每孔加入0.1 ml含不同浓度LCP（0-100 ug/ml）的完全细胞培养液1640，与细胞混匀后，将细胞放入37℃细胞培养箱内（含5％CO₂）培养48小时。

（3）终止细胞培养，用MTT法测定培养细胞活力。

结果发现：如图1（a）所示，LCP浓度梯度对4T1细胞作用后细胞生存率曲线，未见LCP明显细胞毒作用。

2、LCP与化疗药物体外共同使用时，对细胞毒杀作用实验

（1）在96孔细胞培养板内无菌接种Balb/c小鼠乳腺癌细胞4T1，每孔接种0.1 ml含1×10⁵ 细胞及固定浓度的LCP（10ug/ml）完全细胞培养液1640。

（2）每孔加入0.1 ml含不同浓度5-氟尿嘧啶（5-FU，0-10uM）的完全细胞培养液1640，与细胞混匀后，将细胞放入37℃细胞培养箱内（含5％CO₂）培养48小时。

（3）终止细胞培养，用MTT法测定培养细胞活力。

（4）同时设置两组其他化疗药物实验组，均只改变步骤（2）中化疗药物的种类及浓度，一组为每孔加入0.1ml含不同浓度阿霉素（DOX）（0-2.5 uM）的完全细胞培养液1640，另一组为每孔加入0.1ml含不同浓度紫杉醇（TAX）（0-25 uM）的完全细胞培养液1640，其他步骤均相同。

结果发现：三组结果分别如图1（b）、（c）和（d）所示：LCP联合不同化疗药物5-FU、阿霉素、紫杉醇对照5-FU体外使用时，（b）细胞生存率曲线显示LCP对5-FU无明显细胞毒增敏作用；（c）细胞生存率曲线显示LCP对DOX无明显细胞毒增敏作用；（d）细胞生存率曲线显示LCP对TAX无明显细胞毒增敏作用。

3、LCP的T细胞免疫调节实验

（1）在48孔细胞培养板内无菌接种小鼠脾脏细胞，每孔接种1 ml含1×10⁶ 细胞完全细胞培养液1640。

（2）每孔加入不同浓度LCP，与细胞混匀后，将细胞放入37℃细胞培养箱内（含5％CO₂）培养5天。

（3）终止细胞培养，用流式细胞术观察CD4⁺ T淋巴细胞IFNγ和IL-17a释放能力。

（4） 10ug/ml浓度的LCP诱导小鼠淋巴细胞分化效果如图2所示。

结果发现：经不同浓度LCP处理可见表达IFNγ的Th1型辅助T淋巴细胞和分泌IL-17a的Th17型辅助T淋巴细胞增加，即LCP 能诱导Treg转分化为Th1、Th17辅助细胞。

4、LCP与化疗药物抗肿瘤体内实验

（1）取Balb/c雌性小鼠32只，随机分为4组（生理盐水阴性对照组、5-FU单药、LCP、5-FU联合LCP组）：每只小鼠在左腋下乳腺脂肪垫处接种1×10⁶ 4T1小鼠乳腺癌细胞，饲养1周后，肿瘤体积可达约100cm³。

（2）阴性生理盐水对照组（简称NS 组）8只，每周一次皮下注射生理盐水，连续21天记录肿瘤长径和短径；

（3）阳性化疗药对照组（5-FU组）8只，按20mg/kg 剂量每三日腹腔注射5-FU溶液，连续21天记录肿瘤长径和短径；

（4）实验1 组（LCP单药组）8只，2g/kg·d，每日灌胃，连续21天记录肿瘤长径和短径；

（5）实验2 组（5-FU+LCP组）8只，小鼠按前述两种药物剂量规律给药，连续21天记录肿瘤长径和短径。

（6）根据实测肿瘤体积变化总结的肿瘤生长曲线实验结果，详见图3所示；实验结束后，各组小鼠完整切除肿瘤组织的大小比对，详见图4所示。

结果发现：LCP与5-FU联用，可以明显增强5-FU的抗肿瘤效果。

5、LCP的MDSC细胞免疫调节实验

（1）在上述实验4中，第24天实验结束时，将荷瘤小鼠无菌条件下解剖，取不同组（生理盐水阴性对照组、5-FU单药、LCP、5-FU联合LCP组）的增大的脾脏。

（2）研磨提取脾脏浸润细胞，以CD11b及Gr-1两种抗体标记MDSC细胞，经流式细胞仪检测。

（3）实验结果详见图5。

结果发现：生理盐水阴性处理组，其脾脏内MDSC细胞比例在41%左右，5-FU单药处理组MDSC比例仍高于40%，LCP单药处理能下调MDSC至23%左右，而5-FU联合LCP处理组能将MDSC下调至24%左右。可见LCP灌胃，能够显著降低小鼠脾脏中MDSC细胞水平。

6、在联合化疗药物治疗小鼠乳腺癌4T1细胞移植瘤模型中，化疗血液学毒性分析。

（1）取Balb/c雌性小鼠32只，随机分为4组：每只小鼠在左腋下乳腺脂肪垫处接种1×10⁶ 4T1小鼠乳腺癌细胞，饲养1周后，肿瘤体积可达约100cm³。

（2）阴性生理盐水对照组（简称NS 组）8只，每周一次皮下注射生理盐水；

（3）阳性化疗药对照组（5-FU组）8只，按20mg/kg 剂量每三日腹腔注射5-FU溶液；

（4）胸腺肽（THN）对照组（THN组）8只，按200ug/kg·d，每三日腹腔注射；

（5）实验1 组（LCP单药组）8只，2g/kg·d，每日灌胃；

（6）实验2 组（5-FU+LCP组）8只，小鼠按前述两种药物剂量规律给药；

（7）实验3 组（5-FU+THN组）8只，小鼠按前述两种药物剂量规律给药。

（8）实验终点时，断颈处死小鼠，提取外周血进行血常规分析。

结果发现：如图6所示，在荷瘤小鼠中，5-FU会导致明显的粒细胞缺乏，而联用LCP能够显著提升中性粒细胞百分数，甚至优于临床常用免疫辅助药物胸腺肽。

7、在联合化疗药物治疗小鼠乳腺癌4T1细胞移植瘤模型中，肝脏肝功能代谢酶指标无明显升高，没有明显肝脏毒性。

（1）取Balb/c雌性小鼠32只，随机分为4组：每只小鼠在左腋下乳腺脂肪垫处接种1×106 4T1小鼠乳腺癌细胞，饲养1周后，肿瘤体积可达约100cm³。

（4） THN对照组（THN组）8只，按200ug/kg·d，每三日腹腔注射；

（5）实验1 组（LCP单药组）8只，2g/kg·d，每日灌胃；

（8）实验终点时，断颈处死小鼠，提取外周血血清进行肝功能分析。

结果发现：如图7所示，在荷瘤小鼠中，（a）相对于胸腺肽（THN）对照组，LCP单用或化疗、LCP联合使用，未明显增加小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）浓度；（b）相对于胸腺肽（THN）对照组，LCP单用或化疗、LCP联合使用，未明显增加小鼠血清谷草转氨酶（AST）浓度。可见，化疗药物联用LCP未见明显的ALT、AST等肝酶升高，未见引起明显肝功能损害。

由上可知，本发明的显著优点在于：

本发明对已知化合物——小分子柑橘果胶发掘了新的医疗用途，开辟了一个新的应用领域。本发明通过研究发现小分子柑橘果胶在小鼠体内，几乎无毒、副作用，其具有的调节免疫细胞分化作用，能提升中性粒细胞水平，进而可协同化疗药物增加抗肿瘤效果、减轻化疗毒副反应，从而有效抑制肿瘤增殖速度。此外，本发明的小分子柑橘果胶作为抗肿瘤辅助药物，协同化疗药物共同使用时，不会引起肝脏酶学升高，保护肝功能。

附图说明

图1是实验1和2的实验结果曲线，

其中：（a）为不同浓度的LCP对4T1小鼠乳腺癌细胞毒杀作用结果，

（b）为LCP与5-FU体外共同使用时对4T1小鼠乳腺癌细胞毒杀作用结果，

（c）为LCP与DOX体外共同使用时对4T1小鼠乳腺癌细胞毒杀作用结果，

（d）为LCP与TAX体外共同使用时对4T1小鼠乳腺癌细胞毒杀作用结果。

图2是实验3中10ug/ml浓度的LCP诱导小鼠淋巴细胞分化结果图，其中，（a）为生理盐水对照组，（b）为LCP处理组。

图3是实验4中肿瘤生长曲线。

图4是实验4中实验结束后，各组小鼠完整切除肿瘤组织的大小比对图。

图5是实验5的LCP的MDSC细胞免疫调节实验结果图。

图6是实验6中不同处理组对中性粒细胞的影响图。

图7是实验7中不同处理组对肝脏毒性的影响图，其中：（a）为ALT水平图，（b）为AST水平图。

具体实施方式

实施例1

购买美国圣特莱公司的小分子柑橘果胶粉剂，直接作为抗肿瘤、提高免疫功能的保健品，取15g分三次/日服用，每5g可溶于50-200ml热水中，混合均匀后，直接饮用，或添加至果汁、果泥中食用均可。

实施例2

购买美国圣特莱公司的小分子柑橘果胶粉剂，使用食用明胶制成的胶囊材料，灌装制备成胶囊剂，制成提高免疫功能、具有抗肿瘤活性的肿瘤化疗辅助用药，分三次/日服用，达到每日口服有效剂量为15g即可。

实施例3

按质量百分数取小分子柑橘果胶90%、甘草5%、山楂粉5%，按公知的制片技术和装备制成片剂，即取上述配方中所有成分混合均匀，冲压成片，制成提高免疫功能、具有抗肿瘤活性的肿瘤化疗辅助用药，达到每日口服有效剂量为15g即可。

Claims

1. 小分子柑橘果胶的用途，其特征在于，所述的小分子柑橘果胶作为原料用于制备调节抗肿瘤免疫的辅助药物的用途。

2. 根据权利要求1所述的小分子柑橘果胶的用途，其特征在于，所述的小分子柑橘果胶作为原料用于制备抗肿瘤的辅助药物的用途。

3. 小分子柑橘果胶的用途，其特征在于，所述的小分子柑橘果胶作为原料用于制备具有抗肿瘤辅助作用的保健品的用途。