CN110951804B - 提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖的制备方法，包括以下步骤：步骤一、将苹果粉溶解于水中进行酶解，减压浓缩并提纯，得到果胶提取液；步骤二、向果胶提取液中加入果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶进行一次定向酶切，然后加入半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶进行二次定向酶切，再加入聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶进行三次定向酶切，得到改性果胶提取液；步骤三、将改性果胶提取液经纯化处理，得到苹果果胶杂多糖。本发明通过三次定向酶切得到中性糖比例高、甲酯化度低、乙酰化度低的苹果果胶杂多糖，该苹果果胶杂多糖可有效提高肠道菌群的多样性、24h内在肠道中微生物发酵降解率高于80％。

Description

提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖及其制备方法
技术领域
本发明涉及食品加工领域。更具体地说，本发明涉及一种提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖及其制备方法。
背景技术
果胶是一类植物细胞壁中富含半乳糖醛酸的酸性杂多糖，是一类重要的水溶性膳食纤维。苹果果胶是一种典型的杂多糖，除聚半乳糖醛酸(HG)结构外，还包含鼠李半乳糖醛酸聚糖I型(RG-I)、鼠李半乳糖醛酸聚糖II型(RG-II)、木糖半乳糖醛酸聚糖(XGA)等结构单元，这些结构单元由至少20种以上糖苷键连结。相对于半乳糖醛酸，这些组成果胶的单糖被称为中性糖，即便是肠道微生物也难以将其轻易降解。其中，鼠李半乳糖醛酸聚糖II型(RG-II)结构域单元的单糖组成最为复杂，将其降解需要多种酶参与，因此也有可能诱导多种有益微生物增殖，这种果胶杂多糖是潜在的高效益生元。
目前商业化苹果果胶大多通过酸提醇沉工艺获得。这种果胶的益生功效发挥仍不充分，主要是以下原因：一是果胶分子量太高，肠道微生物发酵速度慢，特别是在盲肠中的降解比例低；二是甲酯化度、乙酰化度高，限制了肠道微生物分泌的多聚半乳糖醛酸酶PG的酶切效率，这也降低了发酵速率；三是中性糖比例相对较低，由此导致少数优势均属大量增殖，结果是菌群增殖种属较为单一。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖的制备方法，其通过三次定向酶切得到中性糖比例高、甲酯化度低、乙酰化度低的苹果果胶杂多糖。
本发明还有一个目的是提供一种提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖，该苹果果胶杂多糖可有效提高肠道菌群的多样性、24h内在肠道中微生物发酵降解率高于80％。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将苹果粉溶解于水中进行酶解，减压浓缩并提纯，得到果胶提取液；
步骤二、向果胶提取液中加入果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶进行一次定向酶切，然后加入半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶进行二次定向酶切，再加入聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶进行三次定向酶切，得到改性果胶提取液；
步骤三、将改性果胶提取液经纯化处理，得到苹果果胶杂多糖。
优选的是，步骤一中，减压浓缩后得到浓缩物，将浓缩物提纯的方法为：向浓缩物中加入其总质量3-9倍量的质量分数为95％的乙醇，搅拌5-15min，过滤得到第一滤渣，然后向第一滤渣中加入浓缩物总质量3-7倍量的质量分数为95％的乙醇，过滤得到第二滤渣，向第二滤渣中加入其总质量20-50倍量的丙酮中混合，过滤得到第三滤渣，向第三滤渣中加入其总质量70-110倍量的水，置于85-95℃条件下搅拌1-9min，过滤，得到果胶提取液。
优选的是，步骤一中将苹果粉溶解于其总质量5-15倍量的水中，然后置于86-96℃条件下保温5-15min再进行酶解，酶解的方法包括以下步骤：
A1、调节体系pH为5.5-6.5，添加α-淀粉酶并置于60-70℃条件下酶解0.5-1.5h；
A2、调节体系pH为7-8，添加蛋白酶并置于55-65℃条件下酶解0.5-1.5h；
A3、调节体系pH为4-4.6，添加淀粉葡萄糖苷酶并置于50-70℃条件下酶解0.5-1.5h；
A4、调节体系pH为5-6，添加纤维素酶并置于40-60℃条件下酶解1-3h，然后置于86-96℃条件下静置5-15min，酶解完成；
其中，按苹果粉溶解于水后所得到的体系量计，α-淀粉酶的添加量为450-550U/mL，蛋白酶的添加量为50-71.5U/mL，淀粉葡萄糖苷酶的添加量为200-400U/mL，纤维素酶的添加量为10-30U/mL。
优选的是，步骤A4中的纤维素酶为β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶。
优选的是，步骤二中，一次定向酶切的条件为：果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶的添加量均为1-3U/ml，温度为27-47℃，时间为1-2h；二次定向酶切的条件为：半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶的添加量均为50-150U/mL，温度为27-47℃，时间为1-3h；三次定向酶切的条件为：聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶的添加量均为5-35U/mL，温度为27-47℃，时间为4-6h，其中，添加量按果胶提取液的量计。
优选的是，步骤三中纯化处理的方法为：将改性果胶提取液经动态高压微射流处理后加入乙醇进行沉淀，收集沉淀物，将沉淀物复溶后依次进行超滤、透析、浓缩、干燥，得到苹果果胶杂多糖，其中，动态高压微射流处理时压力为300-600MPa，循环次数1-5次；超滤的方法为：使用截留分子量为7500Da的聚砜膜进行抽滤处理；透析的条件为：孔隙度为5000Da，透析时间为12-36h。
优选的是，步骤三中改性果胶提取液在进行动态高压微射流处理前先进行灭酶处理，灭酶处理的方法为：将改性果胶提取液置于96℃条件下加热5-15min。
一种提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖，所述苹果果胶杂多糖由权利要求1-7中任意一项所述的提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖的制备方法制备而得。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明制得的苹果果胶杂多糖，可显著提高肠道内微生物菌群的多样性，特别是提高特定的有益“生态功能菌群”(如双歧杆菌、乳酸菌和拟杆菌)丰度，抑制有害菌群增殖，可用于改善肠道微生物菌群结构。经体外肠道微生物发酵和动物试验验证，该苹果果胶杂多糖对提高肠道菌群多样性的效果显著高于商品苹果果胶以及本发明提及的其他果胶多糖或低聚糖，经24h肠道微生物发酵后降解率高于80％，是一种高效的肠道益生元。
第二、本发明制得的苹果果胶杂多糖，中性糖比例高，发酵速率适中，其益生效果可同时作用于肠道不同部位。具体来说，小鼠动物试验结果表明，本发明苹果果胶杂多糖，可以同时作用于盲肠，以及升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠等不同结肠部位，显著降低上述不同部位肠道内容物pH值，并提升不同部位肠道内容物种短链脂肪酸含量，由此发挥对这些不同部位肠道的益生功效。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
<实施例1>
提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将苹果粉溶解于水中进行酶解，减压浓缩并提纯，得到果胶提取液，其中，苹果粉的制备方法为：将苹果去皮、去核后打浆，再经干燥、粉碎、过40目筛，即得到苹果粉，酶解本领域技术人员可根据常规技术采用α-淀粉酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖酶、纤维素酶中的一种；提纯可采用常规技术乙醇进行沉淀。
步骤二、向果胶提取液中加入果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶进行一次定向酶切，然后加入半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶进行二次定向酶切，再加入聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶进行三次定向酶切，得到改性果胶提取液，其中，一次定向酶切、二次定向酶切、三次定向酶切的条件本领域技术人员可根据酶的常规使用条件进行添加和设定酶切时间；
步骤三、将改性果胶提取液经纯化处理，得到苹果果胶杂多糖，其中，纯化处理本领域技术人员可采用乙醇沉淀进行纯化。
<实施例2>
提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将苹果粉溶解于水中进行酶解，减压浓缩并提纯，得到果胶提取液，其中，苹果粉的制备方法为：将苹果去皮、去核后打浆，再经干燥、粉碎、过60目筛，即得到苹果粉，酶解本领域技术人员可根据常规技术采用α-淀粉酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖酶、纤维素酶中的一种；提纯可采用常规技术乙醇进行沉淀。
步骤二、向果胶提取液中加入果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶进行一次定向酶切，然后加入半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶进行二次定向酶切，再加入聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶进行三次定向酶切，得到改性果胶提取液，一次定向酶切的条件为：果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶的添加量均为0.5U/ml，温度为27℃，时间为1h；二次定向酶切的条件为：半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶的添加量均为50U/mL，温度为27℃，时间为1h；三次定向酶切的条件为：聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶的添加量均为5U/mL，温度为27℃，时间为4h，其中，添加量按果胶提取液的量计；
步骤三、将改性果胶提取液经纯化处理，得到苹果果胶杂多糖，其中，纯化处理本领域技术人员可采用乙醇沉淀进行纯化。
<实施例3>
步骤一、将苹果粉溶解于水中进行酶解，减压浓缩并提纯，得到果胶提取液，其中，苹果粉的制备方法为：将苹果去皮、去核后打浆，再经干燥、粉碎、过50目筛，即得到苹果粉，酶解本领域技术人员可根据常规技术采用α-淀粉酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖酶、纤维素酶中的一种；提纯可采用常规技术乙醇进行沉淀。
步骤二、向果胶提取液中加入果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶进行一次定向酶切，然后加入半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶进行二次定向酶切，再加入聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶进行三次定向酶切，得到改性果胶提取液，一次定向酶切的条件为：果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶的添加量均为1.5U/ml，温度为37℃，时间为1.5h；二次定向酶切的条件为：半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶的添加量均为100U/mL，温度为37℃，时间为3h；三次定向酶切的条件为：聚鼠李半乳糖醛酸酶的添加量为20U/mL、木糖基半乳糖醛酸酶的添加量为15U/mL、半乳聚糖酶的添加量为10U/mL、阿拉伯聚糖酶的添加量为10U/mL，温度为37℃，时间为5h，其中，添加量按果胶提取液的量计；
步骤三、将改性果胶提取液经纯化处理，得到苹果果胶杂多糖，其中，纯化处理本领域技术人员可采用乙醇沉淀进行纯化。
<实施例4>
提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将苹果粉溶解于水中进行酶解，减压浓缩并提纯，得到果胶提取液，其中，苹果粉的制备方法为：将苹果去皮、去核后打浆，再经干燥、粉碎、过60目筛，即得到苹果粉，酶解本领域技术人员可根据常规技术采用α-淀粉酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖酶、纤维素酶中的一种；提纯可采用常规技术乙醇进行沉淀。
步骤二、向果胶提取液中加入果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶进行一次定向酶切，然后加入半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶进行二次定向酶切，再加入聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶进行三次定向酶切，得到改性果胶提取液，一次定向酶切的条件为：果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶的添加量均为3U/ml，温度为47℃，时间为2h；二次定向酶切的条件为：半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶的添加量均为150U/mL，温度为47℃，时间为3h；三次定向酶切的条件为：聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶的添加量均为35U/mL，温度为47℃，时间为6h，其中，添加量按果胶提取液的量计；
步骤三、将改性果胶提取液经纯化处理，得到苹果果胶杂多糖，其中，纯化处理本领域技术人员可采用乙醇沉淀进行纯化。
<实施例5>
步骤一、将苹果粉溶解于其总质量5倍量的水中，然后置于86℃条件下保温5min再进行酶解，减压浓缩并提纯，得到果胶提取液，其中，苹果粉的制备方法为：将苹果去皮、去核后打浆，再经干燥、粉碎、过50目筛，即得到苹果粉；减压浓缩后得到浓缩物，将浓缩物提纯的方法为：向浓缩物中加入其总质量3倍量的质量分数为95％的乙醇，搅拌5min，过滤得到第一滤渣，然后向第一滤渣中加入浓缩物总质量3倍量的质量分数为95％的乙醇，过滤得到第二滤渣，向第二滤渣中加入其总质量20倍量的丙酮中混合，过滤得到第三滤渣，向第三滤渣中加入其总质量70倍量的水，置于85℃条件下搅拌1min，过滤，即得到果胶提取液；酶解的方法包括以下步骤：
A1、调节体系(使用1M的盐酸调节)pH为5.5，添加α-淀粉酶并置于60℃条件下酶解0.5h；
A2、调节体系(使用2M的氢氧化钠溶液)pH为7，添加蛋白酶并置于55℃条件下酶解0.5h；
A3、调节体系(使用2M的盐酸)pH为4，添加淀粉葡萄糖苷酶并置于50℃条件下酶解0.5h；
A4、调节体系(使用2M的氢氧化钠溶液)pH为6，添加纤维素酶并置于60℃条件下酶解1-3h，然后置于86℃条件下静置5min，酶解完成，纤维素酶为β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶；
其中，按苹果粉溶解于水后所得到的体系量计，α-淀粉酶的添加量为450U/mL，蛋白酶的添加量为50U/mL，淀粉葡萄糖苷酶的添加量为200-U/mL，纤维素酶的添加量为10U/mL；
步骤二、向果胶提取液中加入果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶进行一次定向酶切，然后加入半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶进行二次定向酶切，再加入聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶进行三次定向酶切，得到改性果胶提取液，一次定向酶切的条件为：果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶的添加量均为1.5U/ml，温度为37℃，时间为1.5h；二次定向酶切的条件为：半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶的添加量均为100U/mL，温度为37℃，时间为3h；三次定向酶切的条件为：聚鼠李半乳糖醛酸酶的添加量为20U/mL、木糖基半乳糖醛酸酶的添加量为15U/mL、半乳聚糖酶的添加量为10U/mL、阿拉伯聚糖酶的添加量为10U/mL，温度为37℃，时间为5h，其中，添加量按果胶提取液的量计；
步骤三、将改性果胶提取液经动态高压微射流处理后加入乙醇进行沉淀，收集沉淀物，将沉淀物复溶后依次进行超滤、透析、浓缩、干燥，得到苹果果胶杂多糖，其中，动态高压微射流处理时压力为300MPa，循环次数1次；超滤的方法为：使用截留分子量为7500Da的聚砜膜进行抽滤处理；透析的条件为：孔隙度为5000Da，透析时间为12h；，得到苹果果胶杂多糖；沉淀物用水复溶；改性果胶提取液在进行动态高压微射流处理前先进行灭酶处理，灭酶处理的方法为：将改性果胶提取液置于96℃条件下加热5min。
<实施例6>
步骤一、将苹果粉溶解于其总质量10倍量的水中，然后置于96℃条件下保温15min再进行酶解，减压浓缩并提纯，得到果胶提取液，其中，苹果粉的制备方法为：将苹果去皮、去核后打浆，再经干燥、粉碎、过50目筛，即得到苹果粉；减压浓缩后得到浓缩物，将浓缩物提纯的方法为：向浓缩物中加入其总质量5倍量的质量分数为95％的乙醇，搅拌10min，过滤得到第一滤渣，然后向第一滤渣中加入浓缩物总质量6倍量的质量分数为95％的乙醇，过滤得到第二滤渣，向第二滤渣中加入其总质量30倍量的丙酮中混合，过滤得到第三滤渣，向第三滤渣中加入其总质量90倍量的水，置于90℃条件下搅拌5min，过滤，即得到果胶提取液；酶解的方法包括以下步骤：
A1、调节体系(使用1M的盐酸调节)pH为6，添加α-淀粉酶并置于65℃条件下酶解1h；
A2、调节体系(使用2M的氢氧化钠溶液)pH为7.5，添加蛋白酶并置于60℃条件下酶解1h；
A3、调节体系(使用2M的盐酸)pH为4.3，添加淀粉葡萄糖苷酶并置于60℃条件下酶解1h；
A4、调节体系(使用2M的氢氧化钠溶液)pH为5.0，添加纤维素酶并置于50℃条件下酶解2h，然后置于96℃条件下静置10min，酶解完成，纤维素酶为β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶；
其中，按苹果粉溶解于水后所得到的体系量计，α-淀粉酶的添加量为500U/mL，蛋白酶的添加量为61.5U/mL，淀粉葡萄糖苷酶的添加量为300U/mL，纤维素酶的添加量为20U/mL；
步骤二、向果胶提取液中加入果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶进行一次定向酶切，然后加入半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶进行二次定向酶切，再加入聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶进行三次定向酶切，得到改性果胶提取液，一次定向酶切的条件为：果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶的添加量均为1.5U/ml，温度为37℃，时间为1.5h；二次定向酶切的条件为：半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶的添加量均为100U/mL，温度为27-47℃，时间为2-4h；三次定向酶切的条件为：聚鼠李半乳糖醛酸酶的添加量为20U/mL、木糖基半乳糖醛酸酶的添加量为15U/mL、半乳聚糖酶的添加量为10U/mL、阿拉伯聚糖酶的添加量为10U/mL，温度为37℃，时间为5h，其中，添加量按果胶提取液的量计；
步骤三、将改性果胶提取液经动态高压微射流处理后加入乙醇进行沉淀，收集沉淀物，将沉淀物复溶后依次进行超滤、透析、浓缩、干燥，得到苹果果胶杂多糖，其中，动态高压微射流处理时压力为450MPa，循环次数2次；超滤的方法为：使用截留分子量为7500Da的聚砜膜进行抽滤处理；透析的条件为：孔隙度为5000Da，透析时间为24h；沉淀物用水复溶；改性果胶提取液在进行动态高压微射流处理前先进行灭酶处理，灭酶处理的方法为：将改性果胶提取液置于96℃条件下加热10min。
<实施例7>
步骤一、将苹果粉溶解于其总质量15倍量的水中，然后置于90℃条件下保温15min再进行酶解，减压浓缩并提纯，得到果胶提取液，其中，苹果粉的制备方法为：将苹果去皮、去核后打浆，再经干燥、粉碎、过50目筛，即得到苹果粉；减压浓缩后得到浓缩物，将浓缩物提纯的方法为：向浓缩物中加入其总质量7倍量的质量分数为95％的乙醇，搅拌15min，过滤得到第一滤渣，然后向第一滤渣中加入浓缩物总质量9倍量的质量分数为95％的乙醇，过滤得到第二滤渣，向第二滤渣中加入其总质量50倍量的丙酮中混合，过滤得到第三滤渣，向第三滤渣中加入其总质量110倍量的水，置于95℃条件下搅拌9min，过滤，即得到果胶提取液；酶解的方法包括以下步骤：
A1、调节体系(使用1M的盐酸调节)pH为6.5，添加α-淀粉酶并置于70℃条件下酶解1.5h；
A2、调节体系(使用2M的氢氧化钠溶液)pH为8，添加蛋白酶并置于65℃条件下酶解1.5h；
A3、调节体系(使用2M的盐酸)pH为4.6，添加淀粉葡萄糖苷酶并置于70℃条件下酶解1.5h；
A4、调节体系(使用2M的氢氧化钠溶液)pH为6，添加纤维素酶并置于60℃条件下酶解3h，然后置于90℃条件下静置15min，酶解完成，纤维素酶为β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶；
其中，按苹果粉溶解于水后所得到的体系量计，α-淀粉酶的添加量为550U/mL，蛋白酶的添加量为71.5U/mL，淀粉葡萄糖苷酶的添加量为400U/mL，纤维素酶的添加量为30U/mL；
步骤二、向果胶提取液中加入果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶进行一次定向酶切，然后加入半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶进行二次定向酶切，再加入聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶进行三次定向酶切，得到改性果胶提取液，一次定向酶切的条件为：果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶的添加量均为1.5U/ml，温度为37℃，时间为1.5h；二次定向酶切的条件为：半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶的添加量均为100U/mL，温度为37℃，时间为3h；三次定向酶切的条件为：聚鼠李半乳糖醛酸酶的添加量为20U/mL、木糖基半乳糖醛酸酶的添加量为15U/mL、半乳聚糖酶的添加量为10U/mL、阿拉伯聚糖酶的添加量为10U/mL，温度为37℃，时间为5h，其中，添加量按果胶提取液的量计；
步骤三、将改性果胶提取液经动态高压微射流处理后加入乙醇进行沉淀，收集沉淀物，将沉淀物复溶后依次进行超滤、透析、浓缩、干燥，得到苹果果胶杂多糖，其中，动态高压微射流处理时压力为600MPa，循环次数5次；超滤的方法为：使用截留分子量为7500Da的聚砜膜进行抽滤处理；透析的条件为：孔隙度为5000Da，透析时间为36h；，得到苹果果胶杂多糖；沉淀物用水复溶；改性果胶提取液在进行动态高压微射流处理前先进行灭酶处理，灭酶处理的方法为：将改性果胶提取液置于96℃条件下加热15min。
<对比例1>
按照商业化酸提醇沉工艺制备的商品苹果果胶，未对其进行任何结构改性处理。
<对比例2>
采用实施例6的方法制备苹果果胶杂多糖，其中，不同的是：步骤一中将苹果粉溶于水即得到果胶提取液，步骤三具体为：将改性果胶提取液经动态高压微射流处理后加入乙醇进行沉淀，收集沉淀物，将沉淀物复溶后依次进行浓缩、干燥，得到苹果果胶杂多糖。
<对比例3>
采用实施例6的方法制备苹果果胶杂多糖，其中，不同的是：步骤二中向果胶提取液中加入半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶进行二次定向酶切，再加入聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶进行三次定向酶切，得到改性果胶提取液，二次定向、三次定向酶切的条件与实施例6相同，步骤三中使用截留分子量为20KDa的聚砜膜进行抽滤处理。
<对比例4>
采用实施例6的方法制备苹果果胶杂多糖，其中，不同的是：向果胶提取液中加入果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶进行一次定向酶切，然后加入聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶进行三次定向酶切，得到改性果胶提取液。
<对比例5>
采用实施例6的方法制备苹果果胶杂多糖，其中，不同的是：向果胶提取液中加入果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶进行一次定向酶切，然后加入半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶进行二次定向酶切，得到改性果胶提取液，步骤三中使用截留分子量为50KDa的聚砜膜进行抽滤处理；
<对比例6>
采用实施例6的方法制备苹果果胶杂多糖，其中，不同的是：步骤三为将改性果胶提取液使用截留分子量为20KDa的聚砜膜进行抽滤处理，得到苹果果胶杂多糖。
<对比例7>
为果胶低聚糖，即聚合度小于10的半乳糖醛酸聚糖。
<实验分析>
对实施3和6、对比1-7所获得的苹果果胶杂多糖进行对比分析，分析方法如下：
1、果胶含量测定：采用高效阴离子交换色谱(Dionex Bio-LC系统)与脉冲安培检测(HPAEC-PAD)结合测定中性糖组分和含量。果胶中性糖是指出现在果胶分子中的单糖残基。采用紫外分光光度法测定半乳糖醛酸含量，含量以每克果胶样品中含半乳糖醛酸毫克数表示。果胶含量表示为半乳糖醛酸和中性糖含量之和所占干物质的比例(％)，用以下公式计算：
Figure BDA0002306192230000111
其中，GalA为半乳糖醛酸，NS是中性糖重量之和，包括岩藻糖(Fuc)，鼠李糖(Rha)，半乳糖(Gla)，木糖(Xyl)，甘露糖(Man)、3-C-羟甲基-β-D-赤藓糖(Api)、2-O-甲基-果糖、2-O-甲基-木糖、3-C-羧基-5-脱氧-木糖(AceA)、2-酮-3-脱氧-D-甘露醇辛酮酸糖(KdoA)、3-脱氧-D-来苏-庚二酸(DhA)和α-L-吡喃半乳糖等糖残基。
2、果胶中性糖比例：采用高效阴离子交换色谱(Dionex Bio-LC系统)与脉冲安培检测(HPAEC-PAD)结合测定各种中性糖组分和含量。采用紫外分光光度法测定半乳糖醛酸含量，含量以每克果胶样品中含半乳糖醛酸毫克数表示。果胶中性糖比例(％)按如下公式计算：
Figure BDA0002306192230000112
其中GalA为半乳糖醛酸，Fuc为岩藻糖，Rha为鼠李糖，Gla为半乳糖，Xyl为木糖，Man为甘露糖，R为3-C-羟甲基-β-D-赤藓糖(Api)、2-O-甲基-果糖、2-O-甲基-木糖、3-C-羧基-5-脱氧-木糖(AceA)、2-酮-3-脱氧-D-甘露醇辛酮酸糖(KdoA)、3-脱氧-D-来苏-庚二酸(DhA)和α-L-吡喃半乳糖等其他杂多糖。
3、果胶甲酯化度(DM)测定：采用紫外分光光度法，以甲醇作为标准物质测定果胶甲酯化度，甲酯化度单位为％。
4、果胶连续脱脂化区比例(DB)测定：采用液相法测试酶解后去甲基化低聚半乳糖醛酸，按以下方法计算：
Figure BDA0002306192230000113
其中mono-GalA、di-GalA和Tri-GalA分别为脱脂的半乳糖醛酸单体、二聚体和三聚体；Gal(PDP)为样品中半乳糖醛酸含量。果胶连续化脱甲酯基区域比例表示为百分数(％)。
5、果胶乙酰化度(DAc)：通过酶试剂盒测定WSP中乙酸的浓度，果胶的乙酰化度(DAc)为乙酸摩尔量与半乳糖醛酸(Gal A)摩尔量的比率，并以百分比表示(％)。
6、果胶平均分子量：采用高效液相排阻色谱法(HPSEC)结合多角度及光散射检测(MALLS)法分析果胶分子量。
7、果胶降解率：果胶降解率分析基于果胶肠道微生物体外发酵体系开展试验。以果胶样品作为碳源，按照1％(w/w)的比例加入到灭菌后的肠道微生物发酵培养基中，无菌条件下分别采集健康10份健康人体粪便(5男5女)，并用磷酸缓冲溶液稀释，按照13％(w/w)的比例接种到培养基中，充分均质置于恒温培养箱中37℃厌氧培养24h。培养后，将发酵液过滤，减压浓缩后用95％乙醇沉淀，再次过滤获得滤渣；重复用95％乙醇洗涤一遍；将沉淀溶于水中，采用上述果胶含量测定方法分析沉淀中果胶含量。果胶降解率表示为以降解果胶量占添加果胶总量的百分比。
8、发酵液pH测定：将肠道微生物发酵液通过10000rpm离心10分钟，得到发酵上清液，利用自动pH测定仪测定发酵液pH值。
9、短链脂肪酸含量：利用硫酸酸化、乙醚结合超声提取的方法，通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测发酵上清液中的短链脂肪酸的种类和含量。
10、游离氨含量：利用对苯基苯酚硫酸法，以氯化铵溶液制作标准曲线，采用分光光度法在625nm下测定发酵液上清液中游离氨的含量变化。
11、微生物的菌群结构及多样性：采用338F和806R引物对V3-V4可变区进行PCR扩增，根据IlluminaMiSeq平台构建PE 2×300的文库并进行16sRNA测序，在QIIME平台进行生物信息学分析，确定微生物的菌群结构，比较样品的α多样性，结果表示为Sobs指数和Shannon指数。其中，Sobs表示样本中观察到的物种数目；Shannon指数来源于信息熵，Shannon指数越大，表示不确定性大。不确定性越大，表示这个群落中未知的因素越多，也就是多样性高。
12、特征菌种定量分析：选取Lactococcuslactis ATCC 11454，Bifidobacteriumlongum NCIMB8809，Bacteroidesovatus ATCC 8483，Eubacteriumrectale ATCC 33656和Enterococcus faecalis ATCC 29212等特征菌种引物，依据标准菌株活化要求活化菌株，提取菌株DNA，通过pEASY-BluntSimple Cloning Kit试剂盒制备克隆，进行q-PCR扩增，比较菌种的绝对含量。
13、小鼠动物试验：采用小鼠模型，每组10只，分别喂食实施3、实施例6、对比例1-7的苹果果胶杂多糖，采用上述方法分析发酵后小鼠盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠内容物中的pH、短链脂肪酸组成和含量、菌群结构和多样性、特征菌种含量。
通过以上分析方法，分析实施例1、实施例2、实施4、实施例5、实施例7所制备的苹果果胶杂多糖可知苹果果胶的含量高于90％、果胶中的中性糖比例高于70％、果胶的甲酯化度低于15％、果胶的连续脱酯基区间比例大于75％、乙酰化度低于5％、在肠道中12h后的降解率高于90％。
实施例3、实施例6、对比例1-7所述制备的苹果果胶杂多糖上述分析方法(1-13)的结果如表1所示；
表1分析方法结果
Figure BDA0002306192230000131
由表1可以看出，实施例6所制得的苹果果胶杂多糖，纯度高达94.6％，果胶甲酯化度为3.5％，果胶连续脱酯基区间比例为99.2％，果胶乙酰化度为1.2％，果胶中性糖比例高达72.5，果胶平均分子量为6.8kDa。肠道微生物发酵试验表明，本发明例工艺制得的苹果果胶杂多糖经肠道微生物发酵，体系的Sobs指数和Shannon分别从202和241升高到了293和351，表明本发明所制备的苹果果胶杂多糖可大幅提升肠道菌群的多样性，特别是有效提升了乳酸菌、双歧杆菌和拟杆菌等有益菌的丰度，同时降低了肉毒梭菌和假单胞菌等有害菌的丰度，这对改善人体肠道健康是极为有利的；同时，实施例6所制备的苹果果胶杂多糖具有发酵彻底的特点，发酵24h后肠道微生物发酵体系的pH下降至4.6，果胶降解率达到84％，表明大部分果胶分子在24h内已被微生物降解利用；体系的游离氨水平较低；苹果果胶杂多糖降解物中乙酸、丙酸、丁酸水平相对较高，特别是丙酸、丁酸相对于乙酸比例较高，或者说三种不同脂肪酸比例更为协调(19:13:9.5)，不同短链脂肪酸的益生功效原理不同，更为协调的比例有助于人体肠道健康。
对比例1为商业化酸提醇沉工艺制备的商品苹果果胶，该苹果果胶纯度仅为74.0％，甲酯化度、乙酰化度均相对较高，果胶分子量线性度较低，表明其含有大量中性糖支链，分子量也较大。肠道微生物发酵试验表明，该商业苹果果胶降解率仅为61％，发酵后体系pH仍然较高，发酵产物短链脂肪酸含量偏低；发酵后，Sobs指数和Shannon指数分别为213和251，体系中菌群多样性提升幅度较小，对有益菌的增殖和对有害菌的抑制效果不佳。
对比例2所制备的苹果果胶杂多糖在制备过程中未经过淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等酶解步骤，果胶纯度仅为76.9％，且该果胶酯化度、乙酰化度均相对较高，果胶中性糖比例低，分子量也较大。肠道微生物发酵试验表明，对比例2所制备的苹果果胶杂多糖降解率仅为64％，发酵后体系pH仍然较高，发酵产物短链脂肪酸含量偏低；发酵后，Sobs指数和Shannon指数分别为225和274，体系中菌群多样性提升幅度较小，对有益菌的增殖和对有害菌的抑制效果均低于本发明实施例6制备的苹果果胶杂多糖。
对比例3所制备的苹果果胶杂多糖在制备过程中因未经果胶甲酯酶和乙酰酯酶处理，其甲酯化度和乙酰化度相对较高，分别为66％和17.8％；由于较高的DM影响了后续酶解效率，该苹果果胶杂多糖的分子量相对本发明仍然较大，为16.2kDa。肠道微生物发酵试验表明，发酵后，Sobs指数和Shannon指数分别为268和322，表明体系中菌群多样性提升幅度明显低于本发明实施例，对有益菌的增殖和对有害菌的抑制效果也显著低于本发明实施例制备的苹果果胶杂多糖；此外，该果胶降解率相对本发明例略偏低，pH值下降幅度相对较小，这与其发酵代谢产物含量相对较低对应，表明相对于本发明例的苹果果胶杂多糖，对比例3所对应的苹果果胶杂多糖发酵速率慢，发酵程度低。
对比例4所制备的苹果果胶杂多糖在制备过程中因未经过半乳糖醛酸聚糖酶(PG)、果胶裂解酶(PL)水解步骤处理，半乳糖醛酸含量较高导致中性糖比例低(36.5％)，同时果胶分子量相对较大，为45.5kDa。肠道微生物发酵试验表明，发酵后，Sobs指数和Shannon指数分别为222和285，体系中菌群多样性提升幅度明显低于本发明，对有益菌的增殖和对有害菌的抑制效果也显著低于本发明例制备的苹果果胶杂多糖；此外，对比例4所制备的苹果果胶杂多糖降解率相对本发明偏低，pH值下降幅度相对较小，这与其发酵代谢产物含量相对较低对应，表明相对于本发明例的苹果果胶杂多糖，对比例4的苹果果胶杂多糖发酵速率慢，发酵程度低。
对比例5所制备的苹果果胶杂多糖在制备过程中由于未经过聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶三次定向酶解操作处理，中性糖比例低于本发明例，分子量相对较大，为22.5kDa。肠道微生物发酵试验表明，发酵后，Sobs指数和Shannon指数分别为244和305，体系中菌群多样性提升幅度明显低于本发明，对有益菌的增殖和对有害菌的抑制效果也显著低于本发明；此外，该苹果果胶杂多糖降解率相对本发明例偏低，pH值下降幅度相对较小，这与其发酵代谢产物含量相对较低对应，表明相对于本发明例的苹果果胶杂多糖，对比例5所制备的苹果果胶杂多糖发酵速率慢，发酵程度低。
对比例6所制备的苹果果胶杂多糖在制备过程中由于未经过动态高压微射流及后续的分子量筛选处理，果胶分子量相对本发明例较大，为12.3kDa，这一分子量表明可能苹果果胶杂多糖(II型果胶鼠里半乳糖醛酸聚糖)是以二聚体形式存在，这将降低其发酵效率。肠道微生物发酵试验表明，发酵后，Sobs指数和Shannon指数分别为271和327，体系中菌群多样性提升幅度明显低于本发明，对有益菌的增殖和对有害菌的抑制效果也显著低于本发明；此外，对比例6所制备的苹果果胶杂多糖降解率相对本发明例偏低，pH值下降幅度相对较小，这与其发酵代谢产物含量相对较低对应，表明相对于本发明的苹果果胶杂多糖，对比例6所制备的苹果果胶杂多糖发酵速率慢，发酵程度低。
对比例7为聚合度10以内的果胶低聚糖，平均分子量仅为1.25kDa。肠道微生物发酵试验表明，虽然果胶低聚糖降解率高，pH值下降幅度也较为显著，但是该果胶低聚糖发酵后，Sobs指数和Shannon指数分别仅为196和224，表明体系中菌群多样性远低于本发明；该样品发酵后产生大量乙酸，这是半乳糖醛酸的主要代谢产物，而一些中性糖的代谢产物丙酸、丁酸则相对非常少，也验证了该果胶低聚糖可能仅诱导了一些果胶降解优势菌的增殖，这不利于促进肠道菌群的多样性繁殖。
进一步采用小鼠动物试验比对本发明和对比例的苹果果胶杂多糖的肠道发酵特性，结果表明，本发明和对比例1-6均可不同程度上有效降低盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠内容物的pH(降低至4.6-5.8)，同时提高不同部位结肠内容物各种短链脂肪酸的含量，以乙酸为例可达到38.2-42.5mM/mL，但对比例7采用的高纯度果胶低聚糖，因其只含有半乳糖苷键单一组分，被微生物发酵的速度很快，其在盲肠中的发酵率高达96％以上，由此对后续升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠中的菌群结构(Sobs指数和Shannon指数)及短链脂肪酸含量(乙酸、丙酸和丁酸)的影响不显著，说明其益生作用难以抵达结肠，限定了对整个肠道的益生效果。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (2)

1.提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将苹果粉溶解于水中进行酶解，减压浓缩并提纯，得到果胶提取液；
步骤二、向果胶提取液中加入果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶进行一次定向酶切，然后加入半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶进行二次定向酶切，再加入聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶进行三次定向酶切，得到改性果胶提取液；
步骤三、将改性果胶提取液经纯化处理，得到苹果果胶杂多糖；
步骤一中，减压浓缩后得到浓缩物，将浓缩物提纯的方法为：向浓缩物中加入其总质量3-9倍量的质量分数为95％的乙醇，搅拌5-15min，过滤得到第一滤渣，然后向第一滤渣中加入浓缩物总质量3-7倍量的质量分数为95％的乙醇，过滤得到第二滤渣，向第二滤渣中加入其总质量20-50倍量的丙酮中混合，过滤得到第三滤渣，向第三滤渣中加入其总质量70-110倍量的水，置于85-95℃条件下搅拌1-9min，过滤，得到果胶提取液；
步骤一中将苹果粉溶解于其总质量5-15倍量的水中，然后置于86-96℃条件下保温5-15min再进行酶解，酶解的方法包括以下步骤：
A1、调节体系pH为5.5-6.5，添加α-淀粉酶并置于60-70℃条件下酶解0.5-1.5h；
A2、调节体系pH为7-8，添加蛋白酶并置于55-65℃条件下酶解0.5-1.5h；
A3、调节体系pH为4-4.6，添加淀粉葡萄糖苷酶并置于50-70℃条件下酶解0.5-1.5h；
A4、调节体系pH为5-6，添加纤维素酶并置于40-60℃条件下酶解1-3h，然后置于86-96℃条件下静置5-15min，酶解完成；
其中，按苹果粉溶解于水后所得到的体系量计，α-淀粉酶的添加量为450-550U/mL，蛋白酶的添加量为50-71.5U/mL，淀粉葡萄糖苷酶的添加量为200-400U/mL，纤维素酶的添加量为10-30U/mL；
步骤A4中的纤维素酶为β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶；
步骤二中，一次定向酶切的条件为：果胶甲酯酶和果胶乙酰酯酶的添加量均为1-3U/ml，温度为27-47℃，时间为1-2h；二次定向酶切的条件为：半乳糖醛酸聚糖酶、果胶裂解酶的添加量均为50-150U/mL，温度为27-47℃，时间为1-3h；三次定向酶切的条件为：聚鼠李半乳糖醛酸酶、木糖基半乳糖醛酸酶、半乳聚糖酶、阿拉伯聚糖酶的添加量均为5-35U/mL，温度为27-47℃，时间为4-6h，其中，添加量按果胶提取液的量计；
步骤三中纯化处理的方法为：将改性果胶提取液经动态高压微射流处理后加入乙醇进行沉淀，收集沉淀物，将沉淀物复溶后依次进行超滤、透析、浓缩、干燥，得到苹果果胶杂多糖，其中，动态高压微射流处理时压力为300-600MPa，循环次数1-5次；超滤的方法为：使用截留分子量为7500Da的聚砜膜进行抽滤处理；透析的条件为：孔隙度为5000Da，透析时间为12-36h；
步骤三中改性果胶提取液在进行动态高压微射流处理前先进行灭酶处理，灭酶处理的方法为：将改性果胶提取液置于96℃条件下加热5-15min。
2.一种提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖，其特征在于，所述苹果果胶杂多糖由权利要求1所述的提高肠道菌群多样性的苹果果胶杂多糖的制备方法制备而得。
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Application publication date: 20200403

Assignee: Guangdong Whale Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES

Contract record no.: X2023980032523

Denomination of invention: Apple pectin heteropolysaccharide and its preparation method for improving the diversity of intestinal flora

Granted publication date: 20210330

License type: Common License

Record date: 20230227

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