CN115433290B - 羊栖菜多糖的提取方法和基于此的羊栖菜降解多糖的制备方法及羊栖菜降解多糖的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于多糖提取领域，具体涉及羊栖菜多糖的提取及降解方法。本发明以羊栖菜为原料，采用蛋白酶辅助水提醇沉法提取羊栖菜多糖，然后利用亚临界水处理降解羊栖菜多糖制备低分子量羊栖菜多糖。上述方法具有得率高、绿色环保、成本低等优点，在多糖水提过程中加入碱性蛋白酶，可以使多糖更容易浸出，提高多糖得率且酶法提取条件温和，可以减少对多糖的破坏，能够有效保留多糖的生物活性；采用亚临界水处理代替传统的物理化学方法制备低分子量羊栖菜多糖，使不易被人体吸收利用的高粘度多糖降解成富含生理活性的低分子量羊栖菜多糖，实现低值羊栖菜的高值化利用，提高羊栖菜多糖的潜在医药应用中的价值，增加应用前景。
Description
技术领域
本发明属于多糖提取领域，特别是涉及羊栖菜多糖的提取方法和基于此的羊栖菜降解多糖的制备方法及羊栖菜降解多糖的应用。
背景技术
羊栖菜，别名海菜芽、鹿角尖、海大麦、羊奶子等，主要分布于中国南方沿海，在朝鲜和日本沿岸也有分布。羊栖菜含有丰富的多糖，矿物质、维生素，蛋白质，和膳食纤维并且在中国有较长的食用和药用历史。研究表明，羊栖菜多糖具有降血糖、降血脂、抗癌、抗氧化及抗肿瘤等多种生理活性功能，具有较高的保健价值，可作为添加剂应用于特医食品行业中。
目前羊栖菜多糖的提取方法主要有水提法和超声辅助提取，这些方法存在成本太高，操作复杂，耗能耗材较多等不足，极大的限制了羊栖菜产业的发展。现有技术，如中国发明授权专利，授权公告号:CN105601762A，该发明设计了一种羊栖菜多糖的提取工艺，采用多次冷水浸提法。虽然可以提高多糖的提取率及保留多糖活性，但是所需工艺较复杂，费时费力。
另外，现有技术提供的方法提取获得的羊栖菜多糖的分子量通常具有分子量过高的缺陷，这在一定程度上限制应用前景。现阶段已有一些多糖降解的方法，如酶降解和化学降解得到了广泛的研究，但上述都有其应用的局限性和不利于工业化的缺陷。如酶降解中，酶的选择和应用复杂且昂贵，具有成本高的缺陷，化学降解引起的环境污染和复杂产物在后续处理上有较大的缺陷，部分较为激烈的反应条件还会削弱多糖的生物活性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了羊栖菜多糖的提取方法和基于此的羊栖菜降解多糖的制备方法及羊栖菜降解多糖的应用。本申请涉及的亚临界水处理技术，使得制备得到的聚合物具有较低的分子量和更好的生物活性的优势。而且亚临界水处理聚合物具有可大规模生产、可控降解、环境友好和低消耗的优点。
本发明提供了一种羊栖菜多糖的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：
(1)将烘干的羊栖菜依次进行粉碎和脱脂，得到脱脂得羊栖菜；
(2)烘干脱脂的羊栖菜与水混合后得到羊栖菜悬浊液，对羊栖菜悬浊液依次进行调节pH值和水解的操作，得到水解后的羊栖菜溶液；
所述pH值为8.5～10；
所述水解的操作包括：加入碱性蛋白酶进行水解；
(3)离心水解后的羊栖菜溶液获得上清液，通过旋转蒸发后得到浓缩液，将浓缩液与体积百分比为95％的乙醇混合后静置沉淀12小时再进行第二次离心得到沉淀，将沉淀复溶于水后干燥得到羊栖菜多糖；
所述乙醇与浓缩液的体积比为3:2；
所述第二次离心的条件为3000×g，时间为10min。
优选的，所述步骤(1)和步骤(2)中的烘干温度为50～70℃。
优选的，所述步骤(3)中静置的时间为8～12h。
本发明还提供了上述提取方法提取获得的羊栖菜多糖在制备羊栖菜降解多糖中的应用。
本发明提供了一种羊栖菜降解多糖的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将上述提取方法获得的羊栖菜多糖通过亚临界水处理得到羊栖菜降解多糖。
优选的，所述亚临界水处理温度为120～150℃。
优选的，所述亚临界水处理压力为1～5MPa。
本发明还提供了上述提取方法提取获得的羊栖菜降解多糖在制备具有抑制α-葡萄糖苷酶活性作用的药物中的应用。
本发明还提供了上述提取方法提取获得的羊栖菜降解多糖在制备具有抗氧化活性作用的药物中的应用。
本发明的有益效果：本方法工艺简单，操作方便，能耗小污染少，易于工厂化；提取条件温和，对多糖破坏少，能够有效保留多糖的生物活性；降解方法温和且高效，能通过调整实验条件较好地获得特定分子量的降解多糖；本方法获得的提取及降解羊栖菜多糖具有较好的抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶的活力。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图；
图2为本发明实施例1提供的羊栖菜多糖在降解前及降解后的α-葡萄糖苷酶抑制活性；
图3为本发明实施例1提供的羊栖菜多糖在降解前及降解后的红外光谱扫描图；
图4为本发明实施例1提供的羊栖菜多糖在降解前及降解后的扫描电子显微镜图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
1、羊栖菜多糖的提取
称取适量干燥的羊栖菜50℃烘干至恒重，在常温下用粉碎机粉碎后过40目筛子，然后用95％乙醇(体积比)处理羊栖菜粉末24小时，以去除脂肪、色素、低分子物质和其他醇溶性物质。然后将脱脂羊栖菜粉末与去离子水的比例设置为40g/L，调整悬浊液pH为10，加入0.9％的碱性蛋白酶，于50℃提取4小时，将混合物灭活10分钟并在3000g下离心10分钟。浓缩提取液并用乙醇沉淀至最终浓度60％(v/v)12小时。用95％乙醇洗涤离心收集的沉淀物，然后用去离子水溶解，最后冷冻干燥以获得羊栖菜多糖SFP。
在上述工艺下，多糖提取率为11.51％,多糖纯度为75％，蛋白质含量为0.86％。对羊栖菜多糖SFP进行检测可知分子量是170.60kDa。此方法在最大化提取羊栖菜多糖的同时可以去除大部分蛋白。
2、亚临界水处理降解羊栖菜多糖
将上述提取获得的初始浓度为4％的羊栖菜多糖在120℃的微型机械搅拌高压釜中连续反应，分别在6h、12h24h取样。在反应过程中，通过调节阀口将釜压保持在5MPa。取出的样品立即在冰水中冷却至室温，然后将亚临界水处理后获得的溶液浓缩并冷冻干燥。
将以上步骤处理后获得的三种降解多糖分别命名为DFP-6、DFP-12和DFP-24。随着亚临界水处理时间的延长，DSFP-6、DSFP-12和DSFP-24的分子量分别为61.03、32.91和18.98kDa。上述制备方法的工艺流程图如图1所示。
如图2所示，SFP、DSFP-6、DSFP-12和DSFP-24对α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈浓度依赖性，其IC50值分别为0.841、0.293、0.178和0.076mg mL-1。降解羊栖菜多糖的IC50值低于阿卡波糖(0.677mg mL-1)，而天然羊栖菜多糖的IC50值高于阿卡波糖。多糖的分子量是影响其α-葡萄糖苷酶抑制活性的关键因素。值得注意的是，与天然多糖相比，亚临界水处理的多糖具有更好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，这表明亚临界水处理可以增强羊栖菜多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性。亚临界水处理的羊栖菜多糖具有更好的生物活性，可以提高羊栖菜多糖的潜在医药应用价值。
实施例2
具体操作步骤同实施例1，区别点在于悬浊液浓度60g/L、pH值9、碱性蛋白酶0.6％、于60℃提取5h。制取获得羊栖菜多糖，多糖提取率为10.35％，多糖纯度为71％，蛋白质含量为0.95％；
130℃处理3h的亚临界水处理条件得到羊栖菜降解多糖的分子量为32.02kDa，具有较高的α-葡萄糖苷酶抑制和抗氧化活性。
实施例3
具体操作步骤同实施例1，区别点在于悬浊液浓度20g/L、pH值8.5、碱性蛋白酶1.5％、于40℃提取2h。制取获得羊栖菜多糖，多糖提取率为9.48％，多糖纯度为68％，蛋白质含量为1.32％；
亚临界水处理140℃处理2h的条件得到羊栖菜降解多糖的分子量为21.69kDa，具有较高的α-葡萄糖苷酶抑制和抗氧化活性。
对比例1
具体操作步骤同实施例1，区别点在于没有添加碱性蛋白酶和调pH。制取获得羊栖菜多糖，多糖提取率为5.47％，多糖纯度为57.35％，蛋白质含量为5.23％。
对羊栖菜多糖进行检测可知分子量是175.63kDa。经过110℃、6h条件的亚临界水处理得到羊栖菜降解多糖分子量为153.15kDa，在此处理条件下羊栖菜多糖的分子量降低较慢。
对比例2
羊栖菜由新鲜羊栖菜烘干制成，干燥至含水量≤15％、磨碎，过60目筛。添加纤维素酶1％，果胶酶2％，蛋白酶2％，于55℃、pH 6.0下酶解120min。酶解结束后在5000转速下离心5min，提取上清液测定多糖含量，计算提取率。在上述工艺下，羊栖菜多糖的提取率仅为7.80％。
实施例4红外光谱分析
实施例1提供的SFP、DSFP-6、DSFP-12和DSFP-24的FT-IR光谱由Nicolet iS10红外光谱仪(Thermo Fischer Scientific Inc.，Waltham，MA，USA)测定。将样品(1mg)和溴化钾(100mg)的混合物压成片状，然后在400-4000cm-1的范围内进行扫描。
如图3所示，SFP和降解羊栖菜多糖(DFP-6、DFP-12和DFP-24)的FT-IR光谱几乎相同，亚临界水处理不会破坏羊栖菜多糖的主要功能团。
实施例5扫描电子显微镜分析
通过扫描电子显微镜(日本日立)观察了亚临界水处理前后的羊栖菜多糖(SFP、DFP-6、DFP-12和DFP-24)的表面形态变化。冷冻干燥的多糖用导电材料固定在样品台上，然后喷金。所有扫描电镜图像均在3kV加速电压下采集。
实施例1提供的SFP、DSFP-6、DSFP-12和DSFP-24的SEM图像如图4所示。未经亚临界水处理的羊栖菜多糖的微观结构显示出粗糙的表面和不规则的层状结构(图4A)。DSFP-6呈现不规则几何形状，表面不均匀，有许多孔隙，如图4B所示。然而，随着时间的延长，DSFP-12中的多糖颗粒逐渐累积，形成更小的孔隙和更光滑的表面(图4C)。如图4D所示，与DSFP-12相比，DSFP-24表现出更紧密的簇和更平滑的表面。扫描电镜分析表明，亚临界水处理前和处理后的羊栖菜多糖表面形貌发生了显著变化。可能的原因是亚临界水处理有效地打破了多糖之间的糖苷键，并导致形态变化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本发明的发明人来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种羊栖菜降解多糖的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括提取羊栖菜多糖和将羊栖菜多糖通过亚临界水处理得到羊栖菜降解多糖；
所述羊栖菜多糖的提取方法包括以下步骤：
（1）将烘干的羊栖菜依次进行粉碎和脱脂，得到脱脂得羊栖菜；
（2）烘干脱脂的羊栖菜与水混合后得到羊栖菜悬浊液，对羊栖菜悬浊液依次进行调节pH值和水解的操作，得到水解后的羊栖菜溶液；
所述pH值为8.5~10；
所述水解的操作包括：加入碱性蛋白酶进行水解；
（3）离心水解后的羊栖菜溶液获得上清液，通过旋转蒸发后得到浓缩液，将浓缩液与体积百分比为95%的乙醇混合后静置沉淀12小时再进行第二次离心得到沉淀，将沉淀复溶于水后干燥得到羊栖菜多糖；
所述乙醇与浓缩液的体积比为3:2；
所述第二次离心的条件为3000×g，时间为10min；
所述亚临界水处理温度为120~150℃；
所述亚临界水处理压力为1~5 MPa；
所述亚临界水处理的时间为6h或12h或24 h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）和步骤（2）中的烘干温度为50~70℃。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中静置的时间为8~12h。
4.权利要求1~3任一项所述的制备方法提取获得的羊栖菜降解多糖在制备具有抑制α-葡萄糖苷酶活性作用的药物中的应用。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张梦晴."羊栖菜-α-葡萄糖苷酶抑制剂的分离纯化及特性研究".中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑.2021,(第01期),B024-10. * |
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