CN109575152A - 从红毛五加多糖提取液中高效快速脱除蛋白及色素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种红毛五加多糖提取液脱蛋白、脱色素方法，在提取液中加入蛋白酶将蛋白质分子降解后，借助反胶束溶液处理技术将其中的蛋白质分子和色素分子一起去除，通过蛋白酶‑CTAB联合处理实现了蛋白类、色素类杂质的同步高效率去除。其中，所述反胶束处理液包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)以及复合溶剂；所述的复合溶剂由有机溶剂与水组成。

Description

从红毛五加多糖提取液中高效快速脱除蛋白及色素的方法

技术领域

本发明涉及天然产物提取纯化领域，具体涉及红毛五加多糖提取液脱蛋白、脱色素方法。

背景技术

多糖(polysaccharide)亦称多聚糖，是由二十多个到上万个单糖组成的天然高分子化合物，广泛存在于动植物、真菌和微生物体中。多糖作为一种天然活性成分因其具有多种生物活性，且无毒、无害、无残留、无抗药性作用，备受国内外研究者青睐，是医药、农业、食品等研究领域的热点。多糖的生物活性与其纯度及结构有着重要的关系，但与其它天然活性物质的提取一样，面临着原料成分复杂，目标产物含量低等问题，因此建立优化高效有效的分离纯化方法成为生物活性多糖提取纯化领域中亟待解决的问题。

目前，天然活性多糖进行提取，多采用“水提醇沉”方法，或在此基础上辅以微波或超声等技术。所得提取液中常混用一定量的蛋白和加热氧化形成的色素类物质，这类色素分子主要包括类胡萝卜素、叶黄素类、黄酮类、花色苷类等。

CN201711480099公开了复合酶法提取肾茶多糖的最佳提取工艺条件。采用纤维素酶与木瓜蛋白酶酶配比为3:1的复合酶法提取肾茶多糖，对预处理后的原料用复合酶法热水浸提、灭活酶、脱色素、浓缩、除蛋白、醇沉、提取率测定等步骤，按照纤维素酶与木瓜蛋白酶酶配比3:1、料液比1:70、复合酶用量约8％热水浸提。

CN108003255涉及一种龙眼多糖提取方法，包括如下步骤：1、预处理；2、提取；3、过滤，提取液进行真空抽滤，取上层清液；4、酶解，加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀，然后将烧杯置于60℃的水浴中酶解3小时；5、离心；6、脱蛋白；7、分离；8、浓缩；9、醇沉；10、离心并干燥。此法结合了超声波辅助提取法和微波辅助提取法，在超声波辅助提取的同时外加微波场，以提高提取效率。

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CN 201511008885涉及一种辣木籽中多糖提取方法：将粉末状辣木籽放入水中，在一定温度下提取一定时间，得辣木籽多糖提取液；所述的辣木籽多糖提取液中多糖的产率达到14％以上。

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以上现有技术提取多糖时，在后续的纯化工作中，多采用Sevage法、TCA法去除其中的蛋白成分，或在此基础上辅以蛋白酶水解。但上述脱蛋白方法，存在蛋白脱除效率低下，操作繁琐，或容易造成多糖降解等缺点。对于色素类杂质的去除，目前常用是活性炭吸附法(或大孔树脂吸附法)和双氧水氧化等方法。但前者会因离子交换剂再生困难而增加制备成本，双氧水法只是将色素分子氧化并未真正去除，因此改良优化生物活性多糖的纯化工艺成一项亟待解决的问题。

反胶束萃取是一种新兴的生物分离纯化技术，适用于色素染料、多糖、蛋白质、抗生素等成分的分离和提取。反胶团萃取利用表面活性剂在有机相中形成的一种极性头向内、非极性尾向外且中间含有微量水的纳米聚集体，是透明的、热力学稳定的体系的反胶束进行萃取的技术，反胶束内部包含有水溶液，色素基团进入反胶束内部的亲水环境，增溶于水池中，将有色基团从水相萃取到有机相中，达到了色素成分去除的效果。

然而，目前现有技术尚没有在提取液中加入蛋白酶将蛋白质分子降解后，借助反胶束溶液技术将其中的蛋白质分子和色素分子一起去除，实现了蛋白类、色素类杂质的高效率去除的工艺路线。

发明内容

为了克服现有技术缺陷，本发明提供一种高效的红毛五加多糖提取液脱蛋白、脱色素方法。其可以从红毛五加多糖提取液中高效快速地同步脱除蛋白及色素，避免了现有技术中多糖提纯时需分步进行脱蛋白、除色素的操作，同时无需采用大孔吸附树脂等繁琐操作。

本发明采用的工艺为，在多糖粗提取液中加入蛋白酶将蛋白质分子降解，然后借助特定的反胶束溶液快速处理，将其中的蛋白质分子和色素分子同步去除，实现了蛋白类、色素类杂质的高效率同步去除。

本发明不仅能有效地提取红毛五加多糖，还能较彻底地除去多糖中的色素、蛋白质、小分子类物质等杂质，不会破坏多糖的结构，并且减少了有机试剂的用量，同时开创了一条适合多糖类天然产物分离纯化的工艺路线。

为实现上述目的，本发明技术方案采用反胶束处理液处理添加有氯化钠的红毛五加粗多糖提取液。

其中，所述的红毛五加粗多糖提取液可以是直接水提得到的，也可以是经过脱脂预处理后经辅助提取手段提取得到的。

具体地，本发明技术方案包括以下步骤：

S1：提取红毛五加粗多糖；

S2：配制反胶束处理液；

S3：使用反胶束处理液快速同步脱蛋白及色素；

以及任选的以下步骤：

S4：透析纯化处理。

其中，步骤S1中，粗多糖的提取可按照本领域通常的多糖提取方法进行。

步骤S2中，所述反胶束处理液包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)以及复合溶剂。

所述的复合溶剂由有机溶剂与水组成，具体地，所述的有机溶剂为正已醇/异辛烷混合溶剂。其中，水：正已醇：异辛烷的体积比为30:5-10:60-65。

其中，步骤S3所述的同步快速脱蛋白及色素步骤中，包括使用反胶束处理液处理红毛五加粗多糖提取液。

优选地，该步骤中还包括预先使用蛋白酶对粗多糖进行酶解处理。

其中，所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶中的至少一种。

具体地，本发明所述从红毛五加多糖提取液中高效快速脱除蛋白及色素的方法，具体步骤如下：

S1：提取红毛五加粗多糖

1)原料预处理：

将干燥后的红毛五加粉碎，过40-60目筛，将粗粉按1g:8-10ml的料液比添加85-95％体积分数的乙醇溶液，35-45℃回流脱脂1-2h，除去脂类、单双糖等成分，减压过滤，将滤饼中的乙醇溶剂蒸干，回收粉末备用；

2)提取粗多糖：

将脱脂处理过的红毛五加与去离子水按料液比1g:10-15ml的比例混合，在50-60℃下浸泡3-5h，然后在90-100℃下超声处理15-30min后进行回流提取2-3次，每次40-60min，合并收集提取液；

以8000-8500rpm离心20-30min并收集上清液，真空浓缩至原药材量的1-1.5倍重量，将浓缩后的滤液加入4-5倍体积的95％乙醇进行室温醇沉16-24h，抽滤，将醇沉后的上清液减压浓缩回收乙醇溶剂后，对浓缩液再次醇沉，合并沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮淋洗，干燥，即得红毛五加粗多糖。

S2：配制反胶束处理液：

取适量十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶于正已醇/异辛烷与水组成混合溶剂中，充分混匀，得到反胶束处理液；

其中，所述混合溶剂中，水：正已醇：异辛烷的体积比为30:5-10:60-65，优选30:5:65；

其中，所述反胶束处理液中CTAB的含量为0.1-0.2mol/L，优选0.1-0.15mol/L，最优选0.1-0.12mol/L。

S3：同步脱蛋白及色素：

1)将粗多糖溶于蒸馏水，配制成10-30mg/ml的粗多糖溶液；取适量多糖溶液，按(1-10)×10⁴U/g多糖的比例加入蛋白水解酶，在酶适条件下振荡酶解反应1-3h，然后于沸水浴中灭活5-15min，冷却至室温；

2)快速脱蛋白及色素：加入NaCl至浓度0.4-0.6mol/L，然后以5-6:1的体积比(溶液体积的1/6至1/5)向溶液中加入反胶束处理液，剧烈震荡5-15min，然后8000-10000rpm离心10-15min使溶液分层，取下层溶液；同时测定其中色素、多糖及蛋白含量。

优选地，收集上层溶液，按上述步骤操作重复萃取2-3次，合并下层溶液。

优选地，加入NaCl至浓度0.4-0.5mol/L。

步骤1)中，优选地，酶解条件为：向粗多糖溶液中加入木瓜蛋白酶，调整pH为6.5-7.0，置于55～65℃下酶解60-120min。

其中一个实施方式为，于60℃水浴中加热溶解粗多糖得到终浓度为3％的多糖溶液，调整溶液pH值为6.8，按4×10⁴U/g多糖的比例向溶液中加入木瓜蛋白酶，60℃恒温水浴2h后，将溶液于100℃加热5min灭活木瓜蛋白酶，冷却至室温。

优选地，本发明还进一步包括透析处理步骤。

S4：透析：将脱蛋白及色素后的所得多糖溶液调整至10-50mg/ml，在透析袋中用蒸馏水透析12-24h，再用4-5倍体积的95％乙醇醇沉，静置24h后抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，真空干燥即得红毛五加多糖。

本发明中，色素、多糖及蛋白含量均采用本领域常规方法测定，测定计算方式如下。

多糖含量测定采用本领域通用的苯酚-硫酸法，以葡萄糖做标准品。蛋白质含量测定采用本领域通用的Broad Ford法，以BSA做标准品。色素含量测定通过光谱扫描590nm吸光度确定。

其中，多糖含量测定中，多糖保留率(％)计算方式为M后/M前×100％，

式中：M前、M后分别为溶液脱色前后的多糖量。

其中，蛋白质含量测定中，蛋白去除率(％)计算方式为(M前-M后)/M前×100％，式中：M前、M后分别为溶液脱色前后的蛋白质质量浓度。

其中，色素含量测定中，脱色率(％)计算方式为(A前-A后)/A前×100％，式中：A前、A后分别为溶液脱色前后多糖样品的吸光度值。

本发明相对于现有技术具有如下有益效果：

(1)本发明在提取液中加入蛋白酶将蛋白质分子降解后，借助反胶束溶液技术将其中的蛋白质分子和色素分子一起去除，实现了蛋白类、色素类杂质的同步高效率去除，适合多糖类天然产物分离纯化。

(2)本发明工艺在除去粗多糖溶液中的蛋白质和色素的同时，不会破坏多糖的结构，并且有效减少了有机试剂的用量，同时也降低了多糖损耗，纯化后多糖纯度达90％以上，是红毛五加多糖提纯方法上的创新。

(3)反胶束溶液双脱处理技术大大缩短了多糖提纯时间，无需采用大孔树脂进一步纯化，具有安全、高效、节能降耗等特点，节约了生产成本，适应大规模生产的要求。

(4)本发明采用木瓜蛋白酶与反胶束溶液结合处理的技术联用，具有单步较高的蛋白、色素脱除率和多糖保留率的优点，一次处理即可达到优异效果，用时短。

附图说明

图1为实施例7中不同方法除蛋白的结果比较(其中，蛋白酶-CTAB联用法标记为M；Sevage标记为N；TCA标记为S)。

图2为实施例7中不同脱色素方法的结果比较(其中，蛋白酶-CTAB联用法为W；双氧水氧化法为X；活性炭吸附法为Z)。

具体实施方式

下面通过具体的制备例和实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

如无特殊说明，本发明以下实施例红毛五加购自潍坊本草堂，木瓜蛋白酶(酶活性为8×10⁵U/g)、碱性蛋白酶(酶活性为2×10⁵U/g)购自北京索莱宝科技有限公司，中性蛋白酶(酶活性为1×10⁵U/g)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购自合肥博美生物科技有限公司，BCA试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，活性炭购自国药集团化学试剂有限公司，30％H₂O₂，异辛烷，正己醇，氯化钠，三氯乙酸，苯酚，硫酸等所用试剂均为国产A.R级。

实施例1

1)将干燥后的红毛五加皮粉碎，过60目筛，将过筛后的粗粉按1g:10ml的料液比添加95％体积分数的乙醇溶液，40℃回流脱脂1h，除去脂类等成分，减压过滤，将滤饼中的乙醇溶剂蒸干，回收粉末备用。

2)将脱脂处理过的干燥红毛五加粉与去离子水按料液比1g:12ml的比例混合，在60℃下浸泡4h，然后在95℃下超声处理15min后进行回流提取2次，每次60min，合并收集提取液；以8000rpm离心20min，收集上清液并真空浓缩至原药材量的等重，将浓缩后的滤液加入4.5倍体积的95％乙醇进行室温醇沉24h，抽滤，将醇沉后的上清液减压浓缩回收乙醇溶剂后，对浓缩液再次醇沉，合并沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮淋洗，干燥，即得红毛五加粗多糖。

3)配制反胶束处理液：取适量十六烷基三甲基溴化铵溶于正已醇、异辛烷与水组成混合溶剂中，CTAB浓度调整至0.10mol/L，充分振荡混匀，得到反胶束处理液；备用。

其中，所述混合溶剂中，水：正已醇：异辛烷的体积比为30:5:65。

将上述步骤2)中粗多糖于60℃水浴中加热溶解于蒸馏水中，配制成30mg/ml的粗多糖溶液50mL；按6×10⁴U/g多糖的比例向多糖溶液中加入木瓜蛋白酶，调整pH为6.8-7.0，置于60℃恒温水浴下酶解120min，然后于沸水浴中灭活5min，冷却至室温，测定其中色素、多糖及蛋白含量。

5)快速脱蛋白及色素：向冷却后的灭酶液中加入NaCl至浓度0.4mol/L，然后以5:1的体积比(溶液体积1/5)向溶液中加入反胶束处理液，剧烈震荡10min，然后8000rpm离心15min使溶液分层，取下层溶液；并测定其中色素、多糖及蛋白含量，测得蛋白去除率88.29％，色素脱除率77.21％。

6)将脱蛋白及色素后的所得多糖溶液调整至50mg/ml，在透析袋中用蒸馏水透析16h，再用5倍体积的95％乙醇醇沉，静置24h后抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，真空干燥即得纯化的红毛五加多糖。

本发明还对红毛五加多糖提取液脱蛋白、脱色素方法进行了单因素与正交试验考察，并采用了响应面分析优化方法对多糖的提取工艺进行了优化设计，以多糖保留率与蛋白、色素脱除率为考核指标，具体见如下实施例。

实施例2

不同蛋白酶对蛋白去除率的比较

分别加入相同活力单位的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，在酶适反应条件下进行，其它条件均按照实施例1步骤进行，计算各比例下的蛋去除率和多糖的保留率，结果见表1所示。

表1不同蛋白酶对蛋白去除率的比较

由表1可看出，在加酶量相同的情况下，木瓜蛋白酶的脱蛋白效果最好，蛋白去除率为88.29％；其次为碱性蛋白酶，蛋白去除率达71.64％；中性蛋白酶脱蛋白效果不理想。而考虑三者之间蛋白去除率与多糖损耗率之比，木瓜蛋白酶最优。

实施例3

酶解时间对蛋白去除率的影响

按照实施例1方法调整酶解时间为0.5-3.5h，其它条件不变，计算各酶解时间下的蛋白和色素去除率以及多糖的保留率。结果表明，蛋白去除率随酶解时间延长，在2h以内迅速增加，1.5-2h达到区域高峰值，2h以后蛋白去除率呈现有下降趋势。

实施例4

CTAB浓度对蛋白和色素去除率的影响

按照实施例1的方法分别配制含CTAB浓度为0.05、0.20及0.25mol/L的反胶束溶液，其它条件均按照实施例1步骤进行。计算各CTAB浓度下的蛋白和色素去除率以及多糖的保留率。结果如下。

表2 CTAB浓度对蛋白和色素去除率的影响

由表中可以看到，蛋白和色素成分的去除率随着有机相中表面活性剂CTAB的浓度的增加而提高，当表面活性剂的浓度增加到0.10-0.20mol/L后趋于峰值区间，此后有下降趋势，萃取率将随表面活性剂浓度的增加而有下降变化。

实施例5

按照实施例1方法分别配制NaCl的浓度为0.05-0.6mol/L的多糖溶液，其它条件均按照实施例1步骤进行考察NaCl浓度的影响，结果如下表3。

表3 NaCl浓度对蛋白和色素去除率的影响

由表中可以看到，NaCl浓度对红毛五加粗多糖液中的蛋白和色素成分去除率有一定影响，随着NaCl浓度的增加，蛋白去除率迅速增长，而当NaCl浓度超过一定值(0.4mol/L左右)后，蛋白去除率随着NaCl浓度的增长而下降。随着NaCl浓度的增长，色素成分的去除率在下降，但是多糖的保留率在增加。

实施例6

响应面实验方案

选取多糖液与反胶束溶液混合比例(X1)、NaCl的浓度(X2)、CTAB浓度(X3)和酶解时间(X4)为自变量，以红毛五加多糖(AHPs)中蛋白去除率与多糖损耗率的比值为参考基准，应用Box-Behnken试验原理，采用四因素三水平响应面分析法进行试验设计，优化AHPs多糖木瓜蛋白酶法脱蛋白工艺。

响应面实验因素水平设计见下表。

表4响应面实验设计

实验结果以最终溶液的蛋白去除率与多糖损耗率之比(Y值)进行比较。

结果见下表5。

表5响应面实验结果

从表中可以看出，影响红毛五加蛋白去除率与多糖损失率比值Y的因素的顺序依次为：多糖液与反胶束溶液混合比例＞CTAB浓度＞酶解时间＞NaCl浓度，其中多糖液与反胶束溶液混合比例对红毛五加蛋白去除率与多糖损失率比值Y影响最大，呈极显著影响，NaCl浓度对红毛五加蛋白去除率与多糖损失率比值Y影响最小，CTAB浓度和酶解时间，都有不同影响。

进一步地，采用Design-Expert(8.05b)软件对试验模型进行响应值优化分析，拟合Y值计算公式为3.41+0.27X₁+7.675E–003X₂–0.075X₃–0.021X₄+0.080X₁X₂+0.18X₁X₃+0.095X₁X₄+0.17X₂X₃–0.015X₂X₄+0.035X₃X₄–0.42X₁ ²–0.52X₂ ²–0.53X₃ ²–0.36X₄ ²，结果如下表6。

表6响应面模型优化分析

R²＝0.9126；拟合R²＝0.8252；CV＝6.85％。

由方差分析可知，此模型的失拟项p＝0.0721＞0.05，模型失拟项不显著，说明模型选择合适，可以使用该模型来分析响应值的变化。

为了验证模型的准确性，进行验证实验。实施例1经调整后的脱蛋白色素实验条件为：多糖液与反胶束溶液混合比例为5.5:1，NaCl浓度为0.41mol/L，加酶活性为6.0×10⁴U/g，CTAB浓度为0.12mol/L，酶解时间为1.5h。通过最优参数验证实验(重复三次)对模型的准确性进行了评价。实验结果表明在此工艺条件下Y值稳定在3.470±0.0584％，重现性良好。预测值Y为3.4506，与实测值接近，偏差较小，模型被认为是可靠的。

基于模型的分析表明，多糖液与反胶束溶液混合比例和CTAB浓度分别NaCl浓度和酶解时间的变化而变化。多糖液与反胶束溶液混合比例和CTAB浓度对多糖液与反胶束溶液混合比例的影响是相互作用的。多糖液与反胶束溶液混合比例与CTAB浓度对AHPs蛋白去除率与多糖损失率比值Y的交互作用不显著。随着多糖液与反胶束溶液混合比例从3:1提高到5:1，蛋白去除率与多糖损失率比值Y增大。而酶解时间对AHPs蛋白去除率与多糖损失率比值Y的影响较小。当多糖液与反胶束溶液混合比例和酶解时间固定时。在多糖液与反胶束溶液混合比例和酶解时间作用下，随着NaCl浓度和CTAB浓度的增大，蛋白去除率与多糖损失率比值Y先增大后减小。

实施例7

本申请分别对蛋白酶-CTAB联用法、Sevage法和TCA法基于实施例1中的红毛五加粗多糖中脱除蛋白和色素的效果进行了比较，结果以蛋白去除率和多糖的保留率为基准进行比较。

其中，传统脱蛋白方法以Sevage法(氯仿与正丁醇体积比为4:1，样液与试剂体积比为4:1)、TCA法(三氯乙酸浓度5％，样液与TCA体积比为2:1)进行。传统脱色素以本领域常用的双氧水氧化法、活性炭吸附法进行。结果见附图1、附图2。

其中，蛋白酶-CTAB联用法按照实施例1步骤进行，其中调整脱除蛋白和色素的条件为：多糖液与反胶束溶液混合比例为6:1，NaCl浓度为0.3mol/L，加蛋白酶使得酶活为5.0×10⁴U/g(多糖)，CTAB浓度为0.1mol/L，酶解时间为1h，从而使得多糖脱杂经济成本和时间成本更加经济。

由附图1可以看出，不同脱蛋白方法对多糖中的蛋白质均有脱除作用，然而不同方法对多糖保留率的影响不同。其中，Sevage法脱蛋白率和多糖保留率均最低，TCA法虽然脱蛋白率高但多糖保留率较低，本发明实施例1的蛋白酶-CTAB联用法不仅脱蛋白率高而且多糖保留率也是最优，二者数值分别高达79.02±0.47％和77.22±0.52％。

附图2为分别用蛋白酶-CTAB联用法、双氧水氧化法、活性炭吸附法对实施例1中粗多糖溶液进行脱除色素的比较。由图可以得出，不同脱色素方法对多糖中的色素分子均有脱除作用，且不同方法对多糖保留率的影响也不同。其中，活性炭吸附法脱色素率和多糖保留率均最低，蛋白酶-CTAB联用法脱色素率多糖保留率均比较优异，分别为76.4±1.22％和77.22±0.52％，而双氧水氧化法脱色素率多糖保留率均低于前者。

由此可见，传统脱蛋白(Sevag法、TCA法)中，Sevage法要反复数次,才能将多糖中的蛋白脱除干净,因此有多糖样品的大量损失、有机溶剂消耗较大、费时等缺点；TCA法是使蛋白质在有机酸的作用下变性而沉淀出来,容易使多糖结构发生改变，成本较高，多糖损失率也高。传统脱色(活性炭吸附法、双氧水法)缺点是活性炭吸附色素的同时也会吸附大量的多糖；双氧水在脱除色素的同时，它的强氧化性也会使多糖的羟基等活泼基团氧化，使多糖降解，从而降低了多糖的保留率。而本发明的蛋白酶-CTAB法优点在于酶解反应和脱色的环境都比较温和，不会破坏多糖机构，经1次处理基本能将粗多糖中的蛋白和色素除去，同时仍然可以保留大部分多糖，可得到比较理想的脱蛋白和色素效果。

考虑到蛋白酶和反胶束反应体系中都存在各因素对实验效果的影响，例如当伴随着酶量的增加样品中蛋白含量也随之增加；随着时间的增加，降解蛋白增多，酶活力下降，空间位阻效应也随之增加，使去除速率逐渐减小，酶的水解作用结束；反胶束的体系中表面活性剂虽然不会影响其体积，但会影响在单位体积有机相中的数量，而反胶束的极性水池又是萃取色素基团的场所；反胶束萃取过程中向多糖液加盐是为了便于相间的分离，防止两相乳化过于严重而无法分相，但是加入到多糖液中的盐会对蛋白和色素与反胶束之间的静电吸引作用产生屏蔽，使吸引力减弱，从而降低萃取率；本发明又考虑到了实验所用有机溶剂难以回收、成本较高，以及多糖的损失量，因此本发明限定了各试剂的优化用量范围及最适的脱除条件。

除此之外，蛋白酶-CTAB法也可用于多种天然化合物多糖类提纯，从而提高多糖的得率，达到蛋白和色素分子单次操作一体化去除的效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种从红毛五加多糖提取液中高效快速脱除蛋白及色素的方法，其特征在于，采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)反胶束处理液处理含氯化钠的红毛五加粗多糖提取液；其中，所述反胶束处理液由十六烷基三甲基溴化铵以及复合溶剂组成，所述的复合溶剂包括有机溶剂与水，反胶束处理液中CTAB的含量为0.1-0.2mol/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为正已醇/异辛烷混合溶剂，其中，水：正已醇：异辛烷的体积比为30:5-10:60-65。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用反胶束处理液处理红毛五加粗多糖提取液的具体过程如下：加入NaCl至适量浓度，然后以5-6:1的体积比向粗多糖提取液中加入反胶束处理液，剧烈震荡后离心分层，取下层溶液。

4.一种从红毛五加多糖提取液中高效快速脱除蛋白及色素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：提取红毛五加粗多糖；

S2：配制反胶束处理液；

S3：使用反胶束处理液处理粗多糖溶液，快速同步脱除蛋白及色素；

以及，任选的后续透析纯化处理步骤；

其中，所述的反胶束处理液由十六烷基三甲基溴化铵溶于正已醇/异辛烷与水组成的混合溶剂得到；其中，水：正已醇：异辛烷的体积比为30:5-10:60-65。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，脱蛋白及色素步骤之前还包括预先使用蛋白酶对粗多糖溶液进行酶解处理。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S1具体操作如下：

1)原料预处理：

将干燥后的红毛五加粉碎，过40-60目筛，将粗粉按1g:8-10ml的料液比添加85-95％体积分数的乙醇溶液，35-45℃回流脱脂1-2h，除去脂类、单双糖等成分，减压过滤，将滤饼中的乙醇溶剂蒸干，回收粉末备用；

2)提取粗多糖：

将脱脂处理过的红毛五加与去离子水按料液比1g:10-15ml的比例混合，在50-60℃下浸泡3-5h，然后在90-100℃下超声处理15-30min后进行回流提取2-3次，每次40-60min，合并收集提取液；

以8000-8500rpm离心20-30min并收集上清液，真空浓缩至原药材量的1-1.5倍重量，将浓缩后的滤液加入4-5倍体积的95％乙醇进行室温醇沉16-24h，抽滤，将醇沉后的上清液减压浓缩回收乙醇溶剂后，对浓缩液再次醇沉，合并沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮淋洗，干燥，即得红毛五加粗多糖。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2具体操作如下：取适量十六烷基三甲基溴化铵溶于正已醇/异辛烷与水组成混合溶剂，充分混匀，得到反胶束处理液；其中，所述混合溶剂中，水：正已醇：异辛烷的体积比为30:5-10:60-65，优选30:5:65；所述反胶束处理液中CTAB的含量为0.1-0.2mol/L，优选0.1-0.15mol/L，最优选0.1-0.12mol/L。

8.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，同步脱蛋白及色素的具体流程如下：

1)将粗多糖溶于蒸馏水，配制成10-30mg/ml的粗多糖溶液；取适量多糖溶液，加入蛋白水解酶，在酶适条件下振荡酶解反应1-3h，然后于沸水浴中灭活5-15min，冷却至室温；

2)快速脱除蛋白及色素：加入NaCl至浓度0.4-0.6mol/L，然后以溶液体积的1/6至1/5比例向溶液中加入反胶束处理液，剧烈震荡5-15min，然后8000-10000rpm离心10-15min使溶液分层，取下层溶液；

优选地，加入NaCl至浓度0.4-0.5mol/L。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤1)中，酶解条件为：向粗多糖溶液中加入木瓜蛋白酶，调整pH为6.5-7.0，置于55～65℃下酶解60-120min。

10.根据权利要求1-9所述的方法制备得到的红毛五加多糖。