CN103232552A - 一种酶法制备褐藻岩藻聚糖与岩藻黄素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种酶法制备褐藻岩藻聚糖与岩藻黄素的方法。具体步骤为：褐藻干粉的制备；褐藻干粉的酶解：将所述褐藻干粉与复合酶制剂混匀后加入去离子水进行酶解；酸处理；浓缩液的获得；岩藻聚糖的获得：岩藻黄素粗品的获得和纯品岩藻黄素的获得。所述复合酶由果胶酶、半纤维素酶、纤维素酶组成。采用本发明的方法所得到的褐藻岩藻聚糖与岩藻黄素得率高。方法操作简单、环保高效、适合于规模化操作的从褐藻中同时提取高纯度岩藻聚糖及岩藻黄素。
Description
技术领域
本发明涉及岩藻聚糖与岩藻黄素制备工艺领域，具体涉及一种酶法制备褐藻岩藻聚糖与岩藻黄素的方法。
背景技术
褐藻富含活性多糖、类胡萝卜素等功能活性物质，是开发药物、功能性食品的资源宝库。但是，长期以来褐藻（如海带）只是作为鲜食原料、低档加工食品或工业产品如琼脂、褐藻胶等被消费，褐藻的潜在经济价值远未被充分挖掘。现代医学及生物学研究表明，褐藻中富含海洋硫酸多糖（岩藻聚糖）（3-4%）、岩藻黄素（0.5%）等功能活性物质，它们在保肝、抗病毒、抗凝血、抗炎等生物功能方面显示了良好的功效。因此，利用褐藻提取岩藻聚糖及岩藻黄素具有巨大的潜在经济价值。
然而，目前用于制备褐藻活性物质的工艺技术主要针对某一种活性物质，例如，在提取岩藻聚糖的同时，没有兼顾岩藻黄素的制备，这样就造成了资源的极大浪费。另外，由于岩藻聚糖被细胞壁的纤维组织包裹，而岩藻黄素又分布在褐藻细胞内，因此常规技术提取岩藻聚糖和岩藻黄素的效率较低。
因而，目前的工艺仍有待改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、环保高效、适合于规模化操作的从褐藻中同时提取高纯度岩藻聚糖及岩藻黄素的制备方法。
为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：
提供一种酶法制备岩藻聚糖与岩藻黄素的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
褐藻干粉的制备：褐藻干品经除杂、烘干、粉碎、过筛制成褐藻干粉；所述褐藻为海带、裙带菜、羊栖菜中的至少一种；过筛80-100目。
褐藻干粉的酶解：将所述褐藻干粉与复合酶制剂混匀后加入去离子水，于常温下酶解一定时间，离心，分别收集上清液和褐藻渣；往所述褐藻渣中再次加入去离子水，重复前述的步骤，分别收集上清液和褐藻渣；
任选的，还可以包括继续往所述褐藻渣中加入去离子水，重复前述步骤，分别收集上清液和褐藻渣；
酸处理：合并上述上清液，加入盐酸溶液，使盐酸的浓度达一定值后静置一段时间，离心除去沉淀，上清液用氢氧化钠中和至中性；
浓缩液的获得：所述中和至中性的上清液采用超滤膜浓缩；优选为分子截留量为5万的超滤膜；
岩藻聚糖的获得：往所述浓缩液中加入食品级无水乙醇，使之达到一定浓度,静置后离心,取上清液；继续往上清液中加入无水乙醇，使之达到一定浓度，静置后离心，沉淀经真空干燥得到岩藻聚糖；
任选的，还可以包括继续往上清液中加入无水乙醇，重复前述步骤，所得沉淀经真空干燥得到岩藻聚糖；
岩藻黄素粗品的获得：在褐藻干粉的酶解步骤所得的褐藻渣中加入食品级无水乙醇，室温下避光提取，离心，收集上清液；上清液减压浓缩至干，得到岩藻黄素粗品；
纯品岩藻黄素的获得：将所述岩藻黄素粗品溶解于无水乙醇后，缓慢加入到硅胶层析柱中，然后用乙醇进行洗脱，所得岩藻黄素洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥得到纯品岩藻黄素。
所述褐藻干粉的酶解中，所述复合酶制剂由果胶酶、半纤维素酶、纤维素酶组成，优选组成比例w/w为1:1:1；
任选的，所述褐藻干粉与复合酶制剂的重量比为10000:1-20；
任选的，褐藻干粉与复合酶制剂总和与去离子水的比例为1:15-25的重量/体积比；
任选的，加入去离子水后于常温下酶解5-8小时。
所述酸处理中，加入4 N浓度的盐酸溶液，使盐酸的浓度达到0.1mol/L，静置15-20分钟后离心除去沉淀，上清液用6 N浓度的氢氧化钠中和至中性。
所述浓缩液的获得中采用的是分子截留量为5万道尔顿的超滤膜。
所述岩藻聚糖的获得中，浓缩液中加入食品级无水乙醇，使之达到浓度35%,静置2小时后离心,取上清液；继续往上清液中加入无水乙醇，使之浓度达到60%，静置2小时后离心，沉淀经真空干燥得到岩藻聚糖。
所述岩藻黄素粗品的获得中，所述褐藻渣中与食品级无水乙醇的重量体积比为1:3-5，；
任选的，室温下避光提取2-5小时。
所述纯品岩藻黄素的获得中，所述岩藻黄素粗品与无水乙醇的重量体积比为1:2；
任选的，硅胶层析柱为2-15 cm×80 cm；，
任选的，乙醇以5-500 ml/min的速度洗脱。
本发明还保护上述任一方法所得的岩藻聚糖与岩藻黄素。
本项发明通过生物酶破壁技术降解坚硬的褐藻细胞壁，使包裹在纤维组织中的岩藻聚糖以及细胞内的岩藻黄素充分溶出，同时采用柱层析技术进行分离纯化，实现了高纯度岩藻聚糖和岩藻黄素的联合制备。
本发明的方法操作简单、环保高效、适合于规模化操作，可应用于工业化生产。
本发明的实施例，提供了海带等的制备方法，其岩藻聚糖和岩藻黄素的得率较高，实施例1中，100kg干海带，最终得到2.5kg岩藻聚糖纯品，岩藻黄素纯品0.4kg；实施例2中，100kg干裙带菜，最终得到1.8kg岩藻聚糖纯品，岩藻黄素纯品0.3kg；实施例3中，100kg干羊栖菜，最终得到1.8kg岩藻聚糖纯品，岩藻黄素纯品0.25kg。
当按本发明步骤对褐藻采用生物酶处理破壁，使褐藻中的岩藻聚糖及岩藻黄素能充分溶出，从而显著提高提取效率。通过光学显微镜观察生物酶对褐藻细胞壁的破坏效果，结果见图1。从图1可知，酶处理前褐藻细胞排列紧密、完整，当按本发明步骤对褐藻进行酶处理后，褐藻细胞壁基本完全破坏，且液态化明显。
褐藻细胞壁主要由果胶、半纤维素及纤维素构成，因此，利用果胶酶、半纤维素酶及纤维素酶能有效破坏褐藻的细胞壁结构。实验以海带为原料，对各种酶及其复合制剂的破壁效果进行了对比研究，海带粉(80目)与生物酶的比例固定为10000 ：5 (w/w)，室温下水解5 h，为以岩藻聚糖和岩藻黄素的得率判断生物酶的最佳配比，结果如表1 所示。实验结果发现，使用生物酶破壁处理以后，岩藻聚糖及岩藻黄素的得率都明显提高，单独使用果胶酶、半纤维素酶、纤维素酶或以上三种酶的两两组合皆不如同时使用该三种酶的破壁效果。同时，试验发现，果胶酶、半纤维素和纤维素酶的配比为1:1:1（w/w）时的破壁效果与其它配比在统计学上并无显著差异。同时，通过改变果胶酶、半纤维素酶和纤维素酶的比例，发现各种配比的复合酶的破壁效果皆无显著性差异，所以果胶酶、半纤维素和纤维素酶可以以任意配比进行组合。
表1 生物酶破壁对海带岩藻聚糖及岩藻黄素提取率的影响
比较制得的岩藻黄素粗品（中间产品，未纯化）与制得的岩藻黄素（也叫岩藻黄素纯品，终产品，已纯化），采用液相色谱法检测其纯度，以验证所述步骤的合理性，见图2。从图2中可以看出，采用本发明制备的岩藻黄素纯度可达95%以上，效果十分显著。
本发明方法适合于从褐藻中同时提取高纯度的岩藻聚糖和岩藻黄素。对于利用褐藻岩藻聚糖及岩藻黄素开发功能性食品及天然药物，具有重要的实际应用价值。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1：干海带制备岩藻聚糖及岩藻黄素
（1）取干海带100 Kg，除去沙土、杂物，进行烘干、粉碎、过筛80目制成海带干粉；
（2）取上述海带干粉50 Kg与25 g复合酶充分混匀，加入去离子水750 L,搅拌均匀。20 ℃室温下反应5 h后，采用管式连续离心机离心（每分钟10000转，10分钟），得上清液约400 Kg，海带渣400 Kg。该步骤对褐藻采用生物酶处理破壁，使褐藻中的岩藻聚糖及岩藻黄素能充分溶出，从而显著提高提取效率。通过光学显微镜观察生物酶对褐藻细胞壁的破坏效果（见图1）。由图1可以看出，酶处理前褐藻细胞排列紧密、完整，当按步骤2对褐藻进行酶处理后，褐藻细胞壁基本完全破坏，且液态化明显；
（3）上述海带渣再加入800 L去离子水，在上述条件下进行提取、离心，提取时间为2 h，得上清液约900 Kg，海带渣约300 Kg；
（4）将两次的上清液合并，浓盐酸（HCl）配成4 mol/L浓度，按比例添加于上清液，使其HCl浓度达到0.1 mol/L。放置15分钟后采用管式连续离心机离心，沉淀物主要为褐藻酸杂质。得上清液约900 Kg；
（5）固体氢氧化钠（NaOH）配成6 N浓度溶液，用于中和上述制成的上清液，使上清液的pH值调节为6.8，然后用分子截留量为5万的中空纤维素膜将上清液的体积浓缩至1/5，质量约为220 Kg；
（6）上述浓缩溶液中加入浓度95%的食用乙醇，使溶液的乙醇浓度达到30%，放置沉淀2小时后，离心除去沉淀物（杂质蛋白质、杂多糖等），得上清液约200 Kg，继续添加浓乙醇，使乙醇的最终的浓度达到60%。放置沉淀2小时后，离心取沉淀物,并经真空干燥得到约2.5 Kg的岩藻聚糖纯品；
（7）上述海带渣加入900 L浓度95%的食用乙醇，于20 ℃室温下避光浸提2 h，然后采用管式连续离心机离心，收集上清液，约700 Kg；
（8）岩藻黄素提取液减压浓缩至干，得岩藻黄素粗提物约1.8 Kg。制得的岩藻黄素粗品（中间产品，未纯化）采用液相色谱法检测其纯度，见图2；
（9）上述岩藻黄素粗提物用3.6 L乙醇溶解后，缓慢加入到硅胶层析柱中（15 cm×80 cm），然后用100 L乙醇以500 ml/min的速度洗脱，前30 L主要是叶绿素等杂质，后70 L为岩藻黄素洗脱液，岩藻黄素洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥得到纯品岩藻黄素0.4 Kg。制得的岩藻黄素纯品（终产品，已纯化）采用液相色谱法检测其纯度，见图2。
从图2可以看出，采用本发明制备的岩藻黄素纯度可达95%以上，效果十分显著。
实施例2：干裙带菜制备岩藻聚糖及岩藻黄素
（1）取干裙带菜100 Kg，除去沙土、杂物，进行烘干、粉碎、过筛80目制成裙带菜干粉；
（2）取上述裙带菜干粉50 Kg与100 g复合酶充分混匀，加入去离子水1000 L,搅拌均匀。20 ℃室温下反应7 h后，采用管式连续离心机离心（每分钟10000转，10分钟），得上清液约600 Kg，裙带菜渣450 Kg；
（3）上述裙带菜渣再加入900 L去离子水，在上述条件下进行提取、离心，提取时间为2 h，得上清液约900 Kg，裙带菜渣约300 Kg；
（4）将两次的上清液合并，浓盐酸（HCl）配成4 mol/L浓度，按比例添加于上清液，使其HCl浓度达到0.1 mol/L。放置20分钟后采用管式连续离心机离心，沉淀物主要为褐藻酸杂质。得上清液约1000 Kg；
（5）固体氢氧化钠（NaOH）配成6 N浓度溶液，用于中和上述制成的上清液，使上清液的pH值调节为6.8，然后用分子截留量为5万的中空纤维素膜将上清液的体积浓缩至1/6，质量约为220 Kg；
（6）岩藻聚糖的纯化同实施例1，得到约1.8 Kg的岩藻聚糖纯品；
（7）上述裙带菜渣加入1800 L浓度95%的食用乙醇，于20 ℃室温下避光浸提3 h，然后采用管式连续离心机离心，收集上清液，约700 Kg；
（8）岩藻黄素提取液减压浓缩至干，得岩藻黄素粗提物约1.4 Kg；
（9）岩藻黄素粗提物的纯化同实施例1，得岩藻黄素纯品0.3 Kg。
实施例3：干羊栖菜制备岩藻聚糖及岩藻黄素
（1）取干羊栖菜100 Kg，除去沙土、杂物，进行烘干、粉碎、过筛80目制成羊栖菜干粉；
（2）取上述羊栖菜干粉50 Kg与5g复合酶充分混匀，加入去离子水1250 L,搅拌均匀。20 ℃室温下反应8 h后，采用管式连续离心机离心（每分钟10000转，10分钟），得上清液约920 Kg，羊栖菜渣380 Kg；
（3）上述羊栖菜渣再加入800 L去离子水，在上述条件下进行提取、离心，提取时间为2 h，得上清液约900 Kg，羊栖菜渣约280 Kg；
（4）将两次的上清液合并，浓盐酸（HCl）配成4 mol/L浓度，按比例添加于上清液，使其HCl浓度达到0.1 mol/L。放置25分钟后采用管式连续离心机离心，沉淀物主要为褐藻酸杂质。得上清液约1300 Kg；
（5）固体氢氧化钠（NaOH）配成6 N浓度溶液，用于中和上述制成的上清液，使上清液的pH值调节为6.8，然后用分子截留量为5万的中空纤维素膜将上清液的体积浓缩至1/7，质量约为210 Kg；
（6）岩藻聚糖的纯化同实施例1，得到约1.8 Kg的岩藻聚糖纯品；
（7）上述羊栖菜渣加入1900 L浓度95%的食用乙醇，于20 ℃室温下避光浸提5 h，然后采用管式连续离心机离心，收集上清液，约650 Kg；
（8）岩藻黄素提取液减压浓缩至干，得岩藻黄素粗提物约1.1 Kg；
（9）岩藻黄素粗提物的纯化同实施例1，得岩藻黄素纯品0.25 Kg。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种酶法制备岩藻聚糖与岩藻黄素的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
褐藻干粉的制备：褐藻干品经除杂、烘干、粉碎、过筛制成褐藻干粉；
褐藻干粉的酶解：将所述褐藻干粉与复合酶制剂混匀后加入去离子水，于常温下酶解一定时间，离心，分别收集上清液和褐藻渣；往所述褐藻渣中再次加入去离子水，重复前述的步骤，分别收集上清液和褐藻渣；
任选的，还可以包括继续往所述褐藻渣中加入去离子水，重复前述步骤，分别收集上清液和褐藻渣；
酸处理：合并上述上清液，加入盐酸溶液，使盐酸的浓度达一定值后静置一段时间，离心除去沉淀，上清液用氢氧化钠中和至中性；
浓缩液的获得：所述中和至中性的上清液采用超滤膜浓缩；
岩藻聚糖的获得：往所述浓缩液中加入食品级无水乙醇，使之达到一定浓度,静置后离心,取上清液；继续往上清液中加入无水乙醇，使之达到一定浓度，静置后离心，沉淀经真空干燥得到岩藻聚糖；
任选的，还可以包括继续往上清液中加入无水乙醇，重复前述步骤，所得沉淀经真空干燥得到岩藻聚糖；
岩藻黄素粗品的获得：在褐藻干粉的酶解步骤所得的褐藻渣中加入食品级无水乙醇，室温下避光提取，离心，收集上清液；上清液减压浓缩至干，得到岩藻黄素粗品；
纯品岩藻黄素的获得：将所述岩藻黄素粗品溶解于无水乙醇后，缓慢加入到硅胶层析柱中，然后用乙醇进行洗脱，所得岩藻黄素洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥得到纯品岩藻黄素。
2.权利要求1的酶法制备岩藻聚糖与岩藻黄素的方法，其特征在于：所述褐藻为海带、裙带菜、羊栖菜中的至少一种。
3.权利要求1的酶法制备岩藻聚糖与岩藻黄素的方法，其特征在于：所述褐藻干粉的制备中，过筛80-100目。
4.权利要求1的酶法制备岩藻聚糖与岩藻黄素的方法，其特征在于：所述褐藻干粉的酶解中，所述复合酶制剂由果胶酶、半纤维素酶、纤维素酶组成，优选组成比例w/w为1:1:1；
任选的，所述褐藻干粉与复合酶制剂的重量比为10000:1-20；
任选的，褐藻干粉与复合酶制剂总和与去离子水的比例为1:15-25的重量/体积比；
任选的，加入去离子水后于常温下酶解5-8小时。
5.权利要求1的酶法制备岩藻聚糖与岩藻黄素的方法，其特征在于：所述酸处理中，加入4 N浓度的盐酸溶液，使盐酸的浓度达到0.1mol/L，静置15-20分钟后离心除去沉淀，上清液用6 N浓度的氢氧化钠中和至中性。
6.权利要求1的酶法制备岩藻聚糖与岩藻黄素的方法，其特征在于：所述浓缩液的获得中采用的是分子截留量为5万道尔顿的超滤膜。
7.权利要求1的酶法制备岩藻聚糖与岩藻黄素的方法，其特征在于：所述岩藻聚糖的获得中，浓缩液中加入食品级无水乙醇，使之达到浓度35%,静置2小时后离心,取上清液；继续往上清液中加入无水乙醇，使之浓度达到60%，静置2小时后离心，沉淀经真空干燥得到岩藻聚糖。
8.权利要求1的酶法制备岩藻聚糖与岩藻黄素的方法，其特征在于：所述岩藻黄素粗品的获得中，所述褐藻渣中与食品级无水乙醇的重量体积比为1:3-5；
任选的，室温下避光提取2-5小时。
9.权利要求1的酶法制备岩藻聚糖与岩藻黄素的方法，其特征在于：所述纯品岩藻黄素的获得中，所述岩藻黄素粗品与无水乙醇的重量体积比为1:2；
任选的，硅胶层析柱为2-15 cm×80 cm；，
任选的，乙醇以5-500 ml/min的速度洗脱。
10. 权利要求1-9任一方法所得的岩藻聚糖与岩藻黄素。
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