CN107188870A - 一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法 - Google Patents

一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法，涉及生物技术领域。一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法，包括：将褐藻冷冻干燥后粉碎，得到褐藻粉末。将褐藻粉末和复合酶混合后，加入乙醇后得到原料液。原料液进行微波萃取3～8min得到萃取液。复合酶为质量比为1:0.5～4的果胶酶和纤维素酶。将萃取液进行固液分离。微波萃取协同酶解，能够迅速使褐藻的细胞壁破裂，细胞内的有效成分溶出，反应条件温和，操作简单、绿色安全环保。两种萃取方法结合，萃取质量高，能有效保护褐藻中的岩藻黄素不受到破坏。得到的萃取物产量大，且具有节约时间、减少溶剂用量、低耗能等优点。

Description

一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，且特别涉及一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法。
背景技术
岩藻黄素又称岩藻黄质、褐藻黄素，是一种重要的脂溶性类胡萝卜素，广泛分布于海藻、海洋浮游植物、水生贝壳等海洋动植物中。其中以褐藻含量最高，是海带、裙带菜、羊栖菜等可食性褐藻中的重要功能活性物质，也是使褐藻类呈现出褐色的物质。其结构中含有多个共轭双键，能溶于乙醇、丙酮、甲醇等有机溶剂，并具有丙二烯和环氧烷等特殊结构，稳定性差易氧化。岩藻黄素具有极高的药用价值，在抗肿瘤方面有着特殊的作用，可阻断肿瘤细胞有丝分裂，诱导细胞凋亡。因此岩藻黄素在医药、食品、美容、保健品等方面具有广阔的开发应用前景，经济价值极高。
海带是一种常见的实用性藻类，在热带和温带的海岸附近的浅海中居多，我国的海带产量位居世界第一，每一年可生产上万吨。海带中富含岩藻黄素，而且在海带的类胡萝卜中其岩藻黄素的含量达到60％以上。但是近些年以来，在国内和岩藻黄素有关的研究并不多，一部分是研究海带、羊栖菜等藻类中岩藻黄素的分离提纯，一部分是研究岩藻黄素的性质结构、生物效应、作用机理、提取工艺等，但是还没能达到将岩藻黄素工业化的生产的要求。若能对海带进行加工，提取岩藻黄素，不但可提高海带的附加经济价值，还可增加岩藻黄素供应量。
发明人研究发现，岩藻黄素具有光敏性和热敏性的特点，容易在提取过程中受到损失。采用常见的有溶剂浸提法、超临界CO2萃取法、超声波辅助提取法等提取褐藻中的岩藻黄素，提取效率低，提取效果差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法，此方法操作简单、反应条件温和、提取效率高，能够达到良好的提取效果。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其包括以下步骤：
预处理步骤：将褐藻冷冻干燥后粉碎，得到褐藻粉末；
萃取步骤：将褐藻粉末和复合酶混合后，加入乙醇后得到原料液，原料液进行微波萃取3～8min得到萃取液，其中，复合酶为质量比为1:0.5～4的果胶酶和纤维素酶。
分离步骤：将所述萃取液进行固液分离。
本发明实施例的从褐藻中提取岩藻黄素的有益效果是：
褐藻是一种来源广泛的藻类，原料易得，成本低廉。在预处理阶段将褐藻进行冷冻干燥后粉碎，而不是采取传统的烘干或者晒干等干燥方式，有效保持了褐藻中的岩藻黄素，避免其受到温度影响而遭受损失，有效提高提取效果。同时避免常温常压粉碎对热敏性的岩藻黄素的破坏。
采用复合的果胶酶和纤维素酶对褐藻粉末进行酶解，同时辅助微波进行萃取。复合酶能够有效破坏褐藻的细胞壁，提高岩藻黄素的溶出率。微波萃取协同酶解，能够迅速使褐藻的细胞壁破裂，细胞内的有效成分溶出，反应条件温和，操作简单。无需使用有毒的化学试剂，绿色安全环保。两者萃取方法结合，萃取质量高，能有效保护褐藻中的岩藻黄素不受到破坏。得到的萃取物产量大，且具有节约时间、减少溶剂用量、低耗能等优点，具有广阔的应用前景，为褐藻产业的深加工提供了新方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1的步骤图；
图2为本发明试验例1的褐藻粉末粒径对提取率的影响结果图；
图3为本发明试验例2的果胶酶和纤维素酶比例对提取率的影响结果图；
图4为本发明试验例3的复合酶用量对提取率的影响结果图；
图5为本发明试验例4的乙醇用量对提取率的影响结果图；
图6为本发明试验例5的微波温度对提取率的影响结果图；
图7为本发明试验例6的微波时间对提取率的影响结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的从褐藻中提取岩藻黄素的方法进行具体说明。
本发明实施例提供的一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其包括以下步骤：
首先，对褐藻进行预处理：将褐藻冷冻干燥后粉碎，得到褐藻粉末。
褐藻是一种藻类植物，其来源广泛，易得。在本发明较佳的实施例中，褐藻选自海带、裙带菜、铁钉菜、鹿角菜、羊栖菜中的一种或多种，但不局限于此。更为优选的，选用海带作为提取岩藻黄素的原料。海带是一种常见的褐藻类植物，我国的海带产量高达40万吨，居世界首位。海带中含有大量岩藻黄素。但目前国内外尚无工业化提取海带中的岩藻黄素的方法。
在预处理过程，将褐藻进行冷冻干燥后粉碎，有效保持褐藻中的岩藻黄素，避免其受到温度影响而遭受损失，有效提高提取效果。同时避免常温常压粉碎对热敏性的岩藻黄素的破坏。
进一步优选地，冷冻干燥过程中，控制褐藻粉末的粒径小于或等于0.25mm。进一步地，褐藻粉末的粒径优选为0.09～0.125mm。
褐藻粉末的粒径越小，比表面积越大，能够加快酶解反应，增强微波萃取效果，褐藻粉末的粒径的小于0.25mm时能够得到较佳的提取效果。要得到粒径较小的褐藻粉末，需要较大的能耗，基于能耗和提取效果的双重考量，褐藻粉末的粒径在0.09～0.125mm时，既能得到良好的提取效果，又不需要浪费过多的能源。
接着，对褐藻粉末进行萃取：将褐藻粉末和复合酶混合后，加入乙醇后得到原料液。原料液进行微波萃取3～8min得到萃取液。其中，复合酶为质量比为1:0.5～4的果胶酶和纤维素酶。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，原料液在进行微波萃取前，在40～60℃条件下水浴5～15min。在微波萃取前，先进行水浴，能够使得褐藻粉末、复合酶在乙醇中充分混合，加快后续的反应进程。同时，该步骤能够可以成为复合酶的活化步骤，增加复合酶活性。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，原料液在进行微波萃取前，调节原料液的pH为4～7。例如采用醋酸-醋酸钠缓冲液调节原料液的pH。在该pH值下，能够保证复合酶的最大酶活性，有效保证提取效果。
褐藻的细胞壁分两层，内层为纤维素组成，外层为褐藻胶组成。其细胞结构紧密、质地坚韧，所含有的岩藻黄素不易被提取。果胶酶和纤维素酶均为植物细胞壁降解酶，纤维素酶能够分解褐藻细胞中的纤维素，果胶酶能够分解褐藻细胞壁中的褐藻胶。通过两种酶的复合酶解作用，使得褐藻细胞的结构迅速受到破坏，使岩藻黄素快速、大量溶出。
复合酶为质量比为1:0.5～4的果胶酶和纤维素酶。进一步地，果胶酶和纤维素酶的质量比为1:3。该配比下，复合酶的酶解效果最佳，产物的提取率最高。
通过复合酶的酶解效应和微波效应，能够迅速使褐藻细胞壁纤维质发生降解和破坏，改变褐藻细胞壁的结构层，是细胞内的岩藻黄素迅速溶出，岩藻黄素的提取效率和提取量都得到明显提升，原料的利用率更高。此外，微波协同酶解，能够有效降低反应温度和反应时间，有效保护热敏性的岩藻黄素不受到破坏。同时，减少有机溶剂的用量，安全无毒，绿色环保。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，复合酶和褐藻粉末的质量比为1～3:20。进一步优选地，复合酶和褐藻粉末的质量比为1:10。在合适的底物浓度和酶浓度下，能够得到提取效率高、提取量大的产品。复合酶用量过少，则无法达到较好的提取效果，复合酶用量过多，则会造成浪费。
以乙醇作为提取溶剂，乙醇成本低，且无毒害，环境友好。采用乙醇作为溶剂提取得到的产品可作为生物医药制品原料使用，增强了产品的利用价值和使用范围。进一步地，在本发明较佳的实施例中，褐藻粉末和乙醇的料液比为1:20～50g/mL。料液比过大造成溶剂的浪费，料液比过小，则无法高效高质地对岩藻黄素进行提取。进一步地，褐藻粉末和乙醇的料液比为1:30～40g/mL，该比例下，能够以较少的溶剂达到较佳的提取效果。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，萃取步骤中，控制微波萃取的温度为40～50℃。萃取步骤中，控制微波萃取的萃取时间为3～8min，进一步优选为4～6min。
微波时间和微波温度对岩藻黄素的提取效果具有重要影响。微波的作用不仅在于破坏褐藻粉末细胞，加速有效物质溶出。微波过程中，还会对复合酶产生影响。微波温度过高或时间过长，会破坏复合酶的活性，产生不利影响。采用低温短时间微波，一方面是保证在不破坏岩藻黄素的前提下，微波所产生的电磁场可加快褐藻粉末中的有效成分由粉末内部向固液界面扩散的速度，提高提取速率，增大提取量；另一方面是低温短时间微波能够使酶的活性位点“裸露”出来，使酶能够更好地与底物进行接触，提高提取效率。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，原料液在微波萃取过程中，采用间歇萃取方式，萃取2～5次。例如每次萃取0.8～2min，萃取2～4次。间歇萃取的方式，能够避免过度升温，造成有效成分的破坏。
进一步地，原料液在密封容器中进行微波萃取，能够提高岩藻黄素的提取效率。
得到萃取液后，进行分离步骤：将萃取液进行固液分离。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，分离步骤中，固液分离后得到固相和液相，液相经过膜过滤除去杂质。进一步地，液相去除杂质后进行真空干燥。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其包括：
预处理：褐藻洗净去除泥沙，冷冻干燥并粉碎，粒径为0.09～0.125mm。
复合酶制备：果胶酶：纤维素酶＝1:3。
萃取：经过预处理后的褐藻粉与复合酶进行混合，加入乙醇搅拌后送入微波室，低温微波协同萃取，微波温度为45℃，微波时间为4min(萃取次数为3次，分别萃取1min、2min、1min)。
分离：微波后，进行固液分离，液相进0.45um膜过滤，滤去杂质后，冷冻干燥得到岩藻黄素。
实施例2
本实施例提供的一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其包括：
预处理：褐藻洗净去除泥沙，冷冻干燥并粉碎，粒径为0.15～0.25mm。
复合酶制备：果胶酶：纤维素酶＝2:1。
萃取：经过预处理后的褐藻粉与复合酶进行混合，加入乙醇搅拌后送入微波室，低温微波协同萃取，微波温度为40℃，微波时间为8min(萃取次数为4次，每次2min)。其中，褐藻粉末与复合酶的质量比为20:3，褐藻粉末与乙醇的料液比为1:30g/mL。
分离：微波后，进行固液分离，液相进0.45um膜过滤，滤去杂质后，冷冻干燥得到岩藻黄素。
实施例3
本实施例提供的一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其包括：
预处理：褐藻洗净去除泥沙，冷冻干燥并粉碎，粒径为0.15～0.25mm。
复合酶制备：果胶酶：纤维素酶＝1:1。
萃取：经过预处理后的褐藻粉与复合酶进行混合，加入乙醇搅拌后送入微波室，低温微波协同萃取，微波温度为55℃，微波时间为6min(萃取次数为4次，每次1.5min)。其中，褐藻粉末与复合酶的质量比为20:1，褐藻粉末与乙醇的料液比为1:20g/mL。
分离：微波后，进行固液分离，液相进0.45um膜过滤，滤去杂质后，冷冻干燥得到岩藻黄素。
实施例4
本实施例提供的一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其包括：
预处理：褐藻洗净去除泥沙，冷冻干燥并粉碎，粒径为0.125～0.15mm。
复合酶制备：果胶酶：纤维素酶＝1:4。
萃取：经过预处理后的褐藻粉与复合酶进行混合，加入乙醇搅拌后送入微波室，低温微波协同萃取，微波温度为50℃，微波时间为3min。其中，褐藻粉末与复合酶的质量比为10:1，褐藻粉末与乙醇的料液比为1:35g/mL。
分离：微波后，进行固液分离，液相进0.45um膜过滤，滤去杂质后，冷冻干燥得到岩藻黄素。
对比例1
本对比例提供的一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其包括：
预处理：褐藻洗净去除泥沙，冷冻干燥并粉碎，粒径为0.09～0.125mm。
萃取：经过预处理后的褐藻粉，加入乙醇搅拌后送入微波室，微波温度为45℃，微波时间为4min(萃取次数为3次，分别萃取1min、2min、1min)。其中，褐藻粉的用量为1g、乙醇的用量为40mL。
分离：微波后，进行固液分离，液相进0.45um膜过滤，滤去杂质后，冷冻干燥得到岩藻黄素。
对比例2
本实施例提供的一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其包括：
预处理：褐藻洗净去除泥沙，冷冻干燥并粉碎，粒径为0.09～0.125mm。
复合酶制备：果胶酶：纤维素酶＝1:3。
萃取：经过预处理后的褐藻粉与复合酶进行混合，加入乙醇搅拌后在45℃条件下水浴提取40min。
分离：提取完成后，进行固液分离，液相进0.45um膜过滤，滤去杂质后，冷冻干燥得到岩藻黄素。
试验例1
将褐藻冷冻干燥后，粉碎至不同的粒径。采取同样的萃取条件进行微波协同复合酶萃取，并测定岩藻黄素的提取率。测定结果如图2所示。
由图2可见，随着海带粉末粒径的慢慢变小，岩藻黄素的提取率呈逐步上升的趋势，直至当海带粉末粒径在0.125～0.009mm到＜0.009mm这个区间内时呈现一个飞跃。即在这个区间内出现提取率的最大值，所以相同条件下，想要获得岩藻黄素的最大提取率海带粉末的粒径应该在0.125～0.009mm到＜0.009mm这个区间内。通过分析，出现这一趋势的原因应该是随着海带粉末粒径的减小，海带粉末和乙醇溶液的接触面积逐渐增大，两者相互融合反应更加充分，使得岩藻黄素的提取效率提高。粒径越小，耗能越大，综合考量提取率和能耗双重因素，褐藻粉末的粒径优选为0.09～0.125mm。
试验例2
考察不同比例的复合酶对岩藻黄素提取效果的影响。采取同样的萃取条件进行微波协同复合酶萃取，加入复合酶量固定，分别考察当果胶酶与纤维素酶的质量比分别为1:1、1:2、1:3、2:1、3:1时，岩藻黄素的提取效果。结果如图3所示。
由图3可见，当不同比例的复合酶，提取效果不同。当果胶酶与纤维素酶的质量比为1:3时，提取率达到最高，提取效果最好。
试验例3
考察不同的复合酶用量对岩藻黄素提取效果的影响。采取同样的萃取条件进行微波协同复合酶萃取，分别考察当复合酶的用量不同时，岩藻黄素的提取效果。结果如图4所示。
由图4可见，随着复合酶用量的不同，岩藻黄素的提取率呈现先增加后降低的趋势。反应底物褐藻粉与复合酶之间存在一个量化关系，使得酶解效果逐渐加强，从而提高细胞膜破除率，增加岩藻黄素的提取效率。而当复合酶量加入再加大时，细胞膜破除更加完全，此时细胞内的其它杂志亦被提取出来，从而影响到岩藻黄素的提取，或者岩藻黄素的性质并不稳定定，可能当酶的量过多时，会产生某些物质使岩藻黄素分解。当复合酶的用量为0.1g时，提取效果达到最佳。即当复合酶与褐藻粉末的用量比为1:10时，提取效果最好。
试验例4
考察不同的料液比对岩藻黄素提取效果的影响。考察当褐藻粉末的用量为1g时，采用不同用量的乙醇对岩藻黄素的提取效果。结果如图5所示。
随着料液比的增加而增加，而且提取率在20～30ml的阶段有一个快速上升，在30ml后提取率开始减缓。过溶剂的增加使得褐藻粉能够更加有效地和溶剂接触溶解，使得岩藻黄素的扩散空间变大，从而提高岩藻黄素的提取效果，但超过一定限度以后这种有利条件的作用效果就会减弱，从而在30ml以后提取率的增加速度变缓。在35ml～40ml之间，增加效果已经很微弱，考虑到效益和效率问题，料液比的最优条件为35ml。
试验例5
考察不同的微波萃取温度对岩藻黄素提取效果的影响。采取同样的萃取条件进行微波协同复合酶萃取，考察在不同的温度条件下进行微波萃取时对岩藻黄素的提取效果。结果如图6所示。
由图6可得，逐渐加大微波时间,岩藻黄素的提取效率有逐渐增加。这是由于随着温度的升高，岩藻黄素分子的运动速度变快，加快了岩藻黄素与有机溶剂的融合但是在45℃之后，提取效果又有所下降，这是由于岩藻黄素的分子结构很不稳定使得岩藻黄素对温度变化较为敏感，当温度超过一定范围时岩藻黄素可能会自己降解从而降低提取效率。取得较好的岩藻黄素提取效率的微波温度范围在40℃-50℃之间。
试验例6
考察不同的微波萃取时间对岩藻黄素提取效果的影响。在相同的微波考察不同的微波萃取时间对岩藻黄素的提取效果。结果如图7所示。
由图7可得，随着萃取时间的增加，岩藻黄素的提取率呈现先增加后降低的趋势。随着微波时间的增加，褐藻粉能够充分和提取剂融合，反应时间增加使得该反应更加完全，从而提高了提取效果。岩藻黄素的化学性质活泼，在光照、高温条件下很容易就被破坏。在微波反应时间加长的过程中，岩藻黄素可能会发生降解，另外提取的有机溶剂乙醇具有挥发性，影响萃取效果。微波萃取时间为4min时，提取效果最佳。
试验例7
分别测定实施例1、对比例1和对比例2的岩藻黄素的提取率，结果表明，实施例1、对比例1和对比例2的提取率分别为63％、43％和41％。由此可见，微波协同复合酶提取能够达到良好的提取效果。
试验例8
考察酶的使用对岩藻黄素提取效果的影响。试验条件和试验结果如表1所示：
表1
由表1可得，采用果胶酶和纤维素酶同时进行处理，能够有效提高盐藻黄质的提取率。
综上，本发明实施例提供的从褐藻中提取岩藻黄素的方法，利用微波萃取协同酶解，有效提高提取效率，提取过程中能够最大程度避免岩藻黄素受到破坏。同时，多次微波，也达到最终灭酶的效果，使得酶在破壁完成有效物质的溶出后，失去活性。因此，微波的次数、时间、酶的使用量等参数，成为有效提高破壁效果及灭酶的关键。通过各项参数的控制，最终达到最优的提取效果。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
预处理步骤：将褐藻冷冻干燥后粉碎，得到褐藻粉末；
萃取步骤：将所述褐藻粉末和复合酶混合后，加入乙醇后得到原料液，所述原料液进行微波萃取3～7min得到萃取液，其中，所述复合酶为质量比为1:0.5～4的果胶酶和纤维素酶；
分离步骤：将所述萃取液进行固液分离。
2.根据权利要求1所述的从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其特征在于，萃取步骤中，控制微波萃取的温度为40～50℃。
3.根据权利要求1所述的从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其特征在于，预处理步骤中，控制所述褐藻粉末的粒径为0.09～0.25mm。
4.根据权利要求1所述的从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其特征在于，所述复合酶和所述褐藻粉末的质量比为1～3:20。
5.根据权利要求1所述的从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其特征在于，所述褐藻粉末和所述乙醇的料液比为1:20～50g/mL。
6.根据权利要求1所述的从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其特征在于，分离步骤中，固液分离后得到固相和液相，所述液相经过膜过滤除去杂质。
7.根据权利要求1所述的从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其特征在于，所述原料液在进行微波萃取前，调节原料液的pH值为4～7。
8.根据权利要求1所述的从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其特征在于，所述原料液在微波萃取过程中，采用间歇萃取方式，萃取2～5次。
9.根据权利要求1所述的从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其特征在于，所述原料液在进行微波萃取前，在40～60℃条件下水浴5～15min。
10.根据权利要求1所述的从褐藻中提取岩藻黄素的方法，其特征在于，所述褐藻选自海带、裙带菜、铁钉菜、鹿角菜、羊栖菜中的一种或多种。
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