CN103224968B - 一种酶法制备新橙皮苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法制备新橙皮苷方法，包括如下步骤，橙皮苷与金属离子配位后溶于水，在固定化鼠李糖苷酶和固定化鼠李糖苷转移酶的作用下，实现从橙皮苷到新橙皮苷的转化。该方法解决了在医药、功能性食品及其化妆品领域广泛使用的新橙皮苷生产成本高的问题，同时为工业废弃的橙皮再利用和橙皮苷的高附加值利用开辟了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶法制备新橙皮苷的方法。
背景技术
新橙皮苷属于二氢黄酮类化合物，通常在酸橙、枳壳、枳实、未成熟的柚子中分布，以枳壳中含量较高。药理研究表明，新橙皮苷具有抗菌消炎、抗过敏、抗肿瘤及其抑制黑色素沉积等作用，因此在医药、功能性食品及其化妆品上有着广泛的应用。新橙皮苷还是合成新型甜味剂新橙皮苷二氢查尔酮的重要原料。新橙皮苷二氢查尔酮是一种重要的甜味剂，具有强烈的甜味，它的甜度是蔗糖的1800 倍，口感清爽，余味持久。新橙皮苷二氢查尔酮在欧盟、美国都已经被批准作为饲料添加剂、食品添加剂及其化妆品原料；1997年被我国卫生部列入食品添加剂使用卫生标准增补品种, 可用于食品工业。同时其具有极佳的屏蔽苦味的功效，是一种很好的药物矫味剂。
新橙皮苷的制备方法主要包括: 植物萃取法、柚皮苷化学合成法、橙皮苷酶催化法。橙皮苷酶催化法使用的起始原料橙皮苷来源丰富，便宜易得，且酶催化法反应条件温和，合成中也不需要使用大量的有毒有机原料，从而避免产品中因含有少量的有毒残留物而危害人类健康。因此橙皮苷生物转化法被认为是提供作为医药、功能性食品及其化妆品活性成分的新橙皮苷的一种理想的合成方法。Frydman A.等提供了一种橙皮苷生物转化合成新橙皮苷的方法，包括橙皮苷的化学水解和水解产物通过生物转化生成新橙皮苷两个关键步骤（J. Agric. Food Chem., 2005, 53 ( 25 ) :9708- 9712）。作者考虑到橙皮苷的水溶性极差，橙皮苷的水解采用二甲亚砜做溶剂，稀硫酸做催化剂，在高温密闭体系下进行，水解产物为混合物，包括橙皮苷-7-葡萄糖苷、橙皮素、鼠李糖、葡萄糖和芸香糖等。橙皮素在7- O-葡萄糖基转移酶和鼠李糖基转移酶二步反应的作用下, 生成新橙皮苷; 而橙皮素-7-O-葡萄糖苷仅在鼠李糖基转移酶的作用下直接生成新橙皮苷。该法的缺陷是第一步反应中，化学法高温水解的产物复杂，导致使用的酶体系复杂，而且由于水解过程使用了二甲亚砜，会大大降低酶活，高温水解还会使水解下来的糖被破坏，从而需要补加外源性的葡萄糖和鼠李糖。这些不利因素，使得该方法操作复杂，成本高昂，没有工业化价值。朱思名等在专利中描述了以橙皮苷酶来水解橙皮苷，而后水解物在鼠李糖苷转移酶作用下生成新橙皮苷（申请号：200910193529.9）。作者利用橙皮苷与金属离子形成配合物，大大加大了其水溶性，使得橙皮苷的酶法水解达到能满足工业化生产的水平。该方法的缺陷是，水解产物复杂，主要包括橙皮素-7-葡萄糖苷、橙皮素的混合物，而该混合物在鼠李糖苷转移酶作用下能够转化为新橙皮苷的只有水解体系中的橙皮素-7-葡萄糖苷，转化率太低，产物分离纯化难度增加，导致成本较高。同时鼠李糖苷酶和鼠李糖转移酶成本高，也大大限制了其在工业生产中的应用。因此，寻找一种更高效的以橙皮苷为原料酶法合成新橙皮苷的方法是市场迫切需要的。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种操作简单、环境友好、经济可行的以橙皮苷为原料酶法合成新橙皮苷的方法。
本发明将鼠李糖苷酶和鼠李糖转移酶用固定化酶载体Sepabeads EC-EP或者Sepabeads EC-HA进行固定，经固定化后表观酶活只有液体酶的四分之一到三分之一，但令人惊奇的是，其可以重复使用多达近200次，从而大大降低了酶的成本，远超本领域技术人员的预期。在橙皮苷水解时，通过使用固定化鼠李糖苷酶代替橙皮苷酶，使得反应产物只有L-鼠李糖和橙皮素-7-葡萄糖苷，而没有橙皮素。然后第一步反应产物L-鼠李糖和橙皮素-7-葡萄糖苷，在固定化鼠李糖苷转移酶的作用下，制备得到新橙皮苷。
本发明提供如下技术方案：
提供一种新橙皮苷的双酶法制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
橙皮苷在金属离子作用下溶于水，在固定化鼠李糖苷酶作用下水解，得到橙皮素-7-葡萄糖苷和鼠李糖的混合物。该混合物在固定化鼠李糖苷转移酶的催化下，得到新橙皮苷。
前述的固定化鼠李糖苷酶和固定化鼠李糖转移酶过程是，通过液酶固体纯酶；是在一定离子强度的磷酸钾缓冲体系中进行固定化，得到固定化酶。
所述的橙皮素-7-葡萄糖苷和鼠李糖的混合物经过常见的方法纯化，包括但不限于重结晶，或使用大孔树脂，可以分别得到橙皮素-7-葡萄糖苷和鼠李糖的纯品。
4、本发明还可以分批补料的方式可以实现多次使用。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
（1）采用鼠李糖苷酶代替化学方法和柚苷酶/橙皮苷酶来水解橙皮苷，使得橙皮苷的水解专一性进行，得到橙皮素-7-葡萄糖苷和L-鼠李糖，而不会使橙皮素-7-葡萄糖苷继续水解得到大量的橙皮素和葡萄糖，从而大大提高的产率，降低体系的复杂程度；
（2）得到由于体系的复杂程度大幅降低，可以用简单的方法分离得到橙皮素-7-葡萄糖苷和鼠李糖的纯品，而现有技术由于反应产物混合物体系复杂，难以得到产率和纯度与本发明相当的橙皮素-7-葡萄糖苷和鼠李糖；
（3）固定化鼠李糖苷酶水解橙皮苷的体系经过简单的过滤，即可分离出固定化鼠李糖苷酶，不需要进一步分离；随后，反应体系中直接加入固定化鼠李糖转移酶，在其催化下，生产新橙皮苷，从而大大节约了分离纯化成本；
（4）固定化鼠李糖苷酶和固定化鼠李糖转移酶的制备简单，酶活力和机械强度高，可重复使用超过100次，甚至多达近200次，从而大大降低了酶的成本；
（5）原料来源广、成本低、反应条件温和、无环境污染问题，特别适宜橙皮素-7-葡萄糖苷和新橙皮苷的生产。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明进行进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施例。
实施例1
取0.25 g Sepabeads EC-EP型载体（80-120目），水泡24小时后滤出，备用。加入到1.25 ml鼠李糖苷酶液中，加入1.4 M的pH为8的磷酸二氢钾缓冲溶液1 ml，加入上述处理好的载体，26±1 ℃恒温振荡72小时。过滤固定化酶后的载体，用蒸馏水洗涤至洗出液无蛋白后用pH为8的0.02 M磷酸缓冲液洗涤三次，酶活为150 U/g。
实施例2
取0.25 g水泡24小时后滤出的80-120目的Sepabeads EC-HA型载体，加入1.25 ml 4%的戊二醛溶液，震荡30 min，滤出载体加入到1.25 ml鼠李糖苷转移酶液，加入0.02 M的pH为8的磷酸二氢钾缓冲溶液1 ml，反应体系26±1 ℃恒温振荡12小时。过滤，用蒸馏水洗涤至洗出液无蛋白后用pH为8的0.02 M磷酸缓冲液洗涤三次，酶活为250 U/g。
实施例3
在反应釜1中，用80%甲醇配制5×10-3 M 橙皮苷和3×10-3 M CuCl2溶液，在40 ℃水浴中加热反应1 h，减压蒸出甲醇，得橙皮苷铜配合物水溶液，浓度达到1.5 g/L。加入实施例1中制备的固定化鼠李糖苷酶，45 ℃，pH 4.0，反应 1 h，原料完全转化为橙皮素-7-葡萄糖苷铜配合物和鼠李糖。通过反应釜1下部的400目筛分离，固定化酶留在反应釜1中；反应溶液进入反应釜2中，加入实施例2中制备的固定化鼠李糖转移酶，35 ℃反应2h，橙皮素-7-葡萄糖苷和鼠李糖完全转化为新橙皮苷铜配合物。通过反应釜下部的400目筛网分离，固定化鼠李糖转移酶留在反应釜2中，溶液进入反应釜3，加入氨水，并用氢氧化钠调节至pH13，直到体系不在用浑浊出现。过滤，滤液冷冻下，用盐酸调节pH至6.5左右，有大量固体析出，静止过夜后过滤收集固体，水，乙醇分别洗涤三次，不高于80℃干燥得到新橙皮苷，收率98%。
实施例4
在反应釜1中，用80%甲醇配制5×10-3 M 橙皮苷和3×10-3 M CuCl2溶液，在40 ℃水浴中加热反应1 h，减压蒸出甲醇，得橙皮苷铜配合物水溶液，浓度达到1.5 g/L。加入实施例1中制备的固定化鼠李糖苷酶，45 ℃，pH 4.0，反应 1 h，原料完全转化为橙皮素-7-葡萄糖苷铜配合物和鼠李糖。通过反应釜1下部的400目筛分离，固定化酶留在反应釜1中；反应溶液进入反应釜2中。反应釜2中的溶液用大孔树脂吸附后装柱，用纯水洗脱2小时后改为50%乙醇洗脱，分别收集后冷冻干燥，得到纯的鼠李糖和橙皮素-7-葡萄糖苷，产率为95%和96%。
实施例5
同实施例3，仅是固定化鼠李糖苷酶和固定化鼠李糖转移酶为实施例3中已使用过的，固定化酶重复使用1次，反应制得新橙皮苷收率98%。
实施例6
同实施例3，仅是固定化鼠李糖苷酶和固定化鼠李糖转移酶为已重复使用过10次，反应制得新橙皮苷收率98%。
实施例7
同实施例3，仅是固定化鼠李糖苷酶和固定化鼠李糖转移酶为已重复使用过50次，反应制得新橙皮苷收率95%。
实施例8
同实施例5。通过类似的补加新酶的方法，可以使固定化鼠李糖酶和固定化鼠李糖转移酶使用达到近200次。
Claims (1)
1.一种酶法制备新橙皮苷的方法，其特征在于：橙皮苷在金属离子作用下溶于水，在固定化鼠李糖苷酶作用下水解，得到橙皮素-7-葡萄糖苷和鼠李糖的混合物，该混合物在固定化鼠李糖转移酶的催化下，得到新橙皮苷，具体步骤为：
在反应釜1中，用80%甲醇配制5×10-3 M 橙皮苷和3×10-3 M CuCl2溶液，在40 ℃水浴中加热反应1 h，减压蒸出甲醇，得橙皮苷铜配合物水溶液，浓度达到1.5 g/L；加入制备的固定化鼠李糖苷酶，45 ℃，pH 4.0，反应 1 h，原料完全转化为橙皮素-7-葡萄糖苷铜配合物和鼠李糖；通过反应釜1下部的400目筛分离，固定化酶留在反应釜1中；反应溶液进入反应釜2中，加入制备的固定化鼠李糖转移酶，35 ℃反应2h，橙皮素-7-葡萄糖苷和鼠李糖完全转化为新橙皮苷铜配合物；通过反应釜下部的400目筛网分离，固定化鼠李糖转移酶留在反应釜2中，溶液进入反应釜3，加入氨水，并用氢氧化钠调节至pH13，直到体系不在用浑浊出现；过滤，滤液冷冻下，用盐酸调节pH至6.5左右，有大量固体析出，静止过夜后过滤收集固体，水，乙醇分别洗涤三次，不高于80℃干燥得到新橙皮苷；
所述固定化鼠李糖苷酶的固定化步骤为：取0.25 g 80-120目的Sepabeads EC-EP型载体，水泡24小时后滤出，备用；加入到1.25 ml鼠李糖苷酶液中，加入1.4 M的pH为8的磷酸二氢钾缓冲溶液1 ml，加入上述处理好的载体，26±1 ℃恒温振荡72小时；过滤固定化酶后的载体，用蒸馏水洗涤至洗出液无蛋白后用pH为8的0.02 M磷酸缓冲液洗涤三次；
所述固定化鼠李糖转移酶的固定化步骤为：取0.25 g水泡24小时后滤出的80-120目的Sepabeads EC-HA型载体，加入1.25 ml 4%的戊二醛溶液，震荡30 min，滤出载体加入到1.25 ml鼠李糖苷转移酶液，加入0.02 M的pH为8的磷酸二氢钾缓冲溶液1 ml，反应体系26±1 ℃恒温振荡12小时；过滤，用蒸馏水洗涤至洗出液无蛋白后用pH为8的0.02 M磷酸缓冲液洗涤三次。
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