KR100771081B1

KR100771081B1 - 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 제조 방법

Info

Publication number: KR100771081B1
Application number: KR1020060048039A
Authority: KR
Inventors: 윤병대; 김민수; 박찬선
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-05-29
Filing date: 2006-05-29
Publication date: 2007-10-29

Abstract

본 발명은 감귤류로부터 고감도 감미료인 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 1) 감귤, 탱자, 오렌지, 레몬 등의 감귤류로부터 헤스페리딘(hesperidin)을 추출하는 단계(Extraction step), 2) 헤스페리딘을 산(acid)이나 효소 처리함으로써 당을 가수분해하여 무배당체(aglycone)형태의 헤스페레틴(hesperetin)이나 헤스페레틴-7-O-글루코시드를 제조하는 단계(sugar hydrolysis step), 3) 헤스페레틴이나 헤스페레틴-7-O-글루코시드를 효소 및 미생물을 이용하여 네오헤스페리딘(neohesperidin)으로 생전환하는 단계(biotransformation step), 4) 네오헤스페리딘을 알칼리 수소처리하여 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘으로 전환하는 단계(alkali hydrogenation step)로 구성된 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘의 제조 방법에 관한 것이다.

네오헤스페리딘 디하이드로칼콘, 감귤류, 생전환, 고감도감미료, 비만

Description

네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 제조 방법{Method of preparation of neohesperidin dihydrochalcone from Citrus}

도 1은 감귤류로부터 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘의 생산 공정을 나타낸 도면이고,

도 2는 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘의 분자구조식이고,

도 3은 감귤박으로부터 유기성 용매를 이용하여 헤스페리딘을 추출한 도면이고,

도 4는 산도(pH)에 따른 헤스페리딘→헤스페레틴 전환율을 나타낸 도면이고,

도 5는 당 가수분해효소 종류에 따른 헤스페리딘→헤스페레틴 전환율을 나타낸 도면이고,

도 6은 네오헤스페리딘으로부터 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘으로 전환율을 나타내는 도면이다.

본 발명은 감귤류로부터 고감도 감미료인 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘(neohesperidin dihydrochalcone)을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 좀더 상세히는 1) 감귤, 탱자, 오렌지, 레몬 등의 감귤류로부터 헤스페리딘(hesperidin)을 추출하는 단계(Extraction step), 2) 헤스페리딘을 산(acid)이나 효소 처리함으로써 당을 가수분해하여 무배당체(aglycone) 형태의 헤스페레틴(hesperetin)이나 헤스페레틴-7-O-글루코시드를 제조하는 단계(sugar hydrolysis step), 3) 헤스페레틴이나 헤스페레틴-7-O-글루코시드를 효소 및 미생물을 이용하여 네오헤스페리딘(neohesperidin)으로 생전환하는 단계(biotransformation step), 4) 네오헤스페리딘을 알칼리 수소처리하여 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘으로 전환하는 단계(alkali hydrogenation step)로 구성된 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘의 제조 방법에 관한 것이다.

인류 문명의 발달과 더불어 인간의 단맛에 대한 욕구로 인한 물엿, 시럽의 제조기술 및 설탕의 공업적 생산 등 감미료의 생산 기술도 더불어 발전하여 왔다. 인류가 개발한 감미료 중에서 설탕은 자연에서 얻을 수 있는 가장 훌륭한 천연 감미료로서 오랫동안 식품 산업에 이용되어 왔다. 그러나 최근에 이르러 소득 수준의 향상과 더불어 건강에 대한 관심이 증가함에 따라 설탕의 과다 섭취에 따른 치아우식증, 비만증, 당뇨병 및 심장 질환 등과 같은 성인병에 시달리는 환자들이 급증함으로써 설탕을 대체할 수 있는 기능성 감미료의 개발이 요구되고 있다. 따라서 세계 각국에서는 설탕을 대체할 수 있는 감미료를 개발하기 위하여 연구를 수행하여 왔으나 아직도 설탕을 대체할 수 있는 혁신적인 감미료의 개발은 요원한 실정이다. 더욱이 설탕을 전량 수입해야 하는 우리나라의 실정에서는 설탕을 대체할 수 있는 기능성 감미료의 개발은 의학적 가치뿐만 아니라 경제적 가치도 매우 크다고 할 수 있다. 따라서 설탕을 대체할 고감도 감미료는 높은 경제적 부가 가치를 지녔다는 점에서 세계적으로 각광받는 연구과제가 되었으며, 국내에서도 설탕 대체용 감미료 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

고감도 감미료 중에서 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 설탕에 비하여 1,500~1,800배 이상의 감미도를 나타내며, 감미 효과가 오랫동안 지속되는 특징이 있으며, 밀폐된 용기에서 보관할 경우 보관온도에 상관없이 성상, 맛, 화학적 특성이 변함없이 5년 동안 안정한 것으로 확인됨으로써 저장성이 우수하고, pH 2~6의 산성 환경이나, 식품에서 일반적으로 행하는 멸균이나 열처리에 특별한 효능의 저하 없이 안정성이 유지되는 등 식품첨가제로서 우수한 특징을 갖추고 있다.

또한, 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 유럽연합(EU)의 Sweetener Directive에 등재되었고(승인번호, E959), Generally Recognized As Safe(GRAS)의 성분으로 허용됨으로써 식품첨가제로서의 안정성이 입증되었다(GRAS Number 3811).

상기와 같이 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘은 용도, 안정성, 감미료로서의 안전성 등이 확인되었지만, 효율적인 생산 공정에 대해서는 아직까지 충분한 연구가 이루어지지 못한 실정이다.

감귤 생산 농가의 증가와 농업기술의 발전으로 인해 감귤의 생산량이 증가하 고, 그에 따라 산업적 감귤 주스, 향수 등 공산품 생산이 증가했고 그에 따라 부산물 또는 폐기물로 생성되는 감귤 과피와 찌꺼기 등이 발생되고 있다. 감귤의 가공에서 주폐기물인 감귤 껍질은 국내 최대의 관광지인 제주도의 환경오염의 중요한 원인 중의 하나로 지적되고 있어 폐기물처리에 소요되는 고비용이 이미 감귤가공업체의 생산단가를 가중시킬 정도로 심각한 어려움을 주고 있다. 다만 감귤 과피는 한약으로 진피라 하여 사용되며, 중국으로부터 수입되고 있다. 제주지역에서는 노지 건조방법으로 처리하여 진피로 사용되고 있으나, 그 양은 적은 편이다. 그러므로 감귤가공의 수익성을 확보하기 위해, 저비용의 폐기물 처리기술 또는 폐기물 활용기술의 개발이 절실히 필요하다.

감귤 가공폐기물인 감귤 과피에는 60종 이상의 플라보노이드가 건조중량 대비 1∼3%로 다량 함유되어 있으며, 이들은 여러 생리효과가 뛰어난 우수 천연소재로 밝혀져 있다. 이와 같이 감귤 내 플라보노이드 성분에 대해서는 혈중 콜레스테롤 저하, 혈당 저하, 혈압 강하, 면역 활성 촉진, 중금속 흡수 등의 생리효과를 나타낸다고 알려져 있어 고혈압, 동맥경화증, 협심증, 당뇨병, 면역력 감소 등 각종 성인병 질환의 예방과 치료를 위한 기능성 식품 또는 의약품 등으로 연구 개발이 되어왔다. 그러나 감귤류를 이용하여 새로운 고감도 감미료인 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘의 제조에 관한 연구는 활발하지 않았다.

본 발명자들은 감귤폐기물인 감귤 과피를 이용하여 고감도 감미료인 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 간단한 공정으로 경제적으로 제조하려는 것을 목적으로 한다.

본 발명은

1) 감귤, 탱자, 오렌지, 레몬, 한라봉, 자몽 등의 감귤류로부터 헤스페리딘(hesperidin)을 추출하는 단계(Extraction step);

2) 헤스페리딘을 산(acid)이나 효소로 처리함으로써 당을 가수분해하여 무배당체(aglycone)형태의 헤스페레틴(hesperetin)이나 헤스페레틴-7-O-글루코시드(hesperetin-7-O-glucoside)를 제조하는 단계(sugar hydrolysis step);

3) 헤스페레틴이나 헤스페레틴-7-O-글루코시드를 효소 및 미생물을 이용하여 네오헤스페리딘(neohesperidin)으로 생전환하는 단계(Biotransformation step);

4) 네오헤스페리딘을 알칼리 조건하에서 수소처리하여 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘으로 전환하는 단계(alkali hydrogenation step)로 구성된 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 제공하기 위하여 감귤, 탱자, 레몬, 오렌지, 한라봉, 자몽 등의 감귤류를 원료로 사용하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 감귤류로부터 고감도 감미료인 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 제조하기 위하여 감귤, 탱자, 오렌지, 레몬, 한라봉 등의 감귤류로부터 헤스페리딘을 추출하는 단계(Extraction step)에서, 헤스페리딘의 함량이 높은 감귤류를 사용하는 것이 바람직하며, 감귤과피를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 감귤과피로부터 헤스페리딘을 효과적으로 추출하기 위해서는 유기성 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 식품에 사용가능한 에탄올과 같은 유기성 용매를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 추출용 유기성 용매는 사용하는 감귤박 시료 부피의 0.5~10배 이상 사용하는 것이 바람직하며, 1~2배를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 반응조의 온도는 10~121℃가 바람직하나, 30~40℃가 더욱 바람직하다.

헤스페리딘을 산 용액이나 효소 처리함으로써 당을 가수분해하여 무배당체 형태의 헤스페레틴이나 헤스페레틴-7-O-글루코시드를 제조하는 단계에서, 무배당체형태의 헤스페레틴이나 헤스페레틴-7-O-글루코시드를 제조하기 위한 산(acid)은 염산, 초산, 황산 등의 산을 사용하는 것이 바람직하며, 식품용 초산이 더욱 바람직하다.

또한, 산성 용액의 pH는 7 이하가 바람직하며, pH 3~4가 더욱 바람직하다.

또한, 무배당체 형태의 헤스페레틴이나 헤스페레틴-7-O-글루코시드를 제조하기 위한 효소 처리에 사용되는 효소의 종류는 당 가수분해용 효소가 바람직하며, 아밀라아제(amylase), 펙티나아제(pectinase), 셀룰라제(cellulase) 등이 바람직하다.

또한, 헤스페레틴이나 헤스페레틴-7-O-글루코시드를 제조하기에 바람직한 당 가수분해용 효소의 사용량은 각 효소가 나타내는 활성이 차이가 있으나 반응 용액당 100~1000U가 바람직하다. 이 때, U는 반응용액 내 1㎍의 헤스페레틴이나 헤스페레틴-7-O-글루코시드를 1분 동안 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의한다.

또한, 반응조의 반응 pH는 사용되는 효소의 종류에 따라 최적 활성을 나타내는 pH에 차이가 있으나 반응 pH는 3~9가 바람직하다.

또한, 반응조의 반응 온도는 사용되는 효소의 종류에 따라 최적 활성을 나타내는 온도에 차이가 있으나 반응 온도는 20~40℃가 적합하다.

헤스페레틴이나 헤스페레틴-7-O-글루코시드를 효소 및 미생물을 이용하여 네오헤스페리딘으로 생전환(biotransformation)하는 단계에서, 생전환하기 위한 효소로는 글루코실트랜스퍼라제(glucosyltransferase)나 람노실트랜스퍼라제(rhamnosyltransferase)가 바람직하며, 플라바논-7-O-글루코실트랜스퍼라제 (flavanone-7-O-glucosyltransferase)와 플라바논-7-O-람노실트랜스퍼라제(flavanone-7-O-rhamnosyltransferase)가 더욱 바람직하다. 또한 상기한 바와 같은 글루코실트랜스퍼라제와 같은 효소활성을 나타내는 미생물로서 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 리조비움 멜리오티(Rhizobium meliloti)나 람노실트랜스퍼라제의 활성을 나타내는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)를 이용할 수 있다.

또한, 상기한 바와 같이 효소의 사용량은 각 효소가 나타내는 활성이 차이가 있으나 반응 용액당 10-1000U가 바람직하다. 이 때, U는 반응용액 내 1㎍의 네오헤스페리딘을 1분 동안 생성하는데 필요한 효소의 양으로 정의한다.

또한, 상기한 바와 같이 반응조의 반응 pH는 사용되는 효소의 종류에 따라 최적 활성을 나타내는 pH에 차이가 있으나 반응 pH는 2~9가 바람직하다.

또한, 상기한 바와 같이 반응조의 반응 온도는 사용되는 효소의 종류에 따라 최적 활성을 나타내는 온도에 차이가 있으나 반응 온도는 20~40℃가 적합하다.

네오헤스페리딘을 알칼리 용액에서 수소처리하여 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘으로 전환하는 단계(alkali hydrogenation step)에서, 네오헤스페리딘을 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘으로 전환하기 위해서는 알칼리 용액을 포함한 반응조에 수소를 주입하고 여기에 촉매를 첨가하여 네오헤스페리딘의 수소화반응을 수행하여 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘으로 전환하는 것을 특징으로 한다.

이때 사용되는 알칼리 용액은 pH 7 이상이 바람직하며, pH 9~10의 알칼리 용액이 더욱 바람직하다.

또한, 이 단계에서 사용되는 촉매는 알칼리 용액에서 안정한 촉매가 바람직하며, 래니 니켈(Raney Nickel) 촉매가 더욱 바람직하다.

또한 반응조의 반응온도는 10~40℃가 바람직하며, 25~35℃가 더욱 바람직하다.

상기 단계 1)과 단계 2)는 필요에 따라 순서를 달리하여 헤스페레틴이나 헤스페레틴-7-O-글루코시드를 제조할 수 있다.

또한, 필요에 따라 단계 1)을 생략하고 감귤류로부터 헤스페레틴이나 헤스페레틴-7-O-글루코시드를 추출한 후, 단계 2), 3), 4) 과정을 수행하여 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 제조할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 플라보노이드 함량의 분석

각 플라보노이드의 함량의 분석은 시료를 필요에 따라 적절하게 희석하여 디메틸설폭사이드(dimethyl sulphoxide, DMSO)나 에탄올 등 유기용매로 추출하여, 기공 0.2㎛의 막 여과를 수행하여 고형물을 제거한 후, 고압액체크로마토그래피(High pressure liquid chromatography, HPLC)로 분석하였다.

실시예 2. 감귤과피로부터 헤스페리딘의 추출

헤스페리딘을 추출하기 위한 시료는 미성숙한 감귤을 수집한 후 과실을 제거한 감귤과피를 사용하였다. 시료는 분쇄기를 이용하여 분쇄하여 액상으로 제조하였 고, 시료 400g에 에탄올 400ml을 첨가하여 에탄올 내로 헤스페리딘이 용출되도록 하여 추출하였다. 추출을 위한 반응조의 온도는 상온이었으며, 와류(vortex)는 수행하지 않고 자연적으로 추출하였다. 이와 같은 과정을 3회 반복하여 추출하였다. 3회 추출한 결과(도 3) 감귤박에 포함되어 있는 헤스페리딘의 함량은 추출횟수가 늘어남에 따라 급격히 감소하였고, 3회 추출에서는 헤스페리딘은 없었다.

3회 추출한 후, 건조 감귤박 1g당 헤스페리딘의 함량은 0.154mg으로 확인되었다.

실시예 3. 산성 조건하에서 헤스페리딘으로부터 헤스페레틴으로의 전환

상기 실시예 2에서 획득한 헤스페리딘 함유 감귤과피 추출물 200ml(헤스페리딘 함량 0.2mg/ml)을 pH 2~6 사이로 조절하여 12시간 동안 반응시켰다. 반응 후 pH 조건에 따른 헤스페리딘에서 헤스페레틴으로 전환되는 정도를 조사하였다(도 4). 도 4에서 보는 바와 같이 pH 3~4 범위에서 전환율 88~94%로 가장 우수한 것으로 나타났다.

실시예 4. 당 가수분해효소를 이용한 헤스페리딘으로부터 헤스페레틴으로의 전환

상기 실시예 2에서 획득한 헤스페리딘 함유 감귤과피 추출물 200ml(헤스페리딘 함량 0.2mg/ml)에 당 가수분해효소인 바실러스 속 유래 아밀라아제, 아스퍼질러스 속 유래 펙티나아제, 페니실리움 속 유래 셀룰라제, 아스퍼질러스속 유래 글루 코시다제를 각각 첨가하여 12시간 동안 반응시켰다. 반응 후 당 가수분해효소 종류에 따른 헤스페리딘에서 헤스페레틴으로 전환 정도를 조사하였다(도 5). 도 5에서 보는 바와 같이 글루코시다제가 전환율 84%로 가장 우수한 것으로 나타났으며, 그 외에도 아밀라아제, 펙티나아제, 셀룰라제도 50~70%의 전환율을 나타내었다.

또한, 이와 같은 결과를 근거로 당 분해효소를 생산하는 미생물로서 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp), 바실러스 속(Bacillus sp.) 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.), 페니실리움 속(penicillium sp.) 등과 같은 미생물을 이용하여 상기와 같은 효과를 낼 수 있었다.

실시예 5. 헤스페레틴 및/또는 헤스페레틴 -7-O-글루코시드의 생전환

상기 실시예 4에서 얻어진 결과물인 액상 시료(헤스페레틴 및 헤스페레틴-7-O-글루코시드가 주요 생성물인 혼합물 상태임, 헤스페레틴 함량 0.1mg/ml, 헤스페레틴:헤스페레틴-7-O-글루코시드 중량비≒5:1)에 플라바논-7-O-글루코실트랜스퍼라제(flavanone-7-O-glucosyltransferase)와 플라바논-7-O-람노실트랜스퍼라제(flavanone-7-O-rhamnosyltransferase)를 가하여 pH 6~8, 온도 25~30℃ 조건에서 와류 없이 12시간 반응시켜 네오헤스페리딘을 얻었다.

또한, 상기한 바와 같이 글루코실트랜스퍼라제와 같은 효소활성을 나타내는 미생물로서 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 람노실트랜스퍼라제의 활성을 나타내는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)를 동시에 상기 실시예 4의 결과물에 가하여 분리된 상기 효소에 비하여 수율은 약간 저하되나 동일한 결과를 얻을 수 있었다.

실시예 6. 네오헤스피리딘으로부터 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘으로 전환

10%(w/v)의 수산화나트륨 용액 100ml이 포함된 500ml의 반응조에 상기 실시예 5로부터 획득한 액상 시료를 농축시킨 농축 액상 시료 200ml(약 10g의 네오헤스피리딘 포함)과 0.01g의 래니니켈(raney nickel) 촉매를 첨가하고, 효율적인 반응을 위하여 반응조 내 와류(vortex)를 형성시켜 반응을 수행하였다. 이때 첨가되는 수소의 압력은 10psi가 되도록 주입시켜 시간별로 시료를 수집하여 시간에 따른 전환율을 나타내었다(도 6). 도 6에서 보는 바와 같이 반응 72시간 후에 완전히 반응이 끝났으며, 96% 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘이 생성됨을 확인하였다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명은 감귤류로부터 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 생산 방법을 제공하는 효과가 있는 유용한 발명인 것이다.

상기에서 본 발명은 기재된 구체적인 실시예를 중심으로 상세히 설명되었지만, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

Claims

헤스페레틴, 헤스페레틴-7-O-글루코시드 중 1 이상을 람노실트랜스퍼라아제, 글루코실트랜스퍼라제 중 1종 이상의 효소 또는 상기 효소를 생산하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 리조비움 멜리오티(Rhizobium meliloti) 및 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로 이루어진 그룹 중 선택된 1종 이상의 미생물을 이용하여 네오헤스페리딘(neohesperidin)으로 생전환하는 단계(Biotransformation step);

네오헤스페리딘을 pH 9~10의 알칼리 조건에서 알칼리 수소 처리하여 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘으로 전환하는 단계(alkali hydrogenation step);를 포함한 네오헤스피리딘 디하이드로칼콘을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 생전환 단계 이전에 감귤류로부터 추출된 헤스페리딘(hesperidin)을 염산, 황산 및 초산으로 이루어진 그룹 중 선택된 1종 이상의 산(acid), 셀룰라제, 펙티나제, 아밀라아제로 이루어진 그룹 중 선택된 1종 이상의 효소 또는 셀룰라제, 펙티나제, 아밀라아제 중 1종 이상의 효소를 생산하는 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp), 바실러스 속(Bacillus sp.) 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 및 페니실리움 속(penicillium sp.)으로 이루어진 그룹 중 선택된 1종 이상의 미생물 처리로 당을 가수분해하여 헤스페레틴(hesperetin) 또는 헤스페레틴-7-O-글루코시드를 제조하는 단계(sugar hydrolysis step)를 수행하는 것을 특징으로 하는 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 제조하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 알칼리 수소 처리 단계에는 래니 니켈 촉매를 가하여 주는 것을 특징으로 하는 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 제조하는 방법.
삭제
삭제
제2항에 있어서, 상기 감귤류는 감귤, 오렌지, 탱자, 레몬, 자몽 및 한라봉으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘을 제조하는 방법.
삭제