CN105693883A - 用于酶固定化的壳聚糖微球、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于酶固定化的壳聚糖微球、其制备方法及应用，上述制备方法包括：在0.5g壳聚糖粉末中加入质量分数为5%的乙酸溶液，待壳聚糖粉末充分溶解后，加入液体石蜡，搅拌10分钟后升温至50℃，滴加乳化剂Span80，乳化10分钟后加入0.5～2.0mL的甲醛溶液，搅拌反应1.5小时，升温至70℃，滴加质量分数为10%的NaOH溶液，在溶液pH值保持为碱性条件下，缓慢滴加1.0～2.5mL的环氧氯丙烷，反应5小时后过滤，用蒸馏水洗涤，再依次用石油醚、无水乙醇洗涤、水洗涤，用1mol/L的盐酸加热处理9小时，接着依次进行碱洗、酸洗和水洗，直至洗涤液的pH值达到中性，再干燥至恒重，得到用于酶固定化的壳聚糖微球（NCTS）。本发明公开的壳聚糖微球是固定化酶的良好载体。

Description

用于酶固定化的壳聚糖微球、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及壳聚糖微球制备及应用研究领域，尤其涉及一种用于酶固定化的壳聚糖微球、其制备方法及应用。

背景技术

纤维素是分布最广泛的、含量最丰富的、可再生的天然有机物质，可以源源不断地为人类提供能源。但在自然界中，绝大部分纤维素会被各类微生物分解转化，仅有约11％的纤维素原料用于农作物产品、饲料、制药、纺织、造纸和建筑等方面，不仅造成资源的巨大浪费，而且污染环境，危害是相当大的。

酶对环境条件要求极为敏感，对酸、碱、热、金属离子、部分有机溶剂等都不稳定。一般情况下酶是以溶于水的状态作用于底物的，存在反应结束后难以回收利用、生产成本较高、终产物分离提纯较难等问题。比如，生物质经纤维素酶处理转化为燃料乙醇的过程中，纤维素酶的价格就占到生产总成本的20％左右，限制了酶在生产中的广泛应用。因此，游离酶并非工业催化中一种理想的催化剂，还需要对酶进行修饰和处理，以改善其性能。

固定化酶(Immobilizedenzyme)是通过物理或化学的方法，将酶结合于水不溶性大分子载体上，或将酶包埋在其中，使得酶在一定空间内呈闭锁状态，酶分子的流动性降低，但酶可以充分发挥应有的催化作用，反应结束后酶可与底物、产物分开，并能重复使用。目前，酶固定化的方法按传统可分为4大类，即吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。

作为固定化酶的重要组成部分，载体材料的结构和性能直接影响固定化酶的活性，所以对载体材料的物理和化学性能有一定的要求，如多孔或疏松的结构、有较大的比表面积；适当的亲水性、抗化学或微生物侵蚀及良好的稳定性；此外还可通过物理或化学方法进行改性，使得表面连接必要的反应基团；工业应用时，载体材料应具有一定的机械强度，可以承受一定强度的搅拌和压缩，同时还应具有无毒、来源广泛、价格低廉等特点。因此，设计、开发和制备性能较为优越的载体材料已成为近年来固定化酶研究的重点之一。

甲壳素是一种仅次于纤维素的来源及其丰富的天然有机化合物，广泛存在于甲壳纲动物(虾、蟹等)的甲壳、昆虫的甲壳、真菌(酵母、霉菌)的细胞壁以及某些植物的细胞壁中。壳聚糖(Chitosan,简称CTS)是甲壳素的N-脱乙酰基产物，是一种二元线性共聚物，化学名称是β-2-氨基-2-脱氧-(1,4)-D葡聚糖，相对分子质量在几十万到上百万左右。壳聚糖不溶于水、碱、稀的硫酸和磷酸，但可溶于部分稀的无机酸(如盐酸)和大多数有机酸(如醋酸)。壳聚糖有多糖结构和氨基功能基团，具有诸多优点，如吸湿性、通透性、抗菌性、良好的生物相容性、无毒无害、对环境无污染等，可以作为固定化酶载体。因此，采用壳聚糖改善传统的固定化方法、开发新型的固定化技术和注重天然高分子载体材料的改性成为了酶固定化研究的主要趋势。

然而，对于壳聚糖作为载体固定化酶的应用，存在着必须离心操作，样品不得不稀释及载体回收损失大等问题。因此，寻求更好的固定化酶载体成为了人们研究的热点。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于酶固定化的壳聚糖微球、其制备方法及应用，能够提供一种固定化酶的良好载体，并能够制备具有良好的稳定性和重复利用性的固定化纤维素酶。

为了达到上述技术目的，本发明提供一种用于酶固定化的壳聚糖微球的制备方法，包括：

(1)在0.5g壳聚糖粉末中加入质量分数为5％的乙酸溶液，待壳聚糖粉末充分溶解后，加入液体石蜡，搅拌10分钟；

(2)将步骤(1)的所得物升温至50℃，滴加乳化剂Span80，乳化10分钟；

(3)在步骤(2)的所得物中加入0.5～2.0mL的甲醛溶液，搅拌反应1.5小时；

(4)将步骤(3)的所得物升温至70℃，滴加质量分数为10％的NaOH溶液，在溶液pH值保持为碱性条件下，缓慢滴加1.0～2.5mL的环氧氯丙烷，反应5小时；

(5)将步骤(4)的所得物过滤，用蒸馏水洗涤，再依次用石油醚、无水乙醇洗涤、水洗涤，直至洗涤液的pH值达到中性；

(6)将步骤(5)的所得物用1mol/L的盐酸加热处理9小时，接着依次进行碱洗、酸洗和水洗，直至洗涤液的pH值达到中性，再干燥至恒重，得到用于酶固定化的壳聚糖微球(NCTS)。

较佳地，步骤(3)中甲醛的用量为1.0mL。

较佳地，步骤(4)中环氧氯丙烷的用量为2.0mL。

较佳地，各步骤中搅拌反应的搅拌速率为250r/min。

本发明还提供一种用于酶固定化的壳聚糖微球，由上述方法制备。

本发明还提供一种纤维素酶固定化的方法，包括：

(1)将10mg权利要求5所述的壳聚糖微球用pH值为4.0～7.0的10mL的磷酸缓冲液溶胀24小时后分离；

(2)在步骤(1)的所得物中加入10mL的5％戊二醛溶液，于25℃下振荡活化5小时并过滤，用蒸馏水洗去多余的戊二醛；

(3)在步骤(2)的所得物中加入2.0～2.5mg酶液，于25～30℃下恒温振荡固定2～6小时后，过滤，滤渣用磷酸缓冲液进行反复冲洗后得固定化酶。

较佳地，步骤(3)中固定时间为4小时。

较佳地，步骤(1)中磷酸缓冲液的pH值为7.0。

较佳地，步骤(3)中固定温度为30℃。

本发明还提供一种由上述纤维素酶固定化方法得到的固定化酶。

本发明相对于现有技术，有以下优点：

(1)本发明提供的壳聚糖微球安全无毒，具有良好的机械性能，耐热性好，分子中存在大量氨基，易改性，是极具利用价值的固定化酶的良好载体；

(2)本发明提供的酶固定化方法延续了传统共价结合法固定化酶的优点，且酶活力回收率较高，具有较高的应用价值；

(3)本发明制备出的固定化纤维素酶具有良好的稳定性和重复利用性，由于壳聚糖微球载体呈微球状态，使得产物与酶易于分离回收。

附图说明

图1为纤维素酶标准曲线；

图2为吸光值与葡萄糖浓度的关系(标准曲线)；

图3为时间对纤维素酶固定化的影响；

图4为pH值对纤维素酶固定化的影响；

图5为给酶量对纤维素酶固定化的影响；

图6为温度对纤维素酶固定化的影响；

图7为pH对游离酶和固定化酶相对活力的影响；

图8为温度对游离酶和固定化酶相对活力的影响；

图9为50℃下游离酶和固定化酶的热稳定性；

图10为70℃下游离酶和固定化酶的热稳定性；

图11为固定化酶和游离酶的Lincwaver-Burk曲线；

图12为游离酶和固定化酶的贮藏稳定性；

图13为固定化纤维素酶的重复使用性能。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

(1)称取0.5g壳聚糖粉末于100mL三颈瓶中，加入30ml质量分数为5％的乙酸溶液，室温下搅拌，待壳聚糖充分溶解后，加入30ml液体石蜡，搅拌10分钟；

(2)将步骤(1)的所得物升温至50℃，滴加2-3滴乳化剂Span80，乳化10分钟，使其形成细小的壳聚糖液滴；

(3)在步骤(2)的所得物中加入1.0mL的甲醛溶液，搅拌反应1.5小时；

(4)将步骤(3)的所得物升温至70℃，滴加5-6滴质量分数为10％的NaOH溶液，使溶液的pH值保持为碱性，缓慢滴加2.0mL的环氧氯丙烷，反应5小时；

(5)将步骤(4)的所得物过滤，用蒸馏水洗涤，再依次用石油醚、无水乙醇洗涤、水洗涤，直至洗涤液的pH值达到中性；

(6)将步骤(5)的所得物用1mol/L的盐酸加热处理9小时，接着依次进行碱洗、酸洗和水洗，直至洗涤液的pH值达到中性，再置于50℃的真空干燥器中恒重后得到用于酶固定化的壳聚糖微球(NCTS)。

由实施例1制得的壳聚糖微球(NCTS)可进行如下实验以确定其溶胀性、溶解度及纤维素酶固载量。

壳聚糖微球的溶胀性检测方法如下：

准确称取W₀已干燥至恒重的壳聚糖微球于具塞锥形瓶中，分别加入50mL去离子水，室温下，以100r/min的转速振荡48小时后，过滤后用滤纸吸干微球表面的水分，称重W₁。上述实验重复三次，求其平均值。溶胀度(S)按下述公式计算：

$S=\frac{W_1-W_0}{W_0}\×100\%$

壳聚糖微球的溶解度检测方法如下：

准确称取W₀已干燥至恒重的壳聚糖微球于具塞锥形瓶中，分别加入50mL去离子水、1mol/L的NaOH溶液、pH值为3.0-5.5的醋酸-醋酸钠缓冲液、1mol/L和2mol/L的HCl溶液。室温下，以100r/min的转速振荡48小时后，用去离子水冲洗数次，过滤后干燥至恒重后测其质量W₂。上述实验重复三次，求其平均值，其中，失重率>5％定义为可溶，失重率<5％视为不可溶。失重率(L)按下述公式计算：

$L=\frac{W_0-W_2}{W_0}\&times;100\%$

纤维素酶固载量测定方法如下：

准确称取一定量的壳聚糖微球，用10mL的磷酸缓冲液(PBS,pH＝7)溶胀24小时后分离，再向其中加入10mL的5％戊二醛溶液，于25℃下振荡活化5小时过滤，用蒸馏水洗去多余的戊二醛，再加入一定量的酶液，恒温振荡固定时间后，取适量上清液，测定上清液中游离纤维素酶的浓度。

设定的固定时间到达后，从锥形瓶中吸取2mL上清液，再加入2mL磷酸缓冲液，混匀后于278nm下测吸光度值。对照纤维素酶标准曲线计算出上清液酶浓度，纤维素酶固载量为吸附前后游离纤维素酶含量之差与载体的质量比，单位是mg/g。纤维素酶固载量的计算如下式：

其中，标准曲线的绘制按照表1所示的方法进行。其中纤维素酶的浓度为1.0mg/mL。采用pH值为7.0且浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲液配制，于278nm处测定吸光值。以纤维素酶浓度为纵坐标，在278nm处的吸光值(A₂₇₈)为横坐标，绘制标准曲线，如图1所示，得到的线性方程为y＝0.5564x-0.0062(R²＝0.9992)。

表1纤维素酶标准曲线的制作

序号	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										酶液/mL	0	0.5	1	1.5	2	2.5	3	3.5	4
PBS 7.0/mL	4	3.5	3	2.5	2	1.5	1	0.5	0
										酶浓度mg/mL	0	0.125	0.25	0.375	0.5	0.625	0.75	0.875	1

实验1-1

准确称取三份0.5g壳聚糖粉末，质量分数为5％的壳聚糖乙酸溶液，甲醛用量分别为0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL，搅拌速率为350r/min，Span80为2滴，环氧氯丙烷的用量为2.0mL，其它条件与实施例1相同，进行实验。制得的壳聚糖微球置于50℃真空干燥器内至恒重。取制得的壳聚糖微球用于如上所述的溶解性、溶胀性和固载量实验，结果如下：

表1－1甲醛对NCTS溶解性、溶胀度和固载量的影响

(“+”表示失重率>5％，即为可溶；“-”表示失重率<5％，即为不可溶。)

壳聚糖微球合成过程中甲醛与分子链上的氨基及羟基发生反应，在反应停止后用盐酸处理，使甲醛被洗脱，将壳聚糖原来具有的活性位点还原，这样，甲醛在某种意义上起到了保护活性位点的作用。当甲醛用量较少时，不能很好地起到保护活性位点的作用，会使更多的氨基和环氧氯丙烷发生交联反应；甲醛用量过多时，壳聚糖与环氧氯丙烷之间的交联反应不能很好地进行，进而使壳聚糖微球易在酸性溶液中流失。综上，故甲醛用量以1.0mL为佳。

实验1-2

准确称取三份0.5g壳聚糖粉末，质量分数为5％的壳聚糖乙酸溶液，甲醛的用量为1.0mL，搅拌速率为350r/min，Span80为2滴，环氧氯丙烷的用量分别为1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL，其它条件同实施例1，进行实验。制得的壳聚糖微球放于50℃真空干燥器内至恒重。取制得的壳聚糖微球用于溶解性、溶胀性和固载量实验，结果如下：

表1-2环氧氯丙烷对NCTS溶解性、溶胀度和固载量的影响

(“+”表示失重率>5％，即为可溶；“-”表示失重率<5％，即为不可溶。)

环氧氯丙烷用量为1.0mL得到的壳聚糖微球在1mol/L和2mol/L的HCl溶液发生部分溶解；壳聚糖微球的溶胀性与环氧氯丙烷的用量呈负相关。若环氧氯丙烷用量较少，会导致壳聚糖交联程度太低，进而引起部分未交联的含自由氨基较多的壳聚糖分子的溶解。因此，环氧氯丙烷的用量以2.0mL为佳。

实验1-3

准确称取三份0.5g壳聚糖粉末，质量分数为5％的壳聚糖乙酸溶液，甲醛的用量为1.0mL，环氧氯丙烷的用量为2.0mL，Span80为2滴，搅拌速率分别为150r/min、250r/min、350r/min，其它条件同实施例1，进行实验。制得的壳聚糖微球放于50℃真空干燥器内至恒重。取制得的壳聚糖微球用于溶解性、溶胀性和固载量实验，结果如下：

表1-3搅拌速度对NCTS溶解性、溶胀度和固载量的影响

(“+”表示失重率>5％，即为可溶；“-”表示失重率<5％，即为不可溶。)

当搅拌速率增加时，分散在液体石蜡中的壳聚糖液滴粒径变小，液滴数量增多，比表面积增大，从而与环氧氯丙烷的接触面积增大，交联度相应增大，溶胀度就降低。随着搅拌速率的增加，粒径为20目的壳聚糖微球所占的比重越来越小，40目和60目及以下的壳聚糖微球的比重越来越大。壳聚糖微球的粒径越小，比表面积就越大，和酶分子的接触面也就越大。但粒径过小时，比表面积过大时，会使壳聚糖微球漂浮于溶液表面，不利于酶的固定化。综上，搅拌速率以250r/min为佳。

实施例2

(1)准确称取10mg的壳聚糖微球载体，用10mL的磷酸缓冲液(PBS,pH＝7)溶胀24小时后分离；

(2)在步骤(1)的所得物中加入10mL的5％戊二醛溶液，于25℃下振荡活化5小时并过滤，用蒸馏水洗去多余的戊二醛；

(3)在步骤(2)的所得物中加入2.0mg的纤维素酶酶液，30℃恒温振荡固定4小时后，过滤，滤渣用磷酸缓冲液进行反复冲洗后得固定化酶，将得到的固定化酶置于冰箱中保存(4℃)备用。

以下说明纤维素酶活力的测定方法及由实施例2得到的固定化酶的酶活力测定方法。

游离酶活力测定：取适量纤维素酶溶于HAc-NaAc缓冲液，配置成一定浓度的纤维素酶溶液。取1mL酶液加入5mLHAc-NaAc缓冲液，再加入10mL浓度为1％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液，并做平行。对照组的酶液在沸水中灭活15min，空白组中不加催化底物，用等量的HAc-NaAc缓冲液替代。在50℃振荡器中以150r/min反应30min，立即取2mL反应液与比色管中，加入2mLDNS试剂，混匀后于沸水中加热10min后用流水冷却，定容至25mL，摇匀后静置15min，用空白调零点，于540nm处测定吸光度，并计算纤维素酶的活力。

固定化酶活力测定：取等当量的固定化酶加入5mLHAc-NaAc缓冲液，再加入10mL浓度为1％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液，在50℃振荡器中以120r/min反应30分钟，立即取2mL反应液于比色管中，加入2mLDNS试剂，混匀后于沸水中加热10分钟后用流水冷却，定容至25mL，摇匀后静置15分钟，于540nm处测定吸光度，并计算纤维素酶的活力。同样设置平行和对照。

ΔA＝A_平均-A_对照

其中：A_平均：样品液的平均吸光值；A_对照：对照液的吸光值；G：ΔA值在葡萄糖标准曲线上对应的葡萄糖量；n：酶粉(液)的稀释倍数；t：反应时间min；M：样品重量(mg)。

固定化酶的活力回收率是指固定化酶总活力与固定化时加入游离酶总活力的比值，以百分数表示。

固定化酶或游离酶的相对酶活(％)：指在同组实验中以活力最高的为100，与其余的固定化酶或游离酶的活力之比，通常以百分数表示。

其中，上述提及的葡萄糖标准曲线的制作如下：

取11支比色管，洗净烘干并编号，按表2加入1.0mg/mL葡萄糖标准溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。

表2不同浓度的葡萄糖溶液

将溶液摇匀后，向各比色管中加入2.0mLDNS，摇匀后在沸水浴中加热l0min，然后流水冷却，用蒸馏水定容至25mL，充分摇匀后静置15min，以0号试管为参比，于540nm处测吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值A₅₄₀为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。如图2所示，得到的线性方程为y＝1.1895x-0.0007(R²＝0.9996)。

实验2-1

平行取各类微球载体10.0mg多份，在其它固定化条件相同的情况下，改变固定化时间分别为2小时、3小时、4小时、5小时、6小时，然后在其它固定化条件相同的情况下，按照实施例2的方法制备固定化酶。

图3为时间对纤维素酶固定化的影响。

如图3所示，固定化时间对酶活力有很大影响。NCTS载体和NCTS-EDA载体固定化酶的相对活力均随时间的延长而增大，NCTS和NCTS-EDA载体固定化酶的相对活力在4小时达到最大，此后随着时间的继续增加，相对酶活呈现下降的趋势。若时间太短，酶分子与载体不能进行充分的接触固定，导致固定于载体上的酶分子较少，固定化酶活力低；若时间过长，载体上经过戊二醛活化产生的与酶结合的位点趋于饱和，酶分子在载体上积聚过多，导致空间位阻的增大，影响酶和底物的有效接触，以及底物的扩散作用，影响酶分子活力的发挥。另外，固定化是在振荡条件下进行，过长的时间也可能使载体表面结合不牢的酶蛋白脱落下来，这也会导致酶活性的下降。因此，NCTS载体对纤维素酶的固定化时间为4小时。

实验2-2

用不同pH的缓冲液(pH＝4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)配置一系列浓度为0.1mg/mL的纤维素酶溶液，并分别测定不同pH值下的游离酶活力，再平行取壳聚糖微球载体10.0mg多份，在其它固定化条件不变的情况下，分别加入20mL上述不同pH值的纤维素酶溶液，然后在其它固定化条件相同的情况下按照实施例2的方法制备固定化酶。

图4为pH值对纤维素酶固定化的影响。

如图4所示，当pH在6.0-7.0范围时，NCTS载体和NCTS-EDA载体固定化酶均表现出较高的活性，超出此范围，酶活力均出现不同程度的下降。由于pH值对纤维素酶的活性中心和结构稳定性以及酶与载体的结合具有影响，固定化酶的形成最好在中性(pH＝7.0)或偏中性条件下进行，过酸或者过碱的pH环境都会降低酶的活力。

实验2-3

平行取壳聚糖微球载体10.0mg多份，在其它固定化条件相同的情况下，分别加入不同量的纤维素酶，使给酶量为1.0/10.0mg载体、1.5/10.0mg载体、2.0/10.0mg载体、2.5/10.0mg载体和3.0mg/10.0mg载体，然后在其它固定化条件相同的情况下按照实施例2的方法制备固定化酶。

图5为给酶量对纤维素酶固定化的影响。

如图5所示，壳聚糖微球载体质量一定，固定化酶的活力随着给酶量的增加而变大，当给酶量增加到一定值时，酶活力反而有所降低。由图5可知给酶量在2.0-2.5mg/10.0mg(NCTS载体)范围内，固定化酶均具有较高的酶活力。

实验2-4

平行取壳聚糖微球载体10.0mg多份，在其它固定化条件相同的情况下，改变固定化温度分别为15℃、20℃、25℃、30℃和35℃，然后在其它固定化条件相同的情况下按照实施例2的方法制备固定化酶，观察温度对酶固定化的影响。

图6为温度对纤维素酶固定化的影响。

如图6所示，相对酶活随固定化温度的升高呈现出先增加而后减小的趋势。当固定化温度在25-35℃范围时，固定化纤维素酶的相对活力均达到了78％以上。

综上，壳聚糖微球载体NCTS固定化酶的最佳条件：固定化时间4小时，固定化pH＝7，给酶量为2.0mg/10.0mg载体，固定化温度为30℃。在此最佳固定化条件下，酶的固载量为97.6mg/g(载体)，酶活力回收率达到了76.8％。

实验3-1

对应取适量的游离酶和固定化酶，分别加入不同pH(2.8-7.8)的HAc-NaAc缓冲液和对应pH值的CMC-Na溶液，按照游离酶活力测定方法和固定化酶活力测定方法测定酶活力，最高的酶活力设为100％。

图7为pH对游离酶(Freeenzyme)和固定化酶相对活力的影响。

如图7所示，随着pH值的增大，游离酶和固定化酶活性均呈现先增大而后减小的变化趋势，最适pH值均是4.8，但是固定化纤维素酶在大部分的pH值下都比游离的纤维素酶活性高，这表明固定化纤维素酶较游离纤维素酶表现出更好的pH适应性。

实验3-2

对应取适量的游离酶和固定化酶，加入HAc-NaAc缓冲液和CMC-Na溶液，分别于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下反应，按照游离酶活力测定方法和固定化酶活力测定方法测定酶活力，最高的酶活力设为100％。

图8为温度对游离酶和固定化酶相对活力的影响。

如图8所示，游离酶的最适温度为50℃，且曲线走向趋势较为陡峭，说明游离酶的催化反应受温度影响较大，而经固定化后，虽然固定化酶的最适温度没有提高，但是在50℃-70℃范围内都保持了较高的酶活，最适温度范围变宽。这说明固定化酶的热稳定性要高于游离酶。

实验3-3

对应取适量的游离酶和固定化酶，置于50和70℃水浴中，每隔30min、60min、90min、120min取出测定酶活力，未经保温处理的酶活设定为100％。

图9为50℃下游离酶和固定化酶的热稳定性。图10为70℃下游离酶和固定化酶的热稳定性。

如图9所示，在50℃时，随着保温时间的延长，游离酶和固定化酶的酶活力出现不同程度的降低，且游离酶活力下降的更快。保温120min后，游离酶和固定化酶残留活力为64％、76％(NCTS)、78％(NCTS-EDA)。由图10可以得出，在70℃时，游离酶和固定化酶的酶活力也会随着保温时间的延长而降低，且和50℃时比较，其降低速率更快。保温90min时，游离酶活力只有55％，固定化酶活力在60％以上，保温120min时，游离酶活力仅剩余41％，固定化酶残存活力为52％(NCTS)、56％(NCTS-EDA)。由此可得出，固定化酶的热稳定性明显优于游离酶，这对固定化酶在工业上的应用具有重要的意义。

实验3-4

精确配制几份具有浓度梯度的羧甲基纤维素钠溶液。在某个浓度，间隔一定的时间测定酶的活力，因而可以测得该浓度下酶的反应速度。依此法测得各浓度下酶的反应速度，最后根据Lineweaver-Burk作1/v对1/[S]的双倒数图，求K_m值。

米氏方程(Michaelis-Mentenequation)，表明了反应底物浓度酶促反应速度之间的定量关系。Michaelis-Menten方程的数学表达式如下：

$V=\frac{V_{\max }\&lsqb;S\&rsqb;}{K_m+\&lsqb;S\&rsqb;}$

式中V为反应速度(μg/mL·min)，K_m为米氏常数(mg/mL)；V_max为酶反应的最大速度(μg/mL·min)，[S]是底物浓度。

游离酶和固定化酶的动力学参数(V_max和K_m)采用双倒数作图法(Lineweaver-Burk作图法)求得。Lineweaver-Burk方程的数学表达式如下：

$\frac{1}{V}=\frac{K_m}{V_{\max }}\&times;\frac{1}{\&lsqb;S\&rsqb;}+\frac{1}{V_{\max }}$

图11为固定化酶和游离酶的Lincwaver-Burk曲线。

由图11可以得游离纤维素酶和固定化纤维素酶的米氏方程，分别为：

游离纤维素酶的米氏方程：

y＝0.0151x+0.8501，R²＝0.9950

采用NCTS为载体的固定化纤维素酶的米氏方程：

y＝0.0199x+0.6779，R²＝0.9907

采用NCTS-EDA为载体的固定化纤维素酶的米氏方程：

y＝0.0178x+0.7115，R²＝0.9931

由以上方程可以计算出游离纤维素酶和四种固定化纤维素酶的米氏常数K_m分别为：游离纤维素酶0.018mg/mL；固定化纤维素酶(NCTS)0.029mg/mL；固定化纤维素酶(NCTS-EDA)0.025mg/mL。

K_m表示酶与底物亲和力的大小，一般近似用1/K_m表示亲和力。K_m值越小，1/K_m值越大，表明酶和底物的亲和力越大，酶促反应易于进行。从上可以看出，游离纤维素酶的K_m值最小，固定化酶的K_m值较大。即固定化酶与底物的亲和力降低。

实验3-5

将多份游离酶和固定化酶置于4℃冰箱保存，每隔7天取出测酶活力，监测酶活的降低趋势，直至35天。

图12为游离酶和固定化酶的贮藏稳定性。

如图12所示，游离纤维素酶和固定化酶的酶活力都逐渐下降，但幅度各不相同。游离酶随着贮藏时间的延长，酶活力下降很快，到35天时，其剩余活力仅剩下20％。而固定化酶的活性在35天时在50％以上。结果表明，经固定化后纤维素酶的稳定性得到有效的提升。固定化酶具有比游离酶更好的贮藏稳定性，这在实际应用和生产中具有非常重要的意义。

实验3-6

取固定化纤维素酶加入5mLHAc-NaAc缓冲液和浓度为1％CMC-Na溶液，于50℃反应30min后，测定酶活力并过滤分离固定化酶，用PBS缓冲液洗涤。在相同条件下重复以上步骤并测定相应的酶活，得重复反应9次的固定化酶，第一次反应测量的酶活设为100％。

图13为固定化纤维素酶的重复使用性能。

如图13所示，固定化纤维素酶的活性则随着操作次数的增加而缓慢下降，固定化酶在经过5次的重复使用后，活性可保留80％以上，使用9次以后，NCTS和NCTS-EDA固定化酶活性保留仍然在60％以上。由于固定化酶较游离酶可以进行多次重复使用，且具有操作稳定性，不仅提高了酶的使用效率，有效地降低成本，也使连续催化反应工艺设计成为可能，具有实际应用价值。

上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于酶固定化的壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，包括：

（1）在0.5g壳聚糖粉末中加入质量分数为5%的乙酸溶液，待壳聚糖粉末充分溶解后，加入液体石蜡，搅拌10分钟；

（2）将步骤（1）的所得物升温至50℃，滴加乳化剂Span80，乳化10分钟；

（3）在步骤（2）的所得物中加入0.5～2.0mL的甲醛溶液，搅拌反应1.5小时；

（4）将步骤（3）的所得物升温至70℃，滴加质量分数为10%的NaOH溶液，在溶液pH值保持为碱性条件下，缓慢滴加1.0～2.5mL的环氧氯丙烷，反应5小时；

（5）将步骤（4）的所得物过滤，用蒸馏水洗涤，再依次用石油醚、无水乙醇洗涤、水洗涤，直至洗涤液的pH值达到中性；

（6）将步骤（5）的所得物用1mol/L的盐酸加热处理9小时，接着依次进行碱洗、酸洗和水洗，直至洗涤液的pH值达到中性，再干燥至恒重，得到用于酶固定化的壳聚糖微球（NCTS）。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中甲醛的用量为1.0mL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中环氧氯丙烷的用量为2.0mL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：各步骤中搅拌反应的搅拌速率为250r/min。

5.一种用于酶固定化的壳聚糖微球，其特征在于，由权利要求1-4中任意一项方法制备。

6.一种纤维素酶固定化的方法，其特征在于，包括：

（1）将10mg权利要求5所述的壳聚糖微球用pH值为4.0～7.0的10mL的磷酸缓冲液溶胀24小时后分离；

（2）在步骤（1）的所得物中加入10mL的5%戊二醛溶液，于25℃下振荡活化5小时并过滤，用蒸馏水洗去多余的戊二醛；

（3）在步骤（2）的所得物中加入2.0～2.5mg酶液，于25～30℃下恒温振荡固定2～6小时后，过滤，滤渣用磷酸缓冲液进行反复冲洗后得固定化酶。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（3）中固定时间为4小时。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（1）中磷酸缓冲液的pH值为7.0。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（3）中固定温度为30℃。

10.一种由权利要求6所述的纤维素酶固定化方法得到的固定化酶。