CN107858343A - 一种固定化脂肪酶及其制备方法 - Google Patents

一种固定化脂肪酶及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107858343A
CN107858343A CN201711209172.XA CN201711209172A CN107858343A CN 107858343 A CN107858343 A CN 107858343A CN 201711209172 A CN201711209172 A CN 201711209172A CN 107858343 A CN107858343 A CN 107858343A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sodium alginate
lipase
immobilized lipase
mass fraction
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711209172.XA
Other languages
English (en)
Inventor
胡云峰
徐珊
李任强
郑振华
张云
孙爱君
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Original Assignee
South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Sea Institute of Oceanology of CAS filed Critical South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority to CN201711209172.XA priority Critical patent/CN107858343A/zh
Publication of CN107858343A publication Critical patent/CN107858343A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种固定化脂肪酶及其制备方法。它是将海藻酸钠和脂肪酶分别溶于缓冲液中，得到海藻酸钠溶液和脂肪酶液，按照海藻酸钠：脂肪酶＝(15～35)mg：(400～1600)U的比例将海藻酸钠溶液和脂肪酶液混合均匀，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液滴加到质量分数2％～6％的氯化钙溶液中，形成凝胶小球后再固定，然后过滤将凝胶小球加入到交联剂水溶液中，20℃～50℃下震荡交联0.5～3.5h，经洗涤、抽滤后得到固定化脂肪酶。本发明制备的固定化脂肪酶的酶活达84.9U/g，具有较高的热稳定性和操作稳定性，重复利用率高，符合工业应用的需要。

Description

一种固定化脂肪酶及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种固定化脂肪酶及其制备方法。
背景技术：
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一类能催化脂肪水解的酰基水解酶的总称，能在油水界面上催化酯水解、醇解、酯合成、酯交换、立体异构体拆分等有机合成反应，其在食品、制革、洗涤、制药和环境治理等工业领域有着较为广泛的应用。作为一种新兴的可再生清洁能源，生物柴油一直是研究热点，它可以由脂肪酶催化动植物油脂、与短链脂肪醇发生酯交换反应而制备。利用脂肪酶催化生产生物柴油时，其使用成本是主要的限制因素，严重地制约着基于动植物油脂生产生物柴油的工业化进程。由于游离的脂肪酶稳定性差，相对容易受到温度、pH、离子浓度等因素的影响而失活和变性，对反应条件要求较高，且使用后分离纯化较困难，使用效率低导致成本较高，在一定程度上制约了脂肪酶的工业化使用。相较于游离酶而言，固定化酶不但与其具有相同的催化特征，且稳定性、使用效率均大幅度提高，同时又可实现连续反应和分离回收，有效降低了生物柴油等化工产品制备中脂肪酶的使用成本。因此，研究脂肪酶的固定化技术对于降低催化动植物油脂制备生物柴油的生产成本和推动其产业化具有极为重要的意义。
海藻酸钠是由β-(1，4)-D甘露糖醛酸(M)和α-(1，4)-L古洛糖醛酸(G)组成的线性高聚物，分子链中的G块能与Ca2+产生交联作用，在两条分子链的G块之间形成1个洞，结合Ca2+生成“蛋盒”状模型，生成热不可逆凝胶，使得酶分子被固定到凝胶网络中而无法自由移动。同时，海藻酸钠具有自由的羧基和羟基，温度对其在水中的溶解性影响不大，材料可塑性较好，容易制备成膜或球状，无毒且价格较低、材料来源广泛、不会造成环境污染，常被用来作为酶的固定化载体。然而单独采用海藻酸钠固定得到的固定化酶存在稳定性差、容易泄漏等缺点，需要采用交联的方法来进一步加强酶载载体上的结合。在现有的脂肪酶固定方法中，几乎都使用戊二醛作为交联剂，戊二醛交联后能使酶分子与载体结合更紧密，但同时戊二醛与蛋白发生的交联反应较为剧烈，容易造成较大的活性损害。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种固定化脂肪酶及其制备方法。
本发明的第一个目的是提供固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤：将海藻酸钠和脂肪酶分别溶于pH 6.0～8.5的缓冲液中，得到海藻酸钠溶液和脂肪酶液，按照海藻酸钠：脂肪酶＝(15～35)mg：(400～1600)U的比例将海藻酸钠溶液和脂肪酶液混合均匀，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，所述的海藻酸钠/脂肪酶混合液中海藻酸钠的含量为7.5～17.5mg/mL，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液滴加到质量分数2％～6％的氯化钙溶液中，形成凝胶小球后再固定，然后过滤将凝胶小球加入到体积分数0.2％～0.8％的交联剂水溶液中，20℃～50℃下震荡交联0.5～3.5h，经洗涤、抽滤后得到固定化脂肪酶；
所述的交联剂为乙二醇缩水甘油醚。
所述的缓冲液优选为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液或巴比妥钠-盐酸缓冲液。
所述的缓冲液优选为pH 7.0的磷酸缓冲液。
所述的海藻酸钠溶液优选为质量分数1.5％～3.5％的海藻酸钠溶液。
所述的脂肪酶液优选为400～1200U/mL的脂肪酶液。
所述的固定是在4℃固定10～60min。
本发明的固定化脂肪酶的制备方法，具体步骤为：将海藻酸钠和脂肪酶分别溶于pH 7.0的磷酸缓冲液中，配制成质量分数2.5％的海藻酸钠溶液和400U/mL的脂肪酶液，将海藻酸钠溶液和脂肪酶液按体积比1:1的比例混合均匀，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液用注射器滴加到质量分数5％的氯化钙溶液中，形成凝胶小球后置于4℃固定20min，过滤后将凝胶小球加入到体积分数0.35％的乙二醇缩水甘油醚水溶液中，25℃下震荡交联1h，经洗涤、抽滤后得到固定化脂肪酶。
本发明的第二个目的是提供上述的固定化脂肪酶的制备方法制备得到的固定化脂肪酶。
本发明的脂肪酶可以为其他市售或通过嗜热丝孢菌等在合适的培养条件下发酵而得的脂肪酶，也可以为通过基因工程，蛋白质工程等现代生物学手段改造而得，包括化学修饰的酶，蛋白质工程的突变体或基因工程菌产生的脂肪酶。
本发明制备的固定化脂肪酶的酶活为84.9U/g，最适pH为8.5，最适温度为40℃，具有较高的热稳定性和操作稳定性，重复利用率高，重复操作4次后，固定化脂肪酶的酶活力保留原来的50.32％，相比较于游离脂肪酶只能使用一次而无法回收，固定化脂肪酶的使用效率显著提高，符合工业应用的需要。
附图说明：
图1是海藻酸钠溶液浓度、给酶量、氯化钙溶液浓度、缓冲液pH、固定时间对脂肪酶固定化的影响；其中a为海藻酸钠溶液浓度对固定化脂肪酶活性的影响；b为给酶量对固定化脂肪酶活性和固定效率的影响；c为氯化钙溶液浓度对固定化脂肪酶活性的影响；d为缓冲液pH对固定化脂肪酶活性的影响；e为固定时间对固定化脂肪酶活性的影响。
图2是交联剂选择、交联剂浓度、交联温度和交联时间对固定化脂肪酶酶活的影响；其中a为不同交联剂对固定化脂肪酶酶活的影响；b为交联剂浓度对固定化脂肪酶酶活的影响；c为交联温度对固定化脂肪酶酶活的影响；d为交联时间对固定化脂肪酶酶活的影响。
图3是反应pH、反应温度、热处理和操作次数对固定化脂肪酶酶活的影响；其中a为不同反应pH对固定化脂肪酶酶活的影响；b为不同反应温度对固定化脂肪酶酶活的影响；c为固定化脂肪酶的热稳定性；d为固定化脂肪酶的操作稳定性。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：固定化脂肪酶的获得
1.1海藻酸钠溶液浓度对脂肪酶固定化的影响
设定每毫升海藻酸钠溶液的给酶量为800U，氯化钙溶液浓度为质量分数3％，固定时间30min，缓冲液pH 7.0条件下，考察海藻酸钠溶液浓度(质量分数1.5、2.0、2.5、3.0、3.5％)对固定化脂肪酶活性的影响。
具体步骤为：
S1、称取海藻酸钠加入到pH 7.0的磷酸缓冲液中，充分搅拌至海藻酸钠完全溶解，制备质量分数1.5％、2.0％、2.5％、3.0％和3.5％的海藻酸钠溶液；将脂肪酶(深圳恒生生物科技有限公司，货号：9001-62-1)溶于pH 7.0的磷酸缓冲液中，制备800U/mL的脂肪酶液；
S2、将不同浓度的海藻酸钠溶液(质量分数1.5％、2.0％、2.5％、3.0％和3.5％的海藻酸钠溶液)和800U/mL的脂肪酶液按照体积比1:1混合搅拌均匀，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液用注射器(5号针头)滴加到质量分数3％的氯化钙溶液中，形成光滑凝胶小球后置于4℃固定30min，然后使用去离子水冲洗去除凝胶小球的表面离子，抽滤除去表面水分，得到固定化脂肪酶，置于4℃冰箱保存。
测定制备的固定化脂肪酶酶活。由图1a可知：当海藻酸钠溶液浓度逐渐升高时，固定化脂肪酶的酶活先增大后减小并逐渐趋于平缓，在海藻酸钠溶液浓度为质量分数2.0％时酶活达最大值。
1.2给酶量对脂肪酶固定化的影响
设定海藻酸钠溶液浓度为质量分数2.0％，氯化钙溶液浓度为质量分数3％，固定时间30min，缓冲液pH 7.0条件下，考察给酶量(200、400、800、1200、1600U)对固定化脂肪酶活性和固定效率的影响。
具体步骤为：
S1、称取2.0g海藻酸钠加入到98.0g pH 7.0的磷酸缓冲液中，充分搅拌至海藻酸钠完全溶解，制备质量分数2.0％的海藻酸钠溶液；将脂肪酶(深圳恒生生物科技有限公司，货号：9001-62-1)溶于pH 7.0的磷酸缓冲液中，分别制备200、400、800、1200、1600U/mL的脂肪酶液；
S2、将质量分数2％的海藻酸钠溶液和不同酶活的脂肪酶液(200、400、800、1200、1600U/mL的脂肪酶液)按照体积比1:1混合搅拌均匀(即每毫升海藻酸钠溶液的给酶量分别为200、400、800、1200、1600U)，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液用注射器(5号针头)滴加到质量分数3％的氯化钙溶液中，形成光滑凝胶小球后置于4℃固定30min，然后使用去离子水冲洗去除凝胶小球的表面离子，抽滤除去表面水分，得到固定化脂肪酶，置于4℃冰箱保存。
测定制备的固定化脂肪酶酶活和固定效率。由图1b可知：脂肪酶的固定效果受到给酶量的影响，其酶活大小与给酶量成正相关，但固定效率却先增大后减小。综合考虑酶活力和固定效率两个因素，设定给酶量为800U/mL海藻酸钠溶液。
1.3氯化钙溶液浓度对脂肪酶固定化的影响
设定海藻酸钠溶液浓度为质量分数2.0％，每毫升海藻酸钠溶液的给酶量为800U，固定时间30min，缓冲液pH 7.0条件下，考察氯化钙溶液浓度(质量分数1％、2％、3％、4％、5％、6％)对固定化脂肪酶活性的影响。
具体步骤为：
S1、称取2.0g海藻酸钠加入到98.0g pH 7.0的磷酸缓冲液中，充分搅拌至海藻酸钠完全溶解，制备质量分数2.0％的海藻酸钠溶液；将脂肪酶(深圳恒生生物科技有限公司，货号：9001-62-1)溶于pH 7.0的磷酸缓冲液中，制备800U/mL的脂肪酶液；
S2、将质量分数2％的海藻酸钠溶液和800U/mL的脂肪酶液按照体积比1:1混合搅拌均匀，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液用注射器(5号针头)滴加到不同浓度的氯化钙溶液(质量分数1％、2％、3％、4％、5％和6％的氯化钙溶液)中，形成光滑凝胶小球后置于4℃固定30min，然后使用去离子水冲洗去除凝胶小球的表面离子，抽滤除去表面水分，得到固定化脂肪酶，置于4℃冰箱保存。
测定制备的固定化脂肪酶酶活。由图1c可知：氯化钙溶液浓度偏大或偏小均对固定化脂肪酶的酶活有一定的抑制作用，随着氯化钙溶液浓度的逐渐增大，固定化脂肪酶的酶活先上升后下降，在氯化钙溶液浓度为质量分数4％的操作条件下，试验测得最大酶活。
1.4缓冲液pH对脂肪酶固定化的影响
设定海藻酸钠溶液浓度为质量分数2.0％，每毫升海藻酸钠溶液的给酶量为800U，氯化钙溶液浓度为质量分数4％，固定时间30min条件下，考察缓冲液pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)对固定化脂肪酶活性的影响。
具体步骤为：
S1、称取2.0g海藻酸钠加入到98g不同pH值的磷酸缓冲液(pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)中，充分搅拌至海藻酸钠完全溶解，得到不同pH值的质量分数2.0％的海藻酸钠溶液；将脂肪酶(深圳恒生生物科技有限公司，货号：9001-62-1)溶于不同pH值的磷酸缓冲液(pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)中，得到不同pH值的800U/mL的脂肪酶液；
S2、将相同pH值的质量分数2％的海藻酸钠溶液和800U/mL的脂肪酶液按照体积比1:1混合搅拌均匀，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液用注射器(5号针头)滴加到质量分数4％的氯化钙溶液中，形成光滑凝胶小球后置于4℃固定30min，然后使用去离子水冲洗去除凝胶小球的表面离子，抽滤除去表面水分，得到固定化脂肪酶，置于4℃冰箱保存。
测定制备的固定化脂肪酶酶活。由图1d可知：脂肪酶酶粉在中性缓冲液中溶解被固定后的酶活最高，酸性或碱性条件下酶活均受到一定程度的影响，缓冲液pH为7.0时固定化脂肪酶有最大值。
1.5固定时间对脂肪酶固定化的影响
设定海藻酸钠溶液浓度为质量分数2.0％，每毫升海藻酸钠溶液的给酶量为800U，氯化钙溶液浓度为质量分数4％，缓冲液pH 7.0条件下，考察固定时间(10、20、30、40、50、60min)对固定化脂肪酶活性的影响。
具体步骤为：
S1、称取2.0g海藻酸钠加入到98g pH7.0的磷酸缓冲液中，充分搅拌至海藻酸钠完全溶解，得到质量分数2.0％的海藻酸钠溶液；将脂肪酶(深圳恒生生物科技有限公司，货号:9001-62-1)溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，制备800U/mL的脂肪酶液；
S2、将质量分数2.0％的海藻酸钠溶液和800U/mL的脂肪酶液按照体积比1:1混合搅拌均匀，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液用注射器(5号针头)滴加到质量分数4％的氯化钙溶液中，形成光滑凝胶小球后置于4℃分别固定10、20、30、40、50、60min，然后使用去离子水冲洗去除凝胶小球的表面离子，抽滤除去表面水分，得到固定化脂肪酶，置于4℃冰箱保存。
测定制备的固定化脂肪酶酶活。由图1e可知：凝胶小球在氯化钙溶液中的固定时间对固定化脂肪酶的酶活有较大影响，因此，在保证凝胶小球较好的稳定性的前提下，应尽量缩短固定时间，以保持较高的酶活。
1.6正交试验优化脂肪酶固定化条件
根据单因素试验结果，选择海藻酸钠溶液浓度、给酶量、氯化钙溶液浓度、固定时间这几个因素设计正交试验(缓冲液pH 7.0条件下)，以固定效率为考察指标，分析固定化的最佳条件。由表1可知：最佳制备条件为海藻酸钠溶液浓度为质量分数2.5％，给酶量400U/mL海藻酸钠溶液，氯化钙溶液浓度为质量分数5％，固定时间20min。分析各因素的影响效果，海藻酸钠溶液浓度对固定效率的影响最大，其次是给酶量，氯化钙溶液浓度的影响最小。按最佳条件设计验证试验，得到酶的固定效率为22.39％，说明优化后的方案优于最初的固定化条件。
表1脂肪酶固定化条件优化正交试验结果与分析
实施例2：固定化脂肪酶的交联
2.1交联剂选择对固定化脂肪酶酶活的影响
按实施例1得到的最佳制备条件：海藻酸钠溶液浓度为质量分数2.5％，给酶量400U/mL海藻酸钠溶液，氯化钙溶液浓度为质量分数5％，固定时间20min(缓冲液pH 7.0条件下)。设定交联剂水溶液的浓度为体积分数0.1％，25℃下震荡交联1h，考察不同交联剂(戊二醛、乙二醇缩水甘油醚、新戊二醛缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚)对交联后固定化脂肪酶活性的影响。
具体步骤为：
S1、称取2.5g海藻酸钠加入到97.5g pH7.0的磷酸缓冲液中，充分搅拌至海藻酸钠完全溶解，得到质量分数2.5％的海藻酸钠溶液；将脂肪酶(深圳恒生生物科技有限公司，货号:9001-62-1)溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，制备400U/mL的脂肪酶液；
S2、将质量分数2.5％的海藻酸钠溶液和400U/mL的脂肪酶液按照体积比1:1混合搅拌均匀，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液用注射器(5号针头)滴加到质量分数5％的氯化钙溶液中，形成光滑凝胶小球后置于4℃固定20min，过滤后将凝胶小球加入到体积分数0.1％的交联剂(戊二醛、乙二醇缩水甘油醚、新戊二醛缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚)水溶液中，25℃下震荡交联1h，使用去离子水冲洗去除凝胶小球的表面离子，抽滤除去表面水分，得到固定化脂肪酶，置于4℃冰箱保存。
测定制备的固定化脂肪酶酶活。由图2a可知：乙二醇缩水甘油醚作为交联剂时，固定化脂肪酶的酶活最高。
2.2交联剂水溶液浓度对固定化脂肪酶酶活的影响
按实施例1得到的最佳制备条件：海藻酸钠溶液浓度为质量分数2.5％，给酶量400U/mL海藻酸钠溶液，氯化钙溶液浓度为质量分数5％，固定时间20min(缓冲液pH 7.0条件下)。不同乙二醇缩水甘油醚水溶液浓度(体积分数0.05、0.2、0.35、0.5、0.65、0.8、0.95％的乙二醇缩水甘油醚水溶液)，在25℃下震荡交联1h，测定各组酶活。
具体步骤为：
S1、称取2.5g海藻酸钠加入到97.5g pH7.0的磷酸缓冲液中，充分搅拌至海藻酸钠完全溶解，得到质量分数2.5％的海藻酸钠溶液；将脂肪酶(深圳恒生生物科技有限公司，货号：9001-62-1)溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，制备400U/mL的脂肪酶液；
S2、将质量分数2.5％的海藻酸钠溶液和400U/mL的脂肪酶液按照体积比1:1混合搅拌均匀，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液用注射器(5号针头)滴加到质量分数5％的氯化钙溶液中，形成光滑凝胶小球后置于4℃固定20min，过滤后将凝胶小球加入到不同浓度乙二醇缩水甘油醚水溶液(体积分数0.05、0.2、0.35、0.5、0.65、0.8、0.95％的乙二醇缩水甘油醚水溶液)中，25℃下震荡交联1h，使用去离子水冲洗去除凝胶小球的表面离子，抽滤除去表面水分，得到固定化脂肪酶，置于4℃冰箱保存。
测定制得的固定化脂肪酶酶活。由图2b可知：随着乙二醇缩水甘油醚水溶液浓度的增大，固定化脂肪酶的酶活先增大后减小，在乙二醇缩水甘油醚水溶液浓度为体积分数0.35％时有最大酶活。
2.3交联温度对固定化脂肪酶酶活的影响
按实施例1得到的最佳制备条件：海藻酸钠溶液浓度为质量分数2.5％，给酶量400U/mL海藻酸钠溶液，氯化钙溶液浓度为质量分数5％，固定时间20min(缓冲液pH 7.0条件下)。固定乙二醇缩水甘油醚水溶液浓度为体积分数0.35％，改变交联温度(4、20、25、30、35、40、45、50℃)，其他条件固定不变，分别测定各组酶活。
具体步骤为：
S1、称取2.5g海藻酸钠加入到97.5g pH7.0的磷酸缓冲液中，充分搅拌至海藻酸钠完全溶解，得到质量分数2.5％的海藻酸钠溶液；将脂肪酶(深圳恒生生物科技有限公司，货号:9001-62-1)溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，制备400U/mL的脂肪酶液；
S2、将质量分数2.5％的海藻酸钠溶液和400U/mL的脂肪酶液按照体积比1:1混合搅拌均匀，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液用注射器(5号针头)滴加到质量分数5％的氯化钙溶液中，形成光滑凝胶小球后置于4℃固定20min，过滤后将凝胶小球加入到体积分数0.35％的乙二醇缩水甘油醚水溶液中，不同交联温度(4、20、25、30、35、40、45、50℃)下震荡交联1h，使用去离子水冲洗去除凝胶小球的表面离子，抽滤除去表面水分，得到固定化脂肪酶，置于4℃冰箱保存。
测定制备的固定化脂肪酶酶活。由图2c可知：交联温度为25℃时固定化脂肪酶呈现最大酶活，随着温度的不断上升，酶活先略有下降之后基本无变化。因此，确定交联温度为25℃。2.4交联时间对固定化脂肪酶酶活的影响
按实施例1得到的最佳制备条件：海藻酸钠溶液浓度为质量分数2.5％，给酶量400U/mL海藻酸钠溶液，氯化钙溶液浓度为质量分数5％，固定时间20min(缓冲液pH 7.0条件下)。设定乙二醇缩水甘油醚水溶液的浓度为体积分数0.35％，交联温度为25℃，改变交联时间0.5～3.5h(间隔时间为0.5h)，其他条件固定不变，分别测定各组酶活。
具体步骤为：
S1、称取2.5g海藻酸钠加入到97.5g pH7.0的磷酸缓冲液中，充分搅拌至海藻酸钠完全溶解，得到质量分数2.5％的海藻酸钠溶液；将脂肪酶(深圳恒生生物科技有限公司，货号：9001-62-1)溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，制备400U/mL的脂肪酶液；
S2、将质量分数2.5％的海藻酸钠溶液和400U/mL的脂肪酶液按照体积比1:1混合搅拌均匀，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液用注射器(5号针头)滴加到质量分数5％的氯化钙溶液中，形成光滑凝胶小球后置于4℃固定20min，过滤后将凝胶小球加入到体积分数0.35％的乙二醇缩水甘油醚水溶液中，25℃下震荡交联0.5～3.5h(间隔时间为0.5h)，使用去离子水冲洗去除凝胶小球的表面离子，抽滤除去表面水分，得到固定化脂肪酶，置于4℃冰箱保存。
测定制得的固定化脂肪酶酶活。分析图2d可知：1.5h是最佳的交联时长，交联时间较短时交联不够充分，酶活较低；而交联时间较长时，乙二醇缩水甘油醚对酶活造成损伤，且交联时间越长，损伤程度越大。
2.5正交试验优化脂肪酶固定化的交联条件
按实施例1得到的最佳制备条件：海藻酸钠溶液浓度为质量分数2.5％，给酶量400U/mL海藻酸钠溶液，氯化钙溶液浓度为质量分数5％，固定时间20min(缓冲液pH 7.0条件下)。根据单因素试验结果，针对交联剂浓度(乙二醇缩水甘油醚水溶液浓度)、交联温度、交联时间这3个因素设计L9(34)正交试验，以固定化脂肪酶的相对酶活为评价指标，分析最佳交联条件。由表2可知：最佳交联条件为乙二醇缩水甘油醚水溶液浓度为体积分数0.35％，交联温度25℃，交联时间0.5h。分析各因素的影响效果，交联剂浓度影响最大，其次为交联时间，交联温度的影响最小。利用最佳组合制备固定化脂肪酶，测得酶活约为84.90U/g。
表2固定化脂肪酶交联条件优化正交试验结果与分析
实施例3：交联后固定化脂肪酶与游离脂肪酶的酶学性质比较
按照实施例1和实施例2得到的最佳条件制备固定化脂肪酶，具体步骤为：
S1、称取2.5g海藻酸钠加入到97.5g pH7.0的磷酸缓冲液中，充分搅拌至海藻酸钠完全溶解，得到质量分数2.5％的海藻酸钠溶液；将脂肪酶(深圳恒生生物科技有限公司，货号：9001-62-1)溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，制备400U/mL的脂肪酶液；
S2、将质量分数2.5％的海藻酸钠溶液和400U/mL的脂肪酶液按照体积比1:1混合搅拌均匀，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液用注射器(5号针头)滴加到质量分数5％的氯化钙溶液中，形成光滑凝胶小球后置于4℃固定20min，过滤后将凝胶小球加入到体积分数0.35％的乙二醇缩水甘油醚水溶液中，25℃下震荡交联0.5h，使用去离子水冲洗去除凝胶小球的表面离子，抽滤除去表面水分，得到固定化脂肪酶。
3.1固定化脂肪酶与游离脂肪酶的最适反应pH
40℃，缓冲液pH为6.0～10.0范围内(间隔0.5个pH单位)条件下，分别测定固定化脂肪酶和游离脂肪酶的酶活。图3a表明：固定化脂肪酶和游离脂肪酶的最适pH分别为8.5和8.0，当反应缓冲溶液pH逐渐升高时，固定化脂肪酶有较明显的酶活优势。当pH>9.5后，固定化脂肪酶与游离脂肪酶的酶活均急剧下降。
3.2固定化脂肪酶与游离脂肪酶的最适反应温度
在最适反应pH条件下(pH8.5)，分别测定固定化脂肪酶和游离脂肪酶的最适反应温度(温度改变范围为25～60℃)。图3b表明，固定化脂肪酶与游离脂肪酶的最适反应温度都为40℃，两者的相对酶活随着温度升高的变化趋势基本相同，但当温度超过55℃后，游离脂肪酶严重失活，而固定化脂肪酶仍能发挥40％左右的酶活性。
3.3固定化脂肪酶与游离脂肪酶的热稳定性
将游离脂肪酶与固定化脂肪酶分别在40～65℃(间隔5℃)水浴条件下放置0.5h后，最适反应条件下(反应pH为8.5，反应温度为40℃)测定酶活，对照组放置在4℃冰箱。分析图3c，游离脂肪酶经海藻酸钠交联固定化后热稳定性明显提高，且这种优势随着温度的升高不断扩大。当温度到达65℃时，固定化脂肪酶仍能保持40％左右的酶活，而游离脂肪酶只剩下10％左右的活性。
3.4固定化脂肪酶的操作稳定性
取一定质量的固定化脂肪酶，保持反应条件相同(反应pH为8.5，反应温度为40℃)，连续不间断地进行7次水解反应，测酶活，以第1次样品活力为100％。由图3d可知，重复操作4次后，固定化脂肪酶的酶活力保留原来的50.32％，随着反应的继续进行，酶活力有所下降，相比较于游离脂肪酶只能使用一次而无法回收，固定化脂肪酶的使用效率是有所提高的。

Claims (9)

1.一种固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将海藻酸钠和脂肪酶分别溶于pH 6.0～8.5的缓冲液中，得到海藻酸钠溶液和脂肪酶液，按照海藻酸钠：脂肪酶＝(15～35)mg：(400～1600)U的比例将海藻酸钠溶液和脂肪酶液混合均匀，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，所述的海藻酸钠/脂肪酶混合液中海藻酸钠的含量为7.5～17.5mg/mL，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液滴加到质量分数2％～6％的氯化钙溶液中，形成凝胶小球后再固定，然后过滤将凝胶小球加入到体积分数0.2％～0.8％的交联剂水溶液中，20℃～50℃下震荡交联0.5～3.5h，经洗涤、抽滤后得到固定化脂肪酶；
所述的交联剂为乙二醇缩水甘油醚。
2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液或巴比妥钠-盐酸缓冲液。
3.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述的缓冲液为pH7.0的磷酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述的海藻酸钠溶液为质量分数1.5％～3.5％的海藻酸钠溶液。
5.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述的脂肪酶液为400～1200U/mL的脂肪酶液。
6.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，所述的固定是在4℃固定10～60min。
7.根据权利要求1～6任一项所述的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于，具体步骤为：将海藻酸钠和脂肪酶分别溶于pH 7.0的磷酸缓冲液中，配制成质量分数2.5％的海藻酸钠溶液和400U/mL的脂肪酶液，将海藻酸钠溶液和脂肪酶液按体积比1:1的比例混合均匀，得到海藻酸钠/脂肪酶混合液，然后将海藻酸钠/脂肪酶混合液用注射器滴加到质量分数5％的氯化钙溶液中，形成凝胶小球后置于4℃固定20min，过滤后将凝胶小球加入到体积分数0.35％的乙二醇缩水甘油醚水溶液中，25℃下震荡交联1h，经洗涤、抽滤后得到固定化脂肪酶。
8.一种按照权利要求1～6任一项所述的固定化脂肪酶的制备方法制备得到的固定化脂肪酶。
9.一种按照权利要求7所述的固定化脂肪酶的制备方法制备得到的固定化脂肪酶。
CN201711209172.XA 2017-11-27 2017-11-27 一种固定化脂肪酶及其制备方法 Pending CN107858343A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711209172.XA CN107858343A (zh) 2017-11-27 2017-11-27 一种固定化脂肪酶及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711209172.XA CN107858343A (zh) 2017-11-27 2017-11-27 一种固定化脂肪酶及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107858343A true CN107858343A (zh) 2018-03-30

Family

ID=61702929

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711209172.XA Pending CN107858343A (zh) 2017-11-27 2017-11-27 一种固定化脂肪酶及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107858343A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112845566A (zh) * 2020-12-31 2021-05-28 浙江工业大学 一种利用脂肪酶修复邻苯二甲酸酯污染土壤的方法
CN112888782A (zh) * 2021-01-13 2021-06-01 安徽金禾实业股份有限公司 液体脂肪酶的固定化方法及蔗糖-6-乙酸酯的制备方法
CN112921027A (zh) * 2021-04-12 2021-06-08 河南城建学院 利用固定化提高纳豆激酶热稳定性的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106435815A (zh) * 2016-09-20 2017-02-22 大连工业大学 化学交联改性丝素蛋白/海藻酸盐复合纤维及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106435815A (zh) * 2016-09-20 2017-02-22 大连工业大学 化学交联改性丝素蛋白/海藻酸盐复合纤维及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王静 等: "海藻酸钠包埋法固定L-阿拉伯糖异构酶的研究", 《食品研究与开发》 *
祝国富 等: "化学交联改性丝素蛋白／海藻酸钠纤维的制备与性能", 《复合材料学报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112845566A (zh) * 2020-12-31 2021-05-28 浙江工业大学 一种利用脂肪酶修复邻苯二甲酸酯污染土壤的方法
CN112888782A (zh) * 2021-01-13 2021-06-01 安徽金禾实业股份有限公司 液体脂肪酶的固定化方法及蔗糖-6-乙酸酯的制备方法
WO2022151024A1 (zh) * 2021-01-13 2022-07-21 安徽金禾实业股份有限公司 液体脂肪酶的固定化方法及蔗糖-6-乙酸酯的制备方法
CN112921027A (zh) * 2021-04-12 2021-06-08 河南城建学院 利用固定化提高纳豆激酶热稳定性的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Khoo et al. Recent advances in downstream processing of microalgae lipid recovery for biofuel production
Prakash et al. Immobilization of a thermostable-amylase on agarose and agar matrices and its application in starch stain removal
CN107858343A (zh) 一种固定化脂肪酶及其制备方法
To et al. Low cost ionic liquid–water mixtures for effective extraction of carbohydrate and lipid from algae
CN108130319A (zh) 一种固定化脂肪酶及其制备方法
Ahmed et al. Biochemical studies on immobilized fungal β-glucosidase
Guo et al. A convenient test for lipase activity in aqueous-based solutions
CN105524910A (zh) 用于酶固定化的改性壳聚糖微球、其制备方法及应用
CN105693883A (zh) 用于酶固定化的壳聚糖微球、其制备方法及应用
Hosseini et al. Enzymatic hydrolysis of cellulose part II: Population balance modelling of hydrolysis by exoglucanase and universal kinetic model
Pal et al. A novel mixing strategy for maximizing yields of glucose and reducing sugar in enzymatic hydrolysis of cellulose
CN104911222B (zh) 一种离子液体体系下无载体固定化脂肪酶催化制备生物柴油的方法
CN107312767B (zh) 一种组合固定化β-葡萄糖苷酶颗粒及其制备方法
CN109182324B (zh) 一种壳-核结构固定化酶及其制备方法和应用
CN109880856A (zh) 一种开放式生产微藻油脂的方法
CN105274157A (zh) 一种静态乳液法固定化脂肪酶生产生物柴油的方法
CN109609482A (zh) 一种地衣芽孢杆菌凝乳酶的制备方法
CN101260396A (zh) 以丝瓜络为载体的固定化脂肪酶及其制备方法
CN104818267B (zh) 一种高效催化制备生物柴油用新型纤维生物基固定化全细胞催化剂及其制备方法
CN113999839A (zh) 一种微藻的固定化方法及其应用
CN101134904B (zh) 一种制备生物柴油的新工艺
Hasan et al. Immobilization of Candida rugosa lipase in PVA-alginate-sulfate beads for waste cooking oil treatment
Shen et al. Synthesis of 2-ethyl hexanol fatty acid esters in a packed bed bioreactor using a lipase immobilized on a textile membrane
CN103484446A (zh) 化学改性纤维类固定化载体及其制备方法和用途
Shokrkar Model-based evaluation of enzymatic hydrolysis of microalgal cellulose and different cellulosic materials

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: No.1119 Haibin Road, Nansha District, Guangzhou City, Guangdong Province

Applicant after: SOUTH CHINA SEA INSTITUTE OF OCEANOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

Address before: 510301 No. 164 West Xingang Road, Guangdong, Guangzhou

Applicant before: SOUTH CHINA SEA INSTITUTE OF OCEANOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180330