CN108812639A - 一种细胞外基质冻干粉 - Google Patents

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耿梦梦
姜玉峰
程飚
苏玉天
刘江辉
陈妮丹
陈大鹏
邓小敏
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Abstract

本发明公开了一种细胞外基质冻干粉，其由以下方法制备得到：(1)取动物组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；(2)细胞外基质粗提物经过提取获得水解物，水解物进行离心或过滤，上清液或滤液通过透析法、有机沉淀法或者盐沉淀法获得细胞外基质提取物；(3)将细胞外基质提取物进行过滤或离心，滤液或上清液与单糖或二糖混合后冷冻干燥，即得所述细胞外基质冻干粉。本发明提供的细胞外基质冻干粉保留了动物组织中多型胶原、蛋白多糖和生长因子等多种活性物质，具有多种生物学活性，生物相容性好，可促进组织再生，具有抗氧化、修复、抗皱等优点，也可以诱导细胞的增殖、迁移和分化，还可作为结构支撑，具备填充功能。

Description

一种细胞外基质冻干粉
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种细胞外基质冻干粉。
背景技术
细胞外基质是由动物细胞合成并分泌到细胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，组成可以分为三大类：(1)糖胺聚糖、蛋白聚糖，他们能够形成水性的胶状物；(2)结构蛋白，如胶原和弹性蛋白，他们赋予细胞外基质一定的强度和韧性；(3)黏着蛋白，又称纤维连接蛋白，如纤粘蛋白和层粘连蛋白，能够促使细胞同基质结合。
氨基聚糖依据组成糖基、连接方式、硫酸化程度及位置的不同可以分为六种，即透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸角质素。其中透明质酸，是一种酸性粘多糖，其以独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节、调节血管壁的通透性、调节蛋白质、水电解质扩散及运转、促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿型最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，尤其是在人体皮肤中含有大量的透明质酸，改善皮肤营养代谢，使皮肤柔嫩、光滑、去皱、增加弹性、防止衰老，在保湿的同时又是良好的头皮吸收促进剂。因此，透明质酸在现在的美容市场的明星产品。蛋白聚糖是氨基聚糖与核心蛋白质的共价结合物。许多蛋白聚糖单体常以非共价键与透明质酸形成多聚体。核心蛋白质的N端序列与CD44分子结合透明质酸的结构域具有同源性，属于hyaladherin族。蛋白聚糖多聚体的分子量可达108KD以上。其体积可超过细菌。如构成软骨的aggrecan，其GAG主要是硫酸软骨素，但还有硫酸角质素。其含量不足或代谢障碍可引起长骨发育不良，四肢短小。
细胞外基质中的胶原，遍布于体内各种器官和组织，是细胞外基质中的框架结构，目前已发现至少19型胶原，除了常见的Ⅰ、Ⅲ型外，还包括Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅹ型等。胶原在细胞外基质中形成半晶体的纤维，给细胞提供抗张力和弹性，并在细胞的迁移和发育中起作用。弹性蛋白是由二种类型短肽段交替排列构成。一种是疏水短肽赋予分子以弹性；另一种短肽为富丙氨酸及赖氨酸残疾的α螺旋，负责在相邻分子之间形成交联。弹性蛋白的氨基酸组成似胶原，也富于甘氨酸及脯氨酸，但很少含羟脯氨酸，不含羟赖氨酸，没有胶原特有的Gly-X-Y序列，不形成规则的三股螺旋结构。在弹性蛋白的外围包绕着一层由微原纤维构成的壳。微原纤维是由一些糖蛋白构成的，其中一种较大的糖蛋白是fibrilin，为保持弹性纤维的完整性所必需。在发育中的弹性组织内，糖蛋白微原纤维常先于弹性蛋白出现，是弹性蛋白附着的框架，对于弹性蛋白分子组装成弹性纤维具有组织作用。老年组织中弹性蛋白的生成减少，降解增强，以致组织失去弹性。
纤粘连蛋白是一种大型的糖蛋白，可将细胞连接到细胞外基质上。大量的研究和临床应用已证明，纤连蛋白在伤口的修复和愈合中起着十分重要的作用，是促进伤口愈合的关键物质。尤其是在烧伤、创伤、败血症、感染等方面具有显著的治疗效果。我国解放军第304医院的实验结果也证实了，糖尿病并发的溃疡创面纤连蛋白含量减少是造成慢性难愈合创面长期不愈的原因之一。层粘连蛋白也是一种大型的糖蛋白，与Ⅳ型胶原一起基膜，是胚胎发育中出现最早的细胞外基质成分。能够决定细胞的极性，影响细胞的代谢、存活、迁移、增殖和分化，还能促进神经生长。
细胞外基质不只具有连接、支持、保水、抗压及保护等物理学作用，而且对细胞的基本声明活性发挥全方位的生物学作用。包括，影响细胞的存活、生长与死亡；影响细胞分化、增殖、黏附、形态发生和表型表达等生物学过程；决定细胞的形状；控制细胞的分化；参与细胞的迁移。
由于细胞外基质含有多种活性成分，可广泛应用于医药、美容和再生医学等多个领域。但是细胞外基质中的活性成分，尤其是胶原等大分子物质，对于生物活性的保存具有很高的要求。目前市面上暂无相关的细胞外基质产品。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种细胞外基质冻干粉，其含有多种活性成分，加水后能够快速溶解并恢复原有细胞外基质的理化特性和生物活性，稳定性高，方便运输和长期保存。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种细胞外基质冻干粉，制备方法包括以下步骤：
(1)取动物组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)步骤(1)获得的细胞外基质粗提物经过酶提取、尿素提取、酸提取或水提取后，离心取上清液或者过滤取滤液，然后通过透析法、有机沉淀法或者盐沉淀法获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(2)获得的细胞外基质提取物进行过滤或者离心，滤液或者上清液与单糖或二糖混合，混合液先于-20℃中冷冻3～6h，然后于-40～-80℃中冷冻干燥12～72h，即得所述细胞外基质冻干粉。
优选地，所述步骤(1)中动物组织选自小肠、神经、膀胱、皮肤、心包、肾脏、胎盘、脂肪或肌肉；
所述动物组织来源于猪、牛或羊。
优选地，所述步骤(2)中酶提取的方法为：将浓度为0.01～1％的酶与细胞外基质粗提物按照重量比为1:(5～20)混匀，然后震荡12～36h。
更优选地，所述步骤(2)中酶提取的方法为：将浓度为0.1％的酶与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，然后震荡24h。
优选地，所述酶选自胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和胰酶中的至少一种。
优选地，所述步骤(2)中尿素提取的方法为：将尿素与tris-HCl、EDTA和盐酸胍中的至少一种混合，使混合物中尿素、tris-HCl、EDTA、盐酸胍的浓度分别为1～8mol/L、0.05～1mol/L、0.001～0.1mol/L、0.1～2mol/L，所述混合物与细胞外基质粗提物按照重量比为1:(5～20)混匀，然后震荡6～24h。
更优选地，所述步骤(2)中尿素提取的方法为：将尿素与tris-HCl、EDTA和盐酸胍中的至少一种混合，使混合物中尿素、tris-HCl、EDTA、盐酸胍的浓度分别为2mol/L、0.1mol/L、0.01mol/L、1mol/L，所述混合物与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，然后震荡12h。
优选地，所述步骤(2)中酸提取的方法为：将酸与细胞外基质粗提物按照重量比为1:(5～20)混匀，使混合物最终的pH值为1～3，然后震荡6～24h。
更优选地，所述步骤(2)中酸提取的方法为：将酸与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，使混合物最终的pH值为2，然后震荡12h。
优选地，所述酸选自盐酸、硫酸、醋酸、乳酸和乙醇酸中的至少一种。
优选地，所述步骤(2)中水提取的方法为：将pH值为4～7的磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液中的至少一种与细胞外基质粗提物按照重量比为1:(5～20)混匀，然后震荡6～24h。
更优选地，所述步骤(2)中水提取的方法为：将pH值为6.5的磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液中的至少一种与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，然后震荡12h。
优选地，所述步骤(2)中透析法为：所述上清液或滤液使用截留分子量为1000～50000Da的透析袋，流水透析8～24h，至电导率为1.5um/s以下即可；
所述有机沉淀法为：向所述上清液或滤液中加入乙醇、异丙醇、丙醇和丙二醇中的至少一种，使其终浓度为60～90％，搅拌均匀即可；
所述盐沉淀法为：向所述上清液或滤液中加入氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙和硫酸镁中的至少一种，使其终浓度为0.5～4mol/L，搅拌均匀即可。
优选地，所述步骤(3)中滤液或上清液与单糖或二糖混合后，混合液中单糖或二糖的质量浓度为0.2～10％。
优选地，所述单糖或二糖选自甘露醇、海藻糖、葡萄糖、乳糖、果糖或蔗糖。
优选地，所述步骤(3)中混合液先于-20℃中冷冻4h，然后于-55℃中冷冻干燥60h，即得所述细胞外基质冻干粉。
由于细胞外基质含有多种活性成分，尤其是胶原等大分子物质，对于生物活性的保存具有很高的要求，因此，细胞外基质产品必须能保持细胞外基质的理化特性和生物活性。本申请发明人发现，冻干法能有效的防止细胞外基质理化及生物特性的改变，对其结构和特征的损伤较小，蛋白质不会变性和失去活性；其次，冻干粉在干燥后形态疏松，颜色基本不发生改变，加水后能够快速溶解并恢复原有水溶液的理化特性和生物活性；第三，细胞外基质经冻干后水分含量非常低，其稳定性提高，受污染的机会减少，方便运输和长期保存。
本发明提供的细胞外基质冻干粉保留了动物组织中多型胶原、蛋白多糖、生长因子等多种活性物质，具有多种生物学活性，生物相容性好，可促进组织再生，具有抗氧化、修复、抗皱等优点，也可以诱导细胞的增殖、迁移和分化，还可作为结构支撑，具备填充功能。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：(1)本发明提供了一种细胞外基质冻干粉，其含有多型胶原、蛋白聚糖、生长因子等多种生物活性成分，具有多种生物功效；(2)本发明细胞外基质冻干粉通过冻干法制备得到，有效的防止细胞外基质理化及生物特性的改变，对其结构和特征的损伤较小，蛋白质不会变性和失去活性；(3)本发明提供的细胞外基质冻干粉形态疏松，颜色基本不发生改变，加水后能够快速溶解并恢复原有水溶液的理化特性和生物活性；(4)本发明提供的细胞外基质冻干粉水分含量非常低，其稳定性提高，受污染的机会减少，方便运输和长期保存。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取猪小肠组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将浓度为0.01％的酸性蛋白酶与细胞外基质粗提物按照重量比为1:20混匀，震荡36h后，离心取上清液，使用截留分子量为50000Da的透析袋，流水透析24h，至电导率为1.5um/s，获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物使用0.8μm微孔滤膜进行过滤，滤液与甘露醇混合，使混合液中甘露醇的浓度为10％，混合液先于-20℃中冷冻6h，然后于-40℃中冷冻干燥72h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例2
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取猪心包组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将浓度为1％的胃蛋白酶与细胞外基质粗提物按照重量比为1:5混匀，震荡12h后，过滤取滤液，向滤液中加入乙醇，使其终浓度为60％，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物进行离心，上清液与葡萄糖混合，使混合液中葡萄糖的浓度为0.2％，混合液先于-20℃中冷冻3h，然后于-80℃中冷冻干燥12h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例3
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取牛膀胱组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将浓度为0.1％的中性蛋白酶与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，震荡24h后，离心取上清液，向上清液中加入氯化钠，使其终浓度为0.5mol/L，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物使用0.8μm微孔滤膜进行过滤，滤液与海藻糖混合，使混合液中海藻糖的浓度为1％，混合液先于-20℃中冷冻4h，然后于-55℃中冷冻干燥60h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例4
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取羊神经组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将尿素与tris-HCl、EDTA和盐酸胍混合，使混合物中尿素、tris-HCl、EDTA、盐酸胍的浓度分别为1mol/L、1mol/L、0.1mol/L、0.1mol/L，所述混合物与细胞外基质粗提物按照重量比为1:5混匀，震荡24h后，离心取上清液，向上清液中加入异丙醇，使其终浓度为90％，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物使用0.8μm微孔滤膜进行过滤，滤液与葡萄糖混合，使混合液中葡萄糖的浓度为2.5％，混合液先于-20℃中冷冻4h，然后于-80℃中冷冻干燥20h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例5
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取猪皮肤组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将尿素与tris-HCl、EDTA和盐酸胍混合，使混合物中尿素、tris-HCl、EDTA、盐酸胍的浓度分别为8mol/L、0.05mol/L、0.001mol/L、2mol/L，所述混合物与细胞外基质粗提物按照重量比为1:20混匀，震荡6h后，过滤取滤液，使用截留分子量为8000Da的透析袋，流水透析8h，至电导率为1.3um/s，获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物进行过滤，滤液与乳糖混合，使混合液中乳糖的浓度为4％，混合液先于-20℃中冷冻6h，然后于-56℃中冷冻干燥70h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例6
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取猪脂肪组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将尿素与tris-HCl、EDTA和盐酸胍混合，使混合物中尿素、tris-HCl、EDTA、盐酸胍的浓度分别为2mol/L、0.1mol/L、0.01mol/L、1mol/L，所述混合物与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，震荡12h后，过滤取滤液，向滤液中加入氯化钾，使其终浓度为4mol/L，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物进行离心，上清液与果糖混合，使混合液中果糖的浓度为5％，混合液先于-20℃中冷冻4.5h，然后于-60℃中冷冻干燥60h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例7
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取猪心包组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将盐酸与细胞外基质粗提物按照重量比为1:5混匀，使混合物最终的pH值为1，震荡24h后，离心取上清液，向上清液中加入硫酸钠，使其终浓度为2mol/L，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物进行使用0.8μm微孔滤膜过滤，滤液与海藻糖混合，使混合液中海藻糖的浓度为10％，混合液先于-20℃中冷冻3h，然后于-58℃中冷冻干燥55h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例8
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取牛膀胱组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将醋酸和盐酸胍与细胞外基质粗提物按照重量比为1:20混匀，使混合物最终的pH值为3，震荡6h后，离心取上清液，使用截留分子量为1000Da的透析袋，流水透析15h，至电导率为1.2um/s，获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物使用0.8μm微孔滤膜进行过滤，滤液与果糖混合，使混合液中果糖的浓度为6.5％，混合液先于-20℃中冷冻5h，然后于-75℃中冷冻干燥12h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例9
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取猪胎盘组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将盐酸和醋酸与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，使混合物最终的pH值为2，震荡12h后，过滤取滤液，向滤液中加入丙醇，使其终浓度为70％，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物进行离心，上清液与葡萄糖混合，使混合液中葡萄糖的浓度为7％，混合液先于-20℃中冷冻4h，然后于-48℃中冷冻干燥30h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例10
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取羊肌肉组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将pH值均为4的磷酸盐缓冲液和柠檬酸缓冲液与细胞外基质粗提物按照重量比为1:20混匀，震荡24h后，离心取上清液，使用截留分子量为30000Da的透析袋，流水透析10h，至电导率为1um/s，获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物使用0.8μm微孔滤膜进行过滤，滤液与甘露醇混合，使混合液中甘露醇的浓度为8.5％，混合液先于-20℃中冷冻6h，然后于-52℃中冷冻干燥25h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例11
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取牛心包组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将pH值均为7的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液与细胞外基质粗提物按照重量比为1:5混匀，震荡6h后，离心取上清液，向上清液中加入氯化钠和硫酸镁，使其终浓度为3mol/L，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物进行离心，上清液与蔗糖混合，使混合液中蔗糖的浓度为0.5％，混合液先于-20℃中冷冻3h，然后于-45℃中冷冻干燥72h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例12
本发明提供的细胞外基质冻干粉的一种实施例，所述细胞外基质冻干粉制备方法包括以下步骤：
(1)取羊神经组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)将pH值均为6.5的磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液和醋酸盐缓冲液与细胞外基质粗提物按照重量比为1:10混匀，震荡12h后，离心取上清液，向上清液中加入丙二醇，使其终浓度为80％，搅拌均匀，静置沉淀后获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(3)获得的细胞外基质提取物使用0.8μm微孔滤膜进行过滤，滤液与甘露醇混合，使混合液中甘露醇的浓度为9％，混合液先于-20℃中冷冻5h，然后于-40℃中冷冻干燥70h，即得所述细胞外基质冻干粉。
实施例13
本实施例以实施例1中的细胞外基质冻干粉为例，检测本发明细胞外基质冻干粉中的部分活性成分。
1、胶原检测
将细胞外基质冻干粉用生理盐水配制成浓度为1mg/mL的溶液。采用ELISA法检测溶液中总胶原和具有代表性的Ⅳ型胶原的含量。结果显示总胶原含量为0.94mg/mL，Ⅳ型胶原的含量为0.35mg/mL。
2、透明质酸检测
将细胞外基质冻干粉用生理盐水配制成浓度为1mg/mL的溶液。采用ELISA法检测溶液中透明质酸的含量。结果显示透明质酸的含量为0.24mg/mL。
3、生长因子检测
将细胞外基质冻干粉用生理盐水配制成浓度为1mg/mL的溶液。采用ELISA法检测浸提液中碱性生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量，结果显示，bFGF含量为5.90±4.01pg/mg，VEGF含量为70.14±23.37ng/mg，TGF-β含量为11.93±4.31pg/mg，TNF-α含量为9.11±5.62pg/mg。
由上述结果可知，本发明细胞外基质冻干粉中至少包含胶原、Ⅳ型胶原、透明质酸、bFGF、VEGF、TGF-β和TNF-α等多种活性物质，具有多种生物学活性。
实施例14
本实施例以实施例3制备得到的细胞外基质冻干粉为例，研究本发明细胞外基质冻干粉的补水保湿、修复脱敏和祛斑抗衰功效。
所述细胞外基质冻干粉的使用方法：按照一定的浓度将溶媒注入实施例3制备的冻干粉中，溶解后均匀涂抹于面部。
所述细胞外基质冻干粉的补水保湿、修复脱敏和祛斑抗衰效果的检测方法：
1、补水保湿
按照2mg/mL浓度将纯水注入本发明细胞外基质冻干粉中，溶解后均匀涂抹于面部。受试部位测试基础值前2-3天不能使用化妆品或外用药品，1-3小时不能接触水。试验前，受试者使用香皂清洁双手前臂内侧，用干的面巾纸擦拭干净。受试者双手前臂内侧做好测试区域标记，包括空白对照区(b)和样品使用区(s)。试验区域面积3*3cm2，每个区域之间间隔2cm。正式测试前在恒温恒湿(温度：21±0.5℃；湿度：50％±2％)的房间内静坐30min。
测试基础值后，连续天，每天两次在样品使用区均匀涂抹细胞外基质冻干粉溶液。空白对照区不做任何处理。使用样品1、7、14、28、42天后，分别使用皮肤角质层水分量测试仪Corneometer和皮肤水分流失测试仪Tewameter测试两个区域皮肤角质层水分含量(CAP)和皮肤经表皮失水率(TEWL)。结果如表1所示。
表1皮肤角质层水分含量和经表皮失水率
区域-时间 CAP △CAP TEWL △TEWL
b-0 31.71 - 8.23 -
s-0 32.18 - 7.98 -
b-1 32.09 0.38 8.97 0.74
s-1 37.86 5.68 7.23 -0.75
b-7 31.25 -0.46 9.12 0.89
s-7 42.85 10.67 7.05 -0.93
b-14 32.34 0.63 9.23 1.00
s-14 45.89 13.71 7.13 -0.85
b-28 31.68 -0.03 8.89 0.56
s-28 49.83 17.65 7.36 -0.62
b-42 32.01 0.30 8.90 0.67
s-42 53.16 20.98 7.58 -0.4
保湿是通过防止皮肤内水分的丢失和吸收外界环境的水分来达到保持皮肤内含有一定水分的目的。通过上述实验检测可以得出，志愿者在使用细胞外基质冻干粉一段时间后，可以提高皮肤的含水量，减少皮肤内的水分经表皮丢失，起到补水保湿的效果。
2、修复脱敏
培养人角质细胞，由UV照射引发炎症后，实验组加入本发明细胞外基质冻干粉，加入量为2mg/mL；对照组加入相同剂量的地塞米松。培养一定的时间后，采用ELISA法测试细胞上清液中白细胞介素-1α、白细胞介素-8的含量，通过和对照组比较来判断细胞外基质冻干粉是否有促进皮肤的脱敏。
培养人成纤维细胞，由UV照射引发炎症后，实验组加入细胞外基质冻干粉，加入量为2mg/mL；对照组加入相同剂量的胶原。培养一定的时间后，采用ELISA法测试细胞上清液中胶原蛋白的含量，通过和对照组比较来判断细胞外基质冻干粉是否有促进皮肤的修复。
经检测，人角质细胞受到UV照射后，本发明细胞外基质冻干粉能使白细胞介素-1α和白细胞介素-8的释放量下降73％和85％。人成纤维细胞受到UV照射后，与对照组相比，本发明细胞外基质冻干粉能使胶原蛋白的生成量提高78％。说明本发明的细胞外基质冻干粉具有促进受损皮肤进行修复和脱敏的功效。
3、祛斑
酪氨酸酶是黑色素合成途径中的限速酶，主要通过影响酪氨酸转化成多巴，多巴氧化成为多巴醌来影响黑色素的生成。通过计算细胞外基质冻干粉对酪氨酸酶的抑制率与市面上常用的熊果苷和曲酸进行对比，来判断是否有祛斑美白的效果。
本实施例研究本发明细胞外基质冻干粉对酪氨酸酶的抑制率的实验方法为：取0.1mL浓度为2mg/mL的细胞外基质冻干粉溶液和相同浓度的丙硫氧嘧啶作为对照组，再同时加入1mL浓度为1.5mmol/L的左旋多巴和1.8mL的PBS缓冲液，在25℃水浴锅中水浴10min。再加入0.1mL酪氨酸酶溶液，于475nm波长下测定吸光度值，读取孵育0.5min和1.0min的吸光度，按照如下公式计算酪氨酸酶的抑制率。
抑制率(％)＝(A-B)/A*100
式中：
A——空白对照组0.5min和1min吸光度值之差；
B——实验组或阳性对照组0.5min和1min吸光度值之差。通过实验得出，本发明细胞外基质冻干粉对酪氨酸酶的抑制率为79.5％，优于熊果苷和曲酸，具体的结果见表2。说明本发明细胞外基质冻干粉具有祛斑美白的功效。
表2三种物质对酪氨酸酶的抑制率
4、抗衰老
皮肤中的弹性纤维由弹性蛋白和微原纤维构成，分布于真皮及皮下组织，使皮肤具有弹性。弹性蛋白酶是胰凝乳蛋白酶家族中的一员，会降解弹性蛋白，造成表皮中连接组织的损失，从而导致皮肤衰老，皱纹和光老化的产生。通过测定细胞外基质冻干粉对弹性蛋白酶的抑制率与空白对照组进行对比，来判断是否有抗衰的效果。
本实施例研究本发明细胞外基质冻干粉对弹性蛋白酶的抑制率的实验方法为：将100μL的0.2mol/L的tris-HCl缓冲液，25μL的10mmol/L的N-甲氧基丁二酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸-4-硝基苯胺和50μL的2mg/mL的细胞外基质冻干粉混匀，在25℃条件下孵育15min；然后加入25μL的0.3U/mL的弹性蛋白酶继续孵育15min。然后在410nm条件下检测OD值，并通过下列公式计算弹性蛋白酶抑制率：
抑制率(％)＝对照组OD值-实验组OD值/对照组OD值*100。
通过实验得出，细胞外基质冻干粉对弹性蛋白酶的抑制率为68.2％。说明本发明细胞外基质冻干粉具有抗衰的功效。
由上述实验结果可知，本发明所述细胞外基质冻干粉能有效解决干燥、色斑、暗疮、皱纹、敏感等多种肌肤问题，具有很好的补水保湿、修复脱敏和祛斑抗衰功效。本发明其他实施例制备得到的细胞外基质冻干粉的补水保湿、修复脱敏和祛斑抗衰功效与本实施例类似，具体数据省略。
实施例15
本实施例以实施例6制备得到的细胞外基质冻干粉为例，研究本发明所述细胞外基质冻干粉促进动物细胞生长的效果。
(一)实验方法
于55cm2无菌培养皿中常规培养小鼠成纤维细胞3T3，离心后重悬于培养基中，以5*104/mL的密度每孔100μL接种于96孔板，细胞培养板外周加入100μLPBS。置于37℃、湿度90％、5％CO2浓度的培养箱孵育24±1h。
培养24h后，去除上清液，用不含胎牛血清的DMEM培养基配制20μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL和2000μg/mL的细胞外基质冻干粉溶液作为实验组，空白对照组仅含培养基，阳性对照组为含10％胎牛血清的DMEM培养基。每个浓度设置6个平行，每孔添加100μL受试物、置于37℃、湿度90％、5％CO2浓度的培养箱孵育48±1h。
48±1h孵育结束后，每孔加入20μLMTT溶液，于37℃避光孵育3h，弃液，每孔100μL加入二甲基亚砜(DMSO)摇匀。在酶标仪上测定570nm波长下的吸光度(OD)值。
(二)实验结果
实验结果如表3所示：
表3细胞外基质冻干粉及对照组OD值
由上述实验结果可知，在无血清DMEM培养基中添加本发明细胞外基质冻干粉，细胞能够正常生长，说明本发明细胞外基质冻干粉可代替胎牛血清用于培养细胞。本发明其他实施例制备得到的细胞外基质冻干粉对动物细胞的培养效果与本实施例类似，具体数据省略。
实施例16
本实施例以实施例8制备得到的细胞外基质冻干粉为例，研究本发明所述细胞外基质冻干粉治疗创面修复的效果。
(一)实验方法
选30只大鼠，每只四个创面，每只大鼠的左上和右上(靠经头部的)创面用于试验组；左下和右下(靠经尾部的)创面用于对照组；试验组，创面外敷细胞外基质冻干粉和硅胶膜外层覆盖；对照组，创面用硅胶膜覆盖，外层用凡士林纱布覆盖，不做其他治疗。各组创面于制备当天均用消毒纱布包扎固定；于创面形成后第2天开始，按分组设计创面直接外敷相应材料于创面，再用无菌凡士林纱布覆盖，纱布四角缝1针固定。空白对照组只用凡士林纱布覆盖。
(二)实验结果
伤后第3天试验组大鼠创面即开始收缩，此后创面缩小进程较快，至伤后第21天创面基本愈合。对照组大鼠则不同，术后第3天有些个体出现创面增大或收缩不明显，而随后的愈合过程亦较为缓慢，至伤后第28天后基本愈合。
统计各时间点两组大鼠创面愈合率，结果见表4，在各个时间点上，试验组创面愈合平均面积明显大于对照组。
表4时间点动物创面愈合率的比较
组别 治疗后第3天 第7天 第14天 第21天 第28天
实验组 12.00±2.69 62.00±8.25* 90.00±2.27* 100.00±0* 100.00±0
对照组 10.00±3.84 40.00±7.59 78.00±4.38 89.00±3.54 98.00±2.67
注：与对照组比较：*P＜0.05。
由上述实验结果可知，本发明所述细胞外基质冻干粉能有效促进创面修复愈合。本发明其他实施例制备得到的细胞外基质冻干粉促进创面修复愈合的效果与本实施例类似，具体数据省略。
实施例17
本实施例以实施例9制备得到的细胞外基质冻干粉为例，研究本发明所述细胞外基质冻干粉对眼部的修复效果。
将所述细胞外基质冻干粉按以下配方制备得到眼部修复精华：细胞外基质冻干粉0.3g、六胜肽0.1g、海藻糖3.0g、维生素E1.5g、尿囊素2.5g、甘油5.0g和蒸馏水37.6g。
对照组眼部精华配方为：六胜肽0.3g、海藻糖3.0g、维生素E1.6g、尿囊素2.5g、甘油5.0g和蒸馏水37.6g，即不含本发明所述细胞外基质冻干粉。
(一)检测方法
选取60名女性，随机分成A、B和C三组，A组试用含有本发明细胞外基质冻干粉的眼部精华、B组试用不含本发明细胞外基质冻干粉的对照组眼部精华，C组不使用任何眼部修复产品。试验人员每天早晚将适量眼部精华均匀涂抹在眼部周围，连续涂抹60天。并对使用效果进行观察，结果见表5。
(二)检测结果
表5细胞外基质冻干粉眼部修复结果
项目 A组 B组 C组
滋润保湿 90％ 75％ 0
淡化细纹 83％ 68％ 0
淡化黑眼圈 80％ 62％ 0
由上述实验结果可知，本发明所述细胞外基质冻干粉制备的修复精华能够通过滋润保湿、淡化细纹和淡化黑眼圈来有效进行眼部修复。本发明其他实施例制备得到的细胞外基质冻干粉对眼部的修复效果与本实施例类似，具体数据省略。
实施例18
本实施例提供一种下巴填充材料，所述下巴填充材料含有实施例11制备得到的细胞外基质冻干粉，配方如下：将细胞外基质冻干粉与自体富血小板血浆按照1g:3mL混合均匀作为下巴填充材料。
实施例19
本实施例提供一种美白针剂，所述美白针剂含有以实施例12制备得到的细胞外基质冻干粉细胞外基质冻干粉，配方如下：细胞外基质冻干粉0.9g、小分子胶原多肽0.2g、熊果苷0.2g、海藻糖1.5g、维生素E0.2g、尿囊素1.0g和甘油6.0g，用90％的注射用水溶解，磁力搅拌至完全溶解；向配好的溶液中加入0.1％的药用活性炭，室温搅拌20分钟，用0.22μm滤膜过滤两次，灌装后进行冷冻干燥冻干，即得所述美白针剂。
同时对所述的美白针剂的美白效果进行检测，具体如下：
(一)检测方法
以自愿为原则，选择有美白淡斑需求的客户，共40例，分为A和B两组，A组使用含有本发明所述细胞外基质冻干粉的美白针剂，B组使用不含细胞外基质冻干粉，其他成分及配制方法均相同的美白针剂。将美白针剂用注射用水溶解后，均匀涂抹于面部，指腹按摩促进吸收。早晚各一次，连续涂抹60天。
(二)检测结果
检测结果如表6所示：
表6皮肤美白评价结果
由上述实验结果可知，本发明所述细胞外基质冻干粉制备的美白针剂能有效对肌肤进行美白，且无副作用。本发明其他实施例制备得到的细胞外基质冻干粉制备的美白针剂的美白效果与本实施例类似，具体数据省略。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种细胞外基质冻干粉，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
(1)取动物组织，脱脂、脱细胞后清洗，得到细胞外基质粗提物；
(2)步骤(1)获得的细胞外基质粗提物经过酶提取、尿素提取、酸提取或水提取后，离心取上清液或者过滤取滤液，然后通过透析法、有机沉淀法或者盐沉淀法获得细胞外基质提取物；
(3)将步骤(2)获得的细胞外基质提取物进行过滤或者离心，滤液或者上清液与单糖或二糖混合，混合液先于-20℃中冷冻3～6h，然后于-40～-80℃中冷冻干燥12～72h，即得所述细胞外基质冻干粉。
2.根据权利要求1所述的细胞外基质冻干粉，其特征在于，所述步骤(1)中动物组织选自小肠、神经、膀胱、皮肤、心包、肾脏、胎盘、脂肪或肌肉；
所述动物组织来源于猪、牛或羊。
3.根据权利要求1所述的细胞外基质冻干粉，其特征在于，所述步骤(2)中酶提取的方法为：将浓度为0.01～1％的酶与细胞外基质粗提物按照重量比为1:(5～20)混匀，然后震荡12～36h。
4.根据权利要求3所述的细胞外基质冻干粉，其特征在于，所述酶选自胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和胰酶中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的细胞外基质冻干粉，其特征在于，所述步骤(2)中尿素提取的方法为：将尿素与tris-HCl、EDTA和盐酸胍中的至少一种混合，使混合物中尿素、tris-HCl、EDTA、盐酸胍的浓度分别为1～8mol/L、0.05～1mol/L、0.001～0.1mol/L、0.1～2mol/L，所述混合物与细胞外基质粗提物按照重量比为1:(5～20)混匀，然后震荡6～24h。
6.根据权利要求1所述的细胞外基质冻干粉，其特征在于，所述步骤(2)中酸提取的方法为：将酸与细胞外基质粗提物按照重量比为1:(5～20)混匀，使混合物最终的pH值为1～3，然后震荡6～24h。
7.根据权利要求6所述的细胞外基质冻干粉，其特征在于，所述酸选自盐酸、硫酸、醋酸、乳酸和乙醇酸中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的细胞外基质冻干粉，其特征在于，所述步骤(2)中水提取的方法为：将pH值为4～7的磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液中的至少一种与细胞外基质粗提物按照重量比为1:(5～20)混匀，然后震荡6～24h。
9.根据权利要求1所述的细胞外基质冻干粉，其特征在于，所述步骤(2)中透析法为：所述上清液或滤液使用截留分子量为1000～50000Da的透析袋，流水透析8～24h，至电导率为1.5um/s以下即可；
所述有机沉淀法为：向所述上清液或滤液中加入乙醇、异丙醇、丙醇和丙二醇中的至少一种，使其终浓度为60～90％，搅拌均匀即可；
所述盐沉淀法为：向所述上清液或滤液中加入氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙和硫酸镁中的至少一种，使其终浓度为0.5～4mol/L，搅拌均匀即可。
10.根据权利要求1所述的细胞外基质冻干粉，其特征在于，所述步骤(3)中滤液或者上清液与单糖或二糖混合后，混合液中单糖或二糖的质量浓度为0.2～10％；所述混合液先于-20℃中冷冻4h，然后于-55℃中冷冻干燥60h，即得所述细胞外基质冻干粉。
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