CN101884602A - 一种皮肤美容修复抗衰除皱的化妆品制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于美容修复皮肤缺损与抗衰老的化妆品制剂，通过日常皮肤护理或美容导入方法将含有生物活性成分具有真皮层修复机能的重组人血小板衍生生长因子(recombinant humanPlatelet-Derived Growth Factor，简称rhPDGF)与其它生长因子(转化生长因子TGF-β、成纤维母细胞生长因子aFGF和bFGF、表皮生长因子EGF)以及透明质酸(Hyaluronic Acid，简称HA)复合制剂导入真皮层，刺激真皮层内成纤维细胞的生长与有丝分裂、胶原蛋白与透明质酸的合成与分泌、胶原纤维与弹性纤维的生成与修复，从而修复因衰老或皮肤损伤造成的诸如皮肤凹陷、深皱纹、真皮纤维组织断裂等皮肤组织缺陷，达到美化肌肤抗衰老的效果。
Description
技术领域
本发明公开了一种重组人血小板衍生生长因子rhPDGF和重组人转化生长因子rhTGF-β的美容新用途，专利涉及的技术领域为基因工程与生物制药技术在皮肤美容与抗衰老领域的应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，总重量占体重的5％～15％，总面积为1.5～2平方米。皮肤具有保持人体内环境稳定的功能，防止体内水分、电解质和其他营养物质的丢失和阻止外界有害物质的侵入的屏障作用，在生理上起着重要的保护功能，同时皮肤也是人体健康与衰老的重要体征与标志，具有重要的美容功用。皮肤的损伤时有发生，而皮肤衰老不可避免。
皮肤衰老开始表现为皮肤松弛下垂，由于重力作用和循环能力减弱，眼部、额部、颈部周围开始出现膨胀，真皮结缔组织失去正常功能，皮肤失去柔软润泽的外观，溶性胶原消退使皮肤粗糙；皮肤逐渐流失弹性胶原蛋白，皮丘结构不能隆起与保持形状；皮脂分泌降低等原因引起皮肤干燥，皮肤保留液体能力减退；皮肤弹性纤维变质，皮肤皱纹开始出现并逐年加深。解剖学研究表明，20岁以后真皮成纤维母细胞数量逐渐减少，胶原蛋白总含量每年减少1％，胶原纤维变粗，密度增大，且变为不可溶性，不易被胶原酶所分解，胶原稳定性增加。有关胶原基因表达研究揭示，I型胶原基因表达降低，I型胶原合成减少，而III型胶原基因表达增加。由于胶原纤维的这些改变，使胶原应力传导减弱，一旦受过分拉伸就容易发生撕裂伤。真皮网状层弹性纤维排列改变，电镜下纤维边界模糊，偶见纤维断裂，这些变化在50岁后多见。弹性纤维所含微丝减少，弹性纤维的内含物增多，弹性纤维形态变异复杂，导致皮肤拉伸后弹性回复力减弱。真皮乳头层弹性纤维也发生改变，正常升至真皮乳头最高位置紧贴基底膜下的弹性纤维网消失了。电镜检查显示，非正常弹性纤维由大量微纤维沉淀构成，这种弹性纤维的退化导致皮肤松弛，形成细小皱纹。由于胶原和弹性纤维的结构改变，导致皮肤生物力学的改变。运用机械装置测定皮肤伸展能力和弹性回复力发现，皮肤伸展能力70岁后才明显下降，而弹性回复力从很早就开始下降。故皮肤弹性可作为衡量皮肤老化程度的一个参数。35岁以后皮肤张力明显下降。
老化、过度干燥的环境、不当地拉扯皮肤等因素，都会破坏胶原蛋白的结构，造成细小纹路甚至皱纹的出现。胶原蛋白在肌肤真皮层结构的转变如下，由新生组织的「单束连结(intrastrand links)」、变成「束与束连结(interstrand links)」、最后变成「分子间连结(intermolecular links)」的方式存在。因此胶原蛋白的整体结构就变得较为紧密、但是支撑力相对减弱，导致真皮层的张力随之而降低，就会使得真皮层弹力蛋白逐渐丧失弹性，使得肌肤呈现出松垮的外观。而胶原蛋白的物化性质同样也会有所改变，新生组织的胶原蛋白呈水溶性，老化组织的胶原蛋白则呈水不溶性。比较胶原蛋白在体內的含量则会发现，存活年龄越长的动物其体内胶原蛋白的总含量会越少，水不溶性胶原蛋白的比例也会随之增加。
目前解决皮肤皱纹与衰老的方式主要包括1、口服抗衰老与补充流失成分的营养物质，包括维生素C、维生素E、胶原蛋白、透明质酸(玻尿酸)等，或者2、采用注射肉毒素、奥美定、玻尿酸、胶原蛋白等补充或抑制流失成分的药物或营养制剂。口服方式通过消化系统与代谢作用到达真皮层的过程十分复杂与不可控，只能从营养学的角度具有广义的营养作用，缺乏临床数据的支持，特别是对特定的皮肤缺损与深皱纹无法做到针对性修复。注射方式靶向性强，效果显著，但代价不菲，或如肉毒素、奥美定等具有不同程度的副作用，或如玻尿酸、胶原蛋白等因被周边组织吸收或随细胞间质流失而保持期较短。
细胞生长因子是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质。存在于血小板和各种成体与胚胎组织及大多数培养细胞中，对不同种类细胞具有一定的专一性。在分泌特点上，生长因子主要属于自分泌(autocrine)和旁分泌(paracrine)。许多生长因子已被提纯和确定了其结构组成。各类生长因子都有其相应的受体，是普遍存在于细胞膜上的跨膜蛋白，不少受体具有激酶活性，特别是酪氨酸激酶活性(如PDGF受体、EGF受体等)。由于生长因子是由正常细胞分泌，既无药物类毒性，也无免疫反应，因此在研究其生理作用机制同时，有的已试用于临床治疗。生长因子有多种，如血小板类生长因子(血小板来源生长因子，PDGF；骨肉瘤来源生长因子ODGF)、表皮生长因子类(表皮生长因子，EGF、转化生长因子，TGFα和TGFβ)、成纤维细胞生长因子(αFGF、βFGF)、类胰岛素生长因子(IGF-I、IGF-II)、神经生长因子(NGF)、白细胞介素类生长因子(IL-1、IL-1、IL-3等)、红细胞生长素(EPO)、集落刺激因子(CSF)等。
转化生长因子TGF、酸性成纤维母细胞生长因子aFGF、碱性成纤维母细胞生长因子bFGF)、表皮生长因子简称EGF目前已经开始运用在美容化妆品领域，其显著的功效与基因层面的作用机制已经逐渐被行业所接受。但上述细胞生长因子在临床上还存在一定风险，这也是至今美国FDA仅批准了两项PDGF的新药许可，而没有其他细胞生长因子付诸临床应用的原因。
PDGF是人体内源的具有双链结构的蛋白质多肽，由109个氨基酸组成，分子结构中有8对二硫键，分子量为24～30KDa，以α颗粒的形式储存于血小板中，正常人血浆中存在的PDGF浓度约为17.5+/-3.1(SD)ng/mL，随血液循环而行。组织受损时，巨噬细胞、血小板、浸润的炎细胞、受损的内皮细胞及激活的肝星形细胞均可以分泌PDGF，以自分泌、旁分泌的方式发挥作用。PDGF是血小板分泌释放的主要有丝分裂源，是一个极为重要的作用于间充质细胞的生长因子，直接促进正常靶细胞的增殖和分化，逆转分化老化细胞为年轻的干细胞，恢复细胞活力。极微量的PDGF即能强烈引发细胞周期阶段的变化，刺激细胞的DNA合成，导致RNA合成及有丝分裂，延缓正常细胞衰老进程，延长细胞的生命周期，加速变异细胞的凋亡进程，促进细胞的更新与再生，具有良好的促进细胞增殖作用，使新生细胞逐渐增多，同时PDGF能诱发其他细胞生长因子(hEGF、hbFGF、hNGF、aFGF、TGF-β)的形成，全面促进各类细胞生长。
rhPDGF采用基因工程技术表达并经现代层析高度纯化，对人类皮肤细胞没有任何毒副作用，是众多细胞生长因子中唯一通过美国FDA批准上市的基因工程产品，目前在国外广泛应用于糖尿病溃疡愈合、组织再生、运动关节整形矫治等方面的治疗。尚未有见其在皮肤美容修复与抗衰老方面的研究和应用。rhPDGF是真皮层组织缺损与衰老良好的修复成分，在细胞层面对成纤维细胞、角元细胞等皮肤组织的微观结构进行调节与再造，在美容抗衰与美容整形领域中具有广阔的应用前景。
TGF-β是一种亲多种组织、多种效应和多功能性的细胞因子。它由间充质细胞产生，也可由浸润的淋巴细胞、单核巨噬细胞及血小板产生。TGF-β是由两个结构相同或相近的、分子量的12.5kDa亚单位借二硫键连接的双体，其cDNA序列研究表明，单体的TGF-β112氨基酸残基是由含400氨基酸残基的前体分子(per-pro-TGF-β)从羧基端裂解而来。pre-pro-TGF-βN端含有一个信号肽，在分泌前被裂解掉，成为非活性状态的多肽链前体(pro-TGF-β)，通过改变离子强度、酸化或蛋白酶水解切除N端部分氨基酸残基，所剩余的羧基端部分形成有活性的TGF-β。起初对TGF-β的生物学功能研究主要在炎症、组织修复和胚胎发育等方面，近年来发现TGF-β对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用。TGF-β1、β2和β3功能相似，一般来说，TGF-β对间充质起源的细胞超刺激作用，而对上皮或神经外胚层来源的细胞起抑制作用：促进成纤维细胞、成骨细胞和雪旺氏细胞的生长。TGF-β1、TGF-β2促进人成纤维细胞IL-6的产生，其机理可能是通过对IL-6基因转录的调节；抑制上皮细胞、破骨细胞、内皮细胞生长和脂肪、心肌、骨骼肌的形成。TGF-β可拮抗EGF的某些生物学功能；促进细胞外基质(ECM)如胶原蛋白、纤粘连蛋白的表达和抑制ECM的降解，对细胞的形态发生、增殖和分化过程起着重要作用，有利于胚胎发育和细胞修复。动物体内实验表明，局部注射TGF-β可以促进伤口愈合和典型肉芽组织形成。过多的TGF-β可使组织纤维化，可引起纤维母细胞迁移，抑制胶原酶和其它金属蛋白酶的活性，增加胶原产生，降低胶原降解，促进基质沉积。
本发明首先将rhPDGF应用于日常皮肤美容护理和皮肤修复抗衰老领域，通过rhPDGF与TGF-β联合应用，可以刺激rhPDGF成倍发挥功效，配合aFGF、bFGF、EGF各自的功效，作用于表皮层和真皮层目标位置的靶细胞，能有效增强细胞活力，对于表皮细胞的增殖、再生和受损皮肤组织的修复具有极强功效，促进纤维母细胞、表皮细胞、神经细胞等多种皮肤细胞的分裂和新皮肤组织的再生，促进胶原纤维、网状纤维、弹性纤维的形成。经过一段时间使用，能有效修复受损皮肤组织，明显恢复、增强皮肤弹性，舒展皱纹，延缓衰老，回复皮肤紧致弹性。同时，可以诱导皮肤毛细血管的形成、发育和分化，改善微循环，有效提供肌肤所需营养，增强皮肤细胞对营养物质的吸收和对代谢废物的排泄，提升皮肤活力，延缓皮肤衰老，增强对环境侵袭、紫外线、污染物、刺激物、敏化剂、炎性细胞的抵抗力，预防痤疮、暗疮发生，淡化面部色斑，改善面部晦暗色泽，滋养肌肤白里透红，年轻健美。能刺激细胞外大分子的合成与分泌(如透明质酸、糖蛋白等)，促进人体自身胶原蛋白、透明质酸和纤维蛋白的合成与胶原纤维、网状纤维、弹性纤维的发育，调节胶原蛋白和粘多糖的分泌，维持皮肤组织中水分含量和电解质代谢，改善萎缩皮肤的缺水状态，使皮肤细胞更加饱满，细胞间质更加充盈，消除或减少皱纹，调理肌肤幼嫩光滑，润泽丰满，从而持久修复诸如皮肤凹陷、深皱纹、真皮纤维组织断裂等皮肤缺陷，达到美化肌肤抗衰老的效果。
由于健康皮肤存在表皮屏障，使水份、油脂、电解质、蛋白质大分子无法自由进出表皮的角质层，使rhPDGF等调理修复成分只能透过毛囊和汗腺等通道进入真皮层极微量的部分，影响限制了这些活性成分发挥作用。本发明的制剂通过细胞生长因子活性保护成分、透皮促进成分和补水保湿成分，提高了皮肤对生物活性成分的吸收能力，如同时结合真皮层微介术(压力导入、微针导入、磨砂去死皮导入、微波导入、射频导入、电泳导入、喷射导入、皮内注射导入、像素激光导入及其组合应用)，可以使细胞生长因子的透皮吸收效率提高10-1000倍，满足不同皮肤美容、抗衰、修复、调理的需要。
发明内容
本发明公开了一种复合细胞生长因子用于美容修复皮肤皱纹与凹陷缺陷的化妆品制剂，通过日常皮肤护理和美容导入方法，克服或穿透表皮屏障将微量(微克级单位)含有生物活性成分具有真皮组织修复机能的重组人血小板衍生生长因子(recombinant human Platelet-Derived Growth Factor，简称rhPDGF)与其它生长因子(转化生长因子TGF-β、成纤维母细胞生长因子aFGF和bFGF、表皮生长因子EGF)以及透明质酸(HA)复合制剂导入真皮层目标位置的靶细胞，刺激真皮层内成纤维细胞的生长与有丝分裂、胶原蛋白与透明质酸的合成与分泌、胶原纤维与弹性纤维的生成与修复，从而持久修复诸如皮肤凹陷、深皱纹、真皮纤维组织断裂等皮肤缺陷，达到美化肌肤抗衰老的效果。
附图说明
图1为rhPDGF对多种皮肤细胞的微观作用与美容效果。
具体实施方式
活性成分：重组人血小板衍生生长因子rhPDGF-BB来源：Merck chemical，invitrogen；转移生长因子rhTGF-β来源：Merck chemical，invitrogen；酸性成纤维母细胞生长因子aFGF来源：上海万兴生物制药有限公司；碱性成纤维母细胞生长因子bFGF来源：北京双鹭药业股份有限公司、南海朗肽制药有限公司；表皮生长因子EGF来源：上海昊海生物科技有限公司、成都万和生物工程有限责任公司。
功效成分：卡波姆、透明质酸HA、水溶性胶原蛋白，来源：市售，医药级。
辅助成分：甘露醇、右旋糖苷、硼酸亮氨酸、硼酸缬氨酸、硼酸丙氨酸、N-乙酰半胱氨酸、赖氨酸盐酸盐、甘油、比咯烷酮羧酸钠、尿囊素、佐恩、泛醇、氢氧化钠、二羟甲基二甲基乙内酰脲、碘代丙炔基氨基甲酸丁脂丙二醇、尼泊金甲酯，来源：市售，医药级。
冻干粉制剂的制备：将活性成分、功效成分和辅助成分用低温纯化水配制成水溶液，并置于冰浴中备用。将上述水溶液分装到洁净的西林瓶中，将胶塞半加塞，置于冻干机中。开启真空冷冻干燥剂将制剂温度降至-60℃，降温时间延迟3-6小时。启动真空泵，将工作室内真空度抽至0.3MPa。逐渐升温，升华，升华时间为12-24小时。至制剂中的水分升华完毕，工作室内充入氮气，压塞，轧盖封装。
专用溶酶的制造：将辅助成分用pH5.0-7.4的PBS溶液溶解，加入丙三醇，混合均匀，按剂量分装到西林瓶中，加塞，轧盖封装，用105℃蒸汽高温灭菌20分钟。
实施例1
抗衰精华素：量取rhPDGF 0.01g～0.1g、TGF 0.001g～0.1g、HA 1g～10g、甘露醇10～100g、右旋糖苷10～100g、水溶性胶原蛋白5～50g、加纯化水至1000g，分装，冻干，充入氮气，压塞，轧盖封装。硼酸亮氨酸0g～10g、硼酸缬氨酸0g～10g、硼酸丙氨酸0g～10g、N-乙酰半胱氨酸0g～10g、丙二醇0g～5g、佐恩0g～5g、pH5.0～7.5PBS加至1000g，分装，轧盖封装，用105℃蒸汽高温灭菌20分钟。
实施例1所述细胞生长因子复合制剂适用于压力导入、磨砂去死皮导入、微波射频导入、超声波导入、电泳导入及其组合应用。
实施例2
除皱精华素：量取rhPDGF 0.01g～0.1g、TGF 0.001g～0.1g、HA 5g～20g、甘露醇10～100g、加纯化水至1000g，分装，冻干，充入氮气，压塞，轧盖封装。右旋糖苷10～100g、水溶性胶原蛋白5～50g、pH5.0～7.5PBS加至1000g，分装，轧盖封装，用105℃蒸汽高温灭菌20分钟。
实施例2所述细胞生长因子复合制剂适用于微针导入、磨砂去死皮导入、喷射导入、皮内注射导入、激光导入及其组合应用。
实施例3
护肤调理乳霜：量取rhPDGF 0.01g～0.1g、TGF 0.001g～0.1g、HA 1g～10g、卡波姆3～10g、羧甲基纤维素5～10g、右旋糖苷10～100g、水溶性胶原蛋白5～50g、硼酸亮氨酸0g～10g、硼酸缬氨酸0g～10g、硼酸丙氨酸0g～10g、N-乙酰半胱氨酸0g～10g、丙二醇0g～5g、佐恩0g～5g、尼泊金甲酯0.01～0.5g、加纯化水至1000g，分装，轧盖封装，低温冷藏。
实施例3所述细胞生长因子复合制剂适用于日常护肤、专业美容调理养护、压力导入、磨砂去死皮导入、微波射频导入、超声波导入、电泳导入及其组合应用。
实施例4
抗衰除皱面霜：量取rhPDGF 0.05g、TGF-β0.01g、aFGF 0.05g、bFGF 0.05g、EGF 0.05g、赖氨酸盐酸盐：5g、透明质酸1g、甘油50g、比咯烷酮羧酸钠15g、尿囊素15g、泛醇：30g、卡波姆10g、氢氧化钠：5g、二羟甲基二甲基乙内酰脲：5g、碘代丙炔基氨基甲酸丁脂：0.5g、加纯化水至1000g，分装，轧盖封装，低温冷藏。
实施例4所述细胞生长因子复合制剂适用于日常护肤、专业美容调理养护、压力导入、磨砂去死皮导入、微波射频导入、超声波导入、电泳导入及其组合应用。
质量评价：上述四项实施例进行安全性试验、稳定性试验和美容功效试验，结果表明本发明所述细胞生长因子复合制剂安全稳定，具有明确的美容抗衰祛皱效果，适合作为美容化妆品配合美容微介术实施应用，具有良好的应用前景。
安全性试验
| 过敏测试 | 测试实例 | 无刺激 | 轻度过敏 | 其他不良反应 | 安全性评价 |
| 实施例1 | 120 | 119 | 1 | 0 | 优良 |
| 实施例2 | 120 | 120 | 0 | 0 | 优良 |
| 实施例3 | 120 | 118 | 2 | 0 | 优良 |
| 实施例4 | 120 | 118 | 1 | 0 | 优良 |
稳定性试验
| 活性保持率 | 测试实例 | 6个月 | 12个月 | 18个月 | 24个月 | 稳定性评价 |
| 实施例1 | 10 | 99 | 98 | 96 | 95 | 优良 |
| 实施例2 | 10 | 99 | 98 | 96 | 95 | 优良 |
| 实施例3 | 10 | 95 | 90 | 86 | 80 | 良好 |
| 实施例4 | 10 | 96 | 92 | 89 | 85 | 良好 |
美容效果试验
| 除皱美白 | 测试实例 | 非常显著 | 显著 | 改善 | 无效果 | 评价 |
| 实施例1 | 90 | 19 | 25 | 40 | 6 | 良好 |
| 实施例2 | 50 | 30 | 20 | 0 | 0 | 优良 |
| 实施例3 | 150 | 31 | 37 | 61 | 21 | 良好 |
| 实施例4 | 150 | 33 | 43 | 51 | 23 | 良好 |
Claims (7)
1.一种含有复合细胞生长因子活性成分用于美容修复皮肤缺损与抗衰老的化妆品制剂。
2.权利要求1所述的细胞生长因子复合制剂包括但不限于重组人血小板衍生生长因子(recombinanthuman Platelet-Derived Growth Factor，简称rhPDGF)、重组人转化生长因子(recombinant humanTransforming Growth Factor，rhTGF)、重组人酸性成纤维母细胞生长因子(recombinant human AcidicFibroblast Growth Factor、简称aFGF)、重组人碱性成纤维母细胞生长因子(recombinant human BasicFibroblast Growth Factor、简称bFGF)、重组人表皮生长因子(recombinant human Epidermal GrowthFactor、简称EGF)。
3.权利要求2所述的细胞生长因子复合制剂其中rhPDGF为rhPDGF-BB含量10ng/g-1mg/g，不包含rhPDGF-AB、rhPDGF-AA，分子量为23～28KDa，纯度不低于95％，比活性不低于1×105IU/mg，优选纯度高于99％，比活性高于5×105IU/mg的rhPDGF-BB。rhPDGF-BB可以单独使用，也可以与其它生长因子复合使用。
4.权利要求2所述的细胞生长因子复合制剂其中rhPDGF为rhPDGF-BB含量100ng/g-500μg/g，不包含rhPDGF-AB、rhPDGF-AA，分子量为23～28KDa，纯度不低于95％，比活性不低于1×105IU/mg，优选纯度高于99％，比活性高于5×105IU/mg的rhPDGF-BB。rhPDGF-BB与其它生长因子复合使用。
5.权利要求2所述的其它细胞生长因子包括转化生长因子TGF、酸性成纤维母细胞生长因子aFGF、碱性成纤维母细胞生长因子bFGF、表皮生长因子EGF。其中TGF的类型为rhTGF-β，含量0ng/g-100μg/g，其中不包含TGF-α类型，纯度不低于95％；酸性成纤维母细胞生长因子aFGF含量0ng/g-500μg/g；碱性成纤维母细胞生长因子bFGF含量0ng/g-500μg/g；表皮生长因子EGF含量0ng/g-500μg/g。
6.权利要求2所述的细胞生长因子复合制剂其中透明质酸HA、卡波姆、羧甲基纤维素水溶性胶原蛋白构成化妆品功能性基质材料，且透明质酸0-20mg/g、卡波姆0-20mg/g、羧甲基纤维素0-10mg/g、水溶性胶原蛋白0-50mg/g。
7.权利要求2所述的细胞生长因子复合制剂其中辅助成分包括甘露醇0-100mg/g、右旋糖苷0-100mg/g、硼酸亮氨酸0-10mg/g、硼酸缬氨酸0-10mg/g、硼酸丙氨酸0-10mg/g、N-乙酰半胱氨酸0-10mg/g、赖氨酸盐酸盐0-10mg/g、甘油0-100mg/g、比咯烷酮羧酸钠0-50mg/g、尿囊素0-20mg/g、泛醇0-50mg/g、佐恩0-5mg/g、氢氧化钠0-50mg/g、二羟甲基二甲基乙内酰脲0-5mg/g、碘代丙炔基氨基甲酸丁脂丙二醇0-0.5mg/g、尼泊金甲酯0-1mg/g。
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