CN111621537B - 一种淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽粉的制备方法 - Google Patents

一种淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽粉的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111621537B
CN111621537B CN202010387476.0A CN202010387476A CN111621537B CN 111621537 B CN111621537 B CN 111621537B CN 202010387476 A CN202010387476 A CN 202010387476A CN 111621537 B CN111621537 B CN 111621537B
Authority
CN
China
Prior art keywords
collagen
enzymolysis
collagen peptide
scales
weever
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010387476.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111621537A (zh
Inventor
尤娟
张皓炎
姜越
尹涛
胡杨
熊善柏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN202010387476.0A priority Critical patent/CN111621537B/zh
Publication of CN111621537A publication Critical patent/CN111621537A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111621537B publication Critical patent/CN111621537B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽粉的制备方法，称取干燥鲈鱼鱼鳞，用蒸馏水冲洗；接着用NaOH溶液进行脱杂蛋白处理，用蒸馏水洗涤至中性；再加入HCl溶液进行脱钙处理，再用蒸馏水洗涤至中性；脱钙后湿鱼鳞与水混合，搅拌，用纱布过滤，得滤液为胶原蛋白原液，冷冻保存备用；将胶原蛋白原液中加入酶量进行酶解反应，结束后置于沸水浴中终止酶解反应；用超滤设备对酶解液进行超滤，得到胶原蛋白肽液；用冷冻干燥机对肽液进行冷冻干燥，然后用气流粉碎机进行处理，得到胶原蛋白肽粉。本发明采用“热水提取、碱性蛋白酶酶解”的工艺，既可以避免其他低价值蛋白肽的掺入，还同时能够确保胶原蛋白肽的均一性及稳定性，延长贮藏时期。

Description

一种淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽粉的制备方法
技术领域
本发明属于淡水鱼加工领域，具体涉及一种淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽粉的制备方法。
背景技术
鱼鳞中含有大量的蛋白质和矿物质，其中有机物占比41％～55％。在特色淡水鱼加工过程中产生的大量副产物营养价值很高，并随着我国水产品加工总量的增加而增加，但大量的鱼加工副产物被加工成动物饲料或者直接丢弃，这不但造成了很大的资源浪费，还严重污染了环境。因此，开展对淡水鱼加工副产物的研究，不仅能提高我国水产品加工利用的综合效益和淡水鱼的经济附加值，同时还能避免造成环境污染。目前，鱼鳞胶原蛋白活性肽已有较多研究和报道，但是在原料选取上，大多都是以热带性鱼类罗非鱼为载体制备胶原蛋白肽，也有部分企业是以草鱼等鲤科鱼类为载体制备胶原蛋白肽；同时，在提取及酶解工艺上，现有方法对于胶原蛋白肽产品的稳定性及均一性方面也存在不同程度的影响，大多采取“复合酶提取、复合酶酶解”的生产工艺，但是这种生产工艺会使胶原蛋白中掺入鱼鳞中所含的如硬蛋白等对于人体营养价值不高的蛋白，使降低胶原蛋白肽产品的相对营养价值；此外，还有一部分企业采用“酸提取、胃蛋白酶酶解”的生产工艺，此法虽可以避免上述问题，但是此生产工艺所耗时间较长，对于生产来说会降低企业效率。
发明内容
本发明提供一种淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽粉的制备方法，以特色淡水鱼加工副产物鱼鳞为原料，以鲈鱼鱼鳞为研究载体，比较筛选适宜鱼鳞定向酶解的胶原蛋白内切酶，生产高价值高均一性胶原蛋白肽粉。
本发明所采用的技术方案是：
一种淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽粉的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)称取干燥鲈鱼鱼鳞，用蒸馏水冲洗；
2)加入NaOH溶液进行脱杂蛋白处理，用蒸馏水洗涤至中性；
3)再加入HCl溶液进行脱钙处理，再用蒸馏水洗涤至中性；
4)脱钙后湿鱼鳞与水混合，搅拌，用纱布过滤，得滤液为胶原蛋白原液；
5)将胶原蛋白原液中加入酶量进行酶解反应，结束后置于沸水浴中终止酶解反应；得到胶原蛋白肽酶解液。
6)用超滤设备对酶解液进行超滤，得到胶原蛋白肽液；
7)用冷冻干燥机对肽液进行冷冻干燥，然后用气流粉碎机进行处理，得到胶原蛋白肽粉。
优选地，所述步骤2)鲈鱼鱼鳞与NaOH溶液的料液比为w/v＝1:10～1:8，NaOH溶液浓度为0.08～0.12mol/L，脱杂蛋白处理温度为20～30℃，处理时间为4～5小时。
优选地，所述步骤3)鲈鱼鱼鳞与NaOH溶液的料液比为w/v＝1:10～1:8，HCl溶液浓度为0.4～0.6mol/L，脱杂处理温度为20～30℃，处理时间为1.5～2小时。
优选地，所述步骤4)脱钙后湿鱼鳞:水＝1:5～1:4(w/v)混合，搅拌温度为70～75℃，搅拌时间为6～7小时。
优选地，所述步骤5)酶加入量为蛋白原液质量的0.50％-1.00％，酶为碱性蛋白酶，酶解pH为9～10，酶解温度为35～40℃,酶解时间为30～40min。
优选地，所述步骤1)中，蒸馏水清洗前，加入酵母菌进行发酵处理，鲈鱼鱼鳞与酵母菌的质量比为100:(0.5-1.5)，置于25-35℃下发酵处理为3～4小时。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明以特色淡水鱼加工副产物鱼鳞为原料，以鲈鱼鱼鳞为研究载体，比较筛选适宜鱼鳞定向酶解的胶原蛋白内切酶，并优化酶解技术，以大众感官鉴评的方法对其实用性和有效性进行评估，去除原料所含的腥味，提高酶解胶原蛋白短肽的纯度、均一性和吸收效率，生产高价值胶原高均一性胶原蛋白肽粉，并对其贮藏性能进行探究，实现特色淡水鱼加工副产物的高值化利用。
2、本发明采用“热水提取、碱性蛋白酶酶解”的工艺，既可以避免其他低价值蛋白肽的掺入，又可以大大缩短生产时间，还同时能够确保胶原蛋白肽的均一性及稳定性，延长贮藏时期，为企业能够带来更大效益。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1羟脯氨酸标准曲线；
图2不同酶处理粒径分布；
图3碱性蛋白酶不同处理时间粒径分布；
图4不同酶制备鱼鳞胶原蛋白肽的肽段分子量分布；
图5不同酶对鲈鱼鱼鳞胶原蛋白原液SDS-PAGE条带的影响；
图6不同湿度下随贮藏时间延长总巯基含量变化；
图7不同湿度下不同贮藏阶段内源荧光强度变化对比；
图8随贮藏时间延长感官鉴评得分情况；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步的说明。
实施例1淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法中酶解条件研究
1.1实验原料
1)实验材料。供试鲈鱼鱼鳞采自武汉市洪山区关山农贸市场。鱼鳞经清水冲洗干净后50℃烘箱烘干，室温保存备用。L-羟脯氨酸购于上海源叶生物科技有限公司；碱性蛋白酶购于大连美仑生物技术有限公司；胃蛋白酶购于德国Biofrox公司；中性蛋白酶购于源叶生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
2)仪器设备。722型可见光分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；分析天平，日本岛津公司；HH-2数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；Mastersizer 3000激光衍射粒度分析仪，英国马尔文仪器有限公司；Multiskan FC酶标仪，美国Thermo Fisher科技公司；F-4600荧光分光光度计，日立高新技术公司。
1.2实验方法
1.2.1鱼鳞胶原蛋白原液制备
称取干燥鲈鱼鱼鳞200g，用蒸馏水冲洗，接着加入2L(料液比w/v＝1:10)0.1mol/LNaOH溶液在25℃条件下搅拌4小时进行脱杂蛋白处理，随后用蒸馏水洗涤至中性，再加入2L0.5mol/L HCl溶液在25℃条件下搅拌1.5小时进行脱钙处理，再用蒸馏水洗涤至中性，脱钙后湿鱼鳞:水＝1:4(w/v)混合，在70℃条件下搅拌6小时，最后用4层纱布过滤，得滤液冷冻保存备用。
1.2.2鲈鱼鱼鳞胶原蛋白含量测定
参考潘杨的方法绘制羟脯氨酸标准曲线，配制浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0μg/mL的羟脯氨酸标准储存液，取各浓度标准液1mL，加入1mL柠檬酸缓冲液和1mL氯胺T溶液在25℃水浴中氧化20min，加入1mL高氯酸，于25℃水浴中放置10min，加入1mL对二甲基氨基苯甲醛，65℃水浴显色20min，冷却后于560nm波长处测定吸光度。以羟脯氨酸质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，获得回归方程式y＝0.048x+0.0506。y为吸光度A，x为羟脯氨酸的质量浓度mg/L，其相关系数R2＝0.99302。根据WOESSNER J F.的方法计算鱼鳞中胶原蛋白的含量，即由测定的羟脯氨酸含量乘以9.75即为胶原蛋白含量。
1.2.3鲈鱼鱼鳞的基本化学组成测定
水分检测方法参考GB5009.3-2016第一法，蛋白质检测方法参考GB5009.5-2016第一法，脂肪检测方法参考GB5009.6-2016第二法，灰分检测方法参考GB5009.4-2016第一法。
1.2.4胶原蛋白肽的制备
将胶原蛋白原液与0.50％加酶量的酶在最适温度37℃、最适PH10.0条件下酶解反应0.5h反应结束，置于沸水浴中5min终止酶解反应，由此制备出胶原蛋白肽酶解液；用超滤设备对酶解液进行超滤，得到胶原蛋白肽液。
1.2.5胶原蛋白肽粒径的测定
将胶原蛋白原液在最适条件下用酶处理后，测定酶解前后粒径变化，以确定最适内切酶种类及最佳酶解条件。测定d10、d50、d90，d10意味着样品颗粒中有10％颗粒的粒径低于该值，而90％颗粒粒径均大于该值；d50意味着样品颗粒中有一半颗粒的粒径低于该值，而另一半颗粒粒径均大于该值；d90意味着样品颗粒中有90％颗粒的粒径低于该值，而10％颗粒粒径均大于该值。分布跨度/径距Span是对样品粒径分布宽度的度量。Span＝(d90-d20)d50)，对于对称分布而言，Span＝1。因而Span值越接近于1，样品均一性越好。
1.2.6胶原蛋白肽粉的制备及贮藏性质变化
用冷冻干燥机对肽液进行冷冻干燥，然后用气流粉碎机进行处理，得到胶原蛋白肽粉。根据巯基含量、内源荧光性、色度、感官鉴评等指标的变化，研究胶原蛋白肽粉在不同湿度条件(50％RH、70％RH、90％RH)下的贮藏稳定性，反映胶原蛋白粉在贮藏期间氧化程度变化。
1.2.6.1胶原蛋白肽分子量的测定
称取1g胶原蛋白肽于10mL带塞比色管中，加入5mL V(乙腈):V(H2O)＝1:1提取液,用超声提取仪提取30min,静止沉降15min,取40mL上层清液,以5000r/min离心5min,取上层清液过0.20μm有机滤膜，待测。色谱条件中色谱柱为Aglient XDB C18(150mm×2.1mm i.d,3.5μm)；流动相为V(乙腈):V(H2O)＝80:20混合溶液,流速为0.2mL/min；进样量为10μL；柱温为30℃。质谱条件中离子源为电喷雾(ESI)离子源，正离子模式，多反应监测(MRM)扫描方式；电喷雾电压(IS)为5500V；离子源温度(TEM)为500℃；辅助气1压力(GS1)为139kPa，辅助气2压力(GS2)为206.7kPa；气帘气压力(CUR)为103.4kPa；碰撞气(CAD)为41.3kPa；入口电压(EP)和出口电压(CXP)为10V。
利用SDS-PAGE凝胶电泳分析。将胶原蛋白原液与不同酶处理后的胶原蛋白肽的蛋白质浓度调至2mg/mL，与样品缓冲液以1:1的比例混合沸水浴4min，样品上样量8μL，分子量标准Marker上样量10μL。用0.25％的考马斯亮蓝R250-乙醇冰醋酸溶液染色，水-乙醇冰醋酸溶液脱色2-3次至背景无色。采用Image Lab分析凝胶图像。
1.2.6.2巯基含量的测定
采用巯基测定试剂盒进行测定。配制20mg/mL，10mg/mL，1mg/mL三个梯度的胶原蛋白肽溶液，加入Ellman试剂，于40℃下保温25min后，取出并用流水降低其温度。待温度降低至室温后，采用酶标仪测定412nm波长处的吸光度。
Figure GDA0002600977950000051
1.2.6.2内源荧光测定
参考Durba Roy等人的方法略作修改，用0.6M NaCl Tris-HCl缓冲液(PH7.5)将样品稀释为1mg/ml，。测量荧光强度设置EX(激发)和EM(发射)狭缝在5nm,和EX波长282nm和EMStart WL为300nm，EM End WL为500nm。
1.2.6.3色泽测定
取2g胶原蛋白肽粉末，用色度仪测定L*、a*、b*值。以L*、a*、b*表示色度值,其中L*为亮度值,值越大表示亮度越高；a*为色调值,“+”表示红色,值越大颜色越红,“-”表示绿色,值越小颜色越绿；b*为彩度值,“+”表示黄色,值越大颜色越黄,“-”表示蓝色,值越小颜色越蓝。白板校正后,取样品粉末平铺于比色皿中,用色度计分别记录样品的L*(亮度)，a*(红/绿)和b*(黄/蓝)测定粉末颜色,平行3次,取平均值。
1.2.6.4胶原蛋白肽粉感官鉴评
对贮藏期间的胶原蛋白肽粉进行感官鉴评，贮藏周期为四周，鉴评频率为一周一次。由10名经过培训的人员组成鉴评小组，对胶原蛋白肽粉的四个方面进行鉴评打分，总分为100分，其中颜色占20分，嗅觉腥味占20分，颗粒状态占30分，口感占30分。具体分值评判标准如表1所示
表1 胶原蛋白粉感官鉴评参考标准
Figure GDA0002600977950000061
2工艺优化过程
2.1鱼鳞胶原蛋白含量
用氧化剂将羟脯氨酸氧化，再生成有色物质，有色物质的光密度在560nm波长下呈线性关系。通过分光光度计利用羟脯氨酸标准曲线计算羟脯氨酸含量。
以羟脯氨酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程。以羟脯氨酸为标准，绘制标准曲线(图1)，并获得回归方程式y＝0.048x+0.0506。y为吸光度A，x为羟脯氨酸的质量浓度mg/L。其相关系数R2＝0.99302。这说明所确立的回归方程是有意义的。
根据WOESSNER J F的方法计算鱼鳞中胶原蛋白的含量，即由测定的羟脯氨酸含量乘以9.75即为胶原蛋白含量(表2)。
表2 胶原蛋白含量测定
平行1 平行2 平均
羟脯氨酸含量ug/mg 23.71 20.22 21.97
胶原蛋白含量ug/mg 231.17 197.15 214.21
2.2鲈鱼鱼鳞的基本化学组成
鲈鱼鱼鳞中含有丰富的粗蛋白质和灰分。粗蛋白质含量占干基的60.59％，以胶原蛋白和硬蛋白为主，其中胶原蛋白在总粗蛋白质中的含量有9.3％。灰分含量占干基的41.80％，与其他种类的鱼鳞相比含量较多(表3)。
鱼鳞中粗脂肪的含量基本都是＜1％或微量，脂质含量少有利于胶原蛋白粉的制取，也使得胶原蛋白粉的品质和贮藏性能更佳(表4)。
表3 鲈鱼鱼鳞的基本化学组成
Figure GDA0002600977950000062
Figure GDA0002600977950000071
表4 非胶原蛋白与胶原蛋白比例
非胶原蛋白蛋白质/％ 胶原蛋白/％
51.29 9.3
将鲈鱼鱼鳞中的基本化学组成分别于其他几种鱼鳞进行比较，结果见表5。鱼鳞的水分含量集中在13.66％～15.87％，相比较，鲈鱼鱼鳞中水分含量稍低。鱼鳞中灰分含量较高，会阻碍提取液与鱼鳞间的接触，且鱼鳞灰分多以羟基磷灰石形式存在，直接影响胶原蛋白的提取。鱼鳞中的胶原蛋白被鱼鳞表面富含羟基磷灰石的骨质层覆盖，而羟基磷灰石中钙含量很高，因此在提取前需进行脱钙处理以保证胶原蛋白提取率。
表5 几种鱼鳞中各组分的含量
鱼鳞 水分/％ 粗脂肪/％ 灰分/％ 粗蛋白/％
草鱼鱼鳞 13.71 ＜1 29.97 66.05
鲢鱼鱼鳞 15.87 ＜1 25.18 68.77
鲫鱼鱼鳞 13.66 ＜1 34.43 58.62
鲤鱼鱼鳞 14.53 ＜1 27.33 69.41
2.3胶原蛋白肽的均一性
胶原蛋白是完全脱离共价键和次级键束缚的α-肽链，一般约为几千Da至几万Da，相对分子质量分布很宽。而胶原蛋白肽是由两个或两个以上至数百个氨基酸分子通过肽键联结而成的蛋白质结构片段。分为由2～10个氨基酸组成，分子量范围在180～1000Da之间的小肽；由10以上氨基酸组成，分子量范围在180～5000Da之间的多肽。胶原蛋白的功能性由各个胶原蛋白肽起作用，而小分子肽通常发挥高更重要的作用。
图2、表6中，鱼鳞中胶原蛋白的含量占总蛋白的9％左右，胶原蛋白的理化性质随着pH值发生变化。未经酶处理的胶原蛋白粒径分布主要有两个峰，一个是80～90μm处，一个是900～1000μm处，可见此时胶原蛋白分子量范围宽，差距较大。不同蛋白酶在酶解过程中切断胶原蛋白中键位点不同，通过不同酶处理后粒径比较，可以看出碱性蛋白酶处理后的峰分布在10～20μm处，其效果最好。碱性蛋白酶处理后的胶原蛋白肽粒径分布更为均一，其Span值最接近1。胶原蛋白肽的特殊性能使得它比大分子蛋白和小分子氨基酸的生物功能更加优异，均一性程度高的胶原蛋白肽具有更深的应用潜力和更广的应用范围。
表6 不同酶制备鱼鳞胶原蛋白肽的粒径径距
Figure GDA0002600977950000072
Figure GDA0002600977950000081
表7 碱性蛋白酶不同酶解时间的鱼鳞胶原蛋白肽粒径径距
碱性蛋白酶酶解时间 0h 0.5h 1h 1.5h 2h
径距(Span) 13.47 1.06 1.57 2.02 2.05
在碱性蛋白酶最适温度、最适pH条件下酶解反应0h、0.5h、1h、1.5h、2h，通过处理不同时间后粒径分布比较(图3、表7)，峰的高度代表同一分子量的肽体积占比，中等分子量的肽更集中，可以看出酶解0.5h最佳。综合找到最适酶及酶解条件为37℃下碱性蛋白酶酶解0.5h，得到的胶原蛋白肽均一性最佳。
2.4胶原蛋白肽的分子量
采用LC-MS/MS分析出胶原蛋白肽序列，将不同肽段排序，得到各肽段分子量分布如图4所示。经碱性蛋白酶处理后的产物其肽段分子量分布更均一，分子量更小；经胃蛋白酶处理后的产物其肽段分子量分布跨度大；经中性蛋白酶处理后的产物其肽段分子量介于二者之间。
用SDS-PAGE对水解前后样品进行电泳分析，所得电泳图如图5所示。未经酶处理的原液分子量集中在95kDa以上，说明鲈鱼胶原蛋白分子量较大，不太利于人体直接吸收利用。经不同酶处理后，胶原蛋白样品由于酶切作用，得到的肽段分子量均有不同程度变小。经碱性蛋白酶处理后的产物其肽段分子量较小；经中性蛋白酶处理后的产物和胃蛋白酶处理后的产物的肽段分子量减小程度小于碱性蛋白酶处理后的产物。分子量较小的胶原蛋白肽可显著提高其生物利用性，更有利于被人体吸收利用。
2.5贮藏过程巯基含量变化
巯基是蛋白质中重要的功能基团，具有很高的抗氧化活性。半胱氨酸的巯基基团是最容易被氧化的基团之一，巯基被氧化时，两个巯基脱水形成一个二硫键(-s-s-)，所以蛋白肽粉的湿度也会随着贮藏时间的延长而增大。具体见图6，随胶原蛋白粉贮藏时间的延长及湿度梯度的影响，在氧化过程中，巯基被不断氧化形成二硫键，蛋白肽粉中的巯基不断减少，二硫键不断增多。巯基含量的变化趋势说明随着贮藏时间的延长，巯基含量逐渐降低(p<0.05)；随着贮藏湿度的提升，巯基被氧化的速率加快。在50％RH贮藏环境下巯基含量降低速率较缓，稳定性最好。
2.5贮藏过程内源荧光变化
蛋白质含有的芳香族氨基酸残基在一定激发波长的激发光下会产生荧光，为内源荧光，主要是由色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)残基形成的。研究单个氨基酸活性也发现Trp与Tyr抗氧化活性较强。图7可知，随着胶原蛋白肽贮藏时间的延长，其内源荧光强度逐渐下降，并且在第7天到第14天，内源荧光强度降低程度最大。在第0天到第7天，最大荧光峰有一定程度红移，而在第7天之后一直到第28天，最大荧光峰有一点程度蓝移。在贮藏时间相同不同湿度下，湿度越大内源荧光强度越小。色氨酸残基具有最低的单电子氧化势能，很容易被氧化进而转化成为犬尿氨酸，从而使得内源荧光程度下降。Chen等人在研究过氧自由基氧化大豆蛋白结构时发现，大豆蛋白最大荧光峰位与氧化程度相关，当蛋白质氧化程度较低时,最大荧光峰位向长波长方向移动(红移)，表明蛋白质结构去折叠，之前位于蛋白质内部的色氨酸残基暴露于亲水环境中；当蛋白质氧化程度较高时，最大荧光峰位向短波长方向移动(蓝移)，表明之前暴露于亲水环境中色氨酸残基由于疏水相互作用折叠到疏水环境中。因此，胶原蛋白肽在贮藏过程中内源荧光强度下降，并且最大荧光峰先出现红移后出现蓝移是由于色氨酸先暴露、后被氧化修饰以及氧化聚集引起的。
2.6贮藏过程色度变化
不同贮藏湿度下随贮藏时间的变化胶原蛋白肽的亮度(L*)、红/绿(+a*/-a*)度、黄/蓝(+b*/-b*)如表8所示。同一湿度下，随着贮藏时间的延长，L*值逐渐变小，胶原蛋白肽粉末的亮度逐渐变暗；a*值逐渐变大，色调逐渐偏向红色；b*值逐渐变大，彩度黄色不断加深。贮藏相同时间，随着贮藏湿度的增大，L*值逐渐变小，胶原蛋白肽粉末的亮度逐渐变暗；a*值逐渐变大，色调逐渐偏向红色；b*值逐渐变大，彩度黄色不断加深。不同湿度下，随着贮藏时间的延长，50％湿度下L*、a*、b*值的变化差异不显著(p＞0.05)，相对于其他贮藏湿度下的L*、a*、b*值的变化较小，70％、90％湿度下的L*、a*、b*值发生显著变化(p<0.05)。
表8 不同湿度下不同贮藏时间L*、a*、b*值
Figure GDA0002600977950000091
Figure GDA0002600977950000101
2.7贮藏过程感官鉴评
对贮藏期间的胶原蛋白肽进行感官鉴评，贮藏周期为四周，鉴评频率为每隔7d一次，每次鉴评人员为10人，依据表1中各项指标的参考标准进行鉴评。由图8显示，随着贮藏时间的延长，胶原蛋白肽的表征颜色由白色逐渐变为淡黄色，颜色变化与色度仪测定的L*值逐渐变小，胶原蛋白肽粉末的亮度逐渐变暗的结果正相关；嗅觉腥味在贮藏前三周基本无明显变化，有少许腥味，从第四周开始，由于巯基的不断氧化，腥味逐渐消去；粉末颗粒在贮藏过程中会少部分聚集在一起，造成颗粒在视觉状态下变大，减小了细腻均匀程度，但颗粒状态在贮藏期间基本无明显变化；口感在贮藏期间也无明显变化，有鲜味，略有苦味。
3.结论
鲈鱼鱼鳞胶原蛋白肽最佳制备条件为碱性蛋白酶在37℃下酶解30分钟，得到胶原蛋白肽分子量较小，且均一性及稳定性较好。在胶原蛋白肽粉贮藏期间，随贮藏时间的延长，胶原蛋白肽粉颜色会缓慢变黄，巯基含量逐渐降低，内源荧光发生显著变化，感官特性在口感上变化不大，在颜色、腥味、颗粒状态方面有较大差异。在不同的湿度条件下，50％RH湿度条件下胶原蛋白粉的贮藏稳定性最好，显著优于在其余两种湿度条件下贮藏。
实施例2淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法中步骤3)搅拌条件研究
采用实施例1最佳酶解条件：碱性蛋白酶在37℃下酶解30分钟，其他同实施例1中，1.2.1鱼鳞胶原蛋白原液制备，改变其中脱钙后的搅拌条件。具体见表9。
表9
Figure GDA0002600977950000102
Figure GDA0002600977950000111
由表9说明：在提取温度为70℃，提取时间为6h时，相对提取率最高，在最佳提取温度条件下，在提取时间为6h的基础上，再继续延长提取时间，提取率并未出现明显提高，考虑到工业化生产，不宜采取在最佳条件下继续延长提取时间，会提高生产成本。
实施例3淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法中步骤1)发酵条件的研究
采用实施例1最佳酶解条件：碱性蛋白酶在37℃下酶解30分钟，其他同实施例1中，1.2.1鱼鳞胶原蛋白原液制备，所述步骤1)中，蒸馏水清洗前，加入酵母菌进行发酵处理，鲈鱼鱼鳞与酵母菌的质量比为100:(0.5-1.5)，置于25-35℃下发酵处理为3～4小时，改变其中酵母发酵条件。具体见表10。
表10 鱼鳞胶原蛋白肽的粒径径距
Figure GDA0002600977950000112
由表10说明：经过酵母发酵前处理，可以缩短鱼鳞胶原蛋白肽的粒径径距，这可能是因为酵母菌对鱼鳞胶原蛋白肽进行了预分解处理，进而有利于在后期酶解过程中，增加酶解的位点，使得径距变小，另外，经过酵母微发酵处理，还可以有去除腥味的作用。
此外，需要说明的是，本说明书中所描述的以上内容仅仅是对本发明所作的举例说明。凡依据本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效变化或者简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的内容或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种鲈鱼鱼鳞胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1）称取干燥鲈鱼鱼鳞，加入酵母菌进行发酵处理，鲈鱼鱼鳞与酵母菌的质量比为100:（0.5-1.5），置于25-35℃下发酵处理为3~4小时，用蒸馏水冲洗；
2）加入NaOH溶液进行脱杂蛋白处理，鲈鱼鱼鳞与NaOH溶液的料液比为w/v=1:10~1:8，NaOH溶液浓度为0.08~0.12mol/L，脱杂蛋白处理温度为20~30℃，处理时间为4~5小时，用蒸馏水洗涤至中性；
3）再加入HCl溶液进行脱钙处理，鲈鱼鱼鳞与HCL溶液的料液比为w/v=1:10~1:8，HCl溶液浓度为0.4~0.6mol/L，脱杂处理温度为20~30℃，处理时间为1.5~2小时，再用蒸馏水洗涤至中性；
4）脱钙后湿鱼鳞:水=1:5~1:4(w/v)混合，搅拌温度为70~75℃，搅拌时间为6~7小时搅拌，用纱布过滤，得滤液为胶原蛋白原液，冷冻保存备用；
5）将胶原蛋白原液中加入酶量进行酶解反应，酶加入量为蛋白原液质量的0.50%-1.00%，酶为碱性蛋白酶，酶解pH为 9~10，酶解温度为35~40℃, 酶解时间为30~40min，结束后置于沸水浴中终止酶解反应，得到胶原蛋白肽酶解液；
6）用超滤设备对酶解液进行超滤，得到胶原蛋白肽液；
7）用冷冻干燥机对肽液进行冷冻干燥，然后用气流粉碎机进行处理，得到胶原蛋白肽粉。
CN202010387476.0A 2020-05-09 2020-05-09 一种淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽粉的制备方法 Active CN111621537B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010387476.0A CN111621537B (zh) 2020-05-09 2020-05-09 一种淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽粉的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010387476.0A CN111621537B (zh) 2020-05-09 2020-05-09 一种淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽粉的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111621537A CN111621537A (zh) 2020-09-04
CN111621537B true CN111621537B (zh) 2022-06-14

Family

ID=72269738

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010387476.0A Active CN111621537B (zh) 2020-05-09 2020-05-09 一种淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽粉的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111621537B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112851758B (zh) * 2021-01-27 2022-03-22 华南农业大学 一种罗非鱼鳞促骨形成肽及其应用
CN112680493A (zh) * 2021-02-04 2021-04-20 海南华研胶原科技股份有限公司 一种鱼鳞酶解提取大分子胶原蛋白肽的方法
CN113135992A (zh) * 2021-05-11 2021-07-20 首曜(江苏)生物科技有限公司 一种鱼鳞胶原蛋白肽制备方法
CN114680297B (zh) * 2021-09-28 2023-08-01 黄山学院 一种臭鳜鱼生物保鲜液及低盐臭鳜鱼的生产方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102839207A (zh) * 2012-09-17 2012-12-26 温州大学 一种从鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法
CN104726527A (zh) * 2015-03-24 2015-06-24 宁德市夏威食品有限公司 鱼鳞酶解生产胶原蛋白的制备工艺

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102839207A (zh) * 2012-09-17 2012-12-26 温州大学 一种从鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法
CN104726527A (zh) * 2015-03-24 2015-06-24 宁德市夏威食品有限公司 鱼鳞酶解生产胶原蛋白的制备工艺

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Isolation and characterization of collagen from fish waste material-skin scales and fins of Catla catla and Cirrhinus mrigala;Shahid M;《J food sci technol》;20150731;第4296-4305页 *
微生物制剂发酵法脱除鱼鳞胶原蛋白肽腥味工艺研究;沈瑞敏等;《中国酿造》;20200319;第173-176页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111621537A (zh) 2020-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111621537B (zh) 一种淡水鱼鱼鳞胶原蛋白肽粉的制备方法
Bennett et al. Properties of subunits and aggregates of blue-green algal biliproteins
Davis Jr et al. Total luminescence spectroscopy of fluorescence changes during aging in Caenorhabditis elegans
CN108456244B (zh) 玉米抗氧化活性肽及其制备方法
Braddock et al. Reaction of autoxidizing linoleate with coho salmon myosin
CN104356200B (zh) 一种抗氧化肽及其制备方法
Gambuti et al. Partial dealcoholisation of red wines by membrane contactor technique: influence on colour, phenolic compounds and saliva precipitation index
CN1882696A (zh) 含有血红蛋白的试样中的底物的测定方法
Tan et al. Changes in physicochemical and antioxidant properties of egg white during the Maillard reaction induced by alkali
CN104402972B (zh) 一种海参抗氧化肽及其制备方法
CN107988297A (zh) 一种酒糟小分子肽的制备方法及酒糟小分子肽在护肤品中的应用
Li et al. Effect of alkaline electrolyzed water on physicochemical and structural properties of apricot protein isolate
CN112033943B (zh) 一种基于量子点-铜离子荧光基底传感器的精氨酸检测方法
CN106701875B (zh) 一种淡水鱼抗氧化物活性肽的制备方法
Mörschel et al. Multiple forms of phycoerythrin-545 from Cryptomonas maculata
Nirmala et al. Physico‐chemical and functional properties of proteins from spray dried algae (Spirulina platensis)
CN112521477B (zh) 一种天然肉制品抗氧化护色剂的制备方法及应用
Feng et al. Determination of proteins at nanogram levels with their enhancement effects of resonance light-scattering on quercetin
CN106124599A (zh) 一种蛋白质双向电泳方法及其应用
Harmsen Identification of fluorescing and uv absorbing substances in Pieris brassicae L.
CN112557361A (zh) 一种利用干热大豆分离蛋白为模型分析杂环胺形成机理的方法
CN112326568B (zh) 一种高抗氧化性鱼露生产原料的判定方法
Qin et al. Ultrasound-assisted macroporous resin treatment improves the color and functional properties of sunflower meal protein
CN110132917A (zh) 一种钴氮双掺杂碳点及其制备方法和应用
Newkirk et al. Isolation and Properties of a Fluorescent Pigment from Pseudomonas mildenbergii

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant