CN102520186B - 一种用于鲤鱼雌雄鉴别的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鲤鱼雌雄鉴别的方法，以斑马鱼BMP4基因序列为模版成功获得鲤鱼BMP4基因的cDNA序列，并在此基础上获得了鲤鱼BMP4基因的多克隆抗体，通过western技术检测发现：雄鱼可以检测到BMP4基因的表达，而雌鱼却无法检测到BMP4基因的表达，从而通过BMP4基因表达的检测可将鲤鱼雌雄鉴别开来，这也就为鲤鱼的早期雌雄鉴别提供了检测技术。

Description

一种用于鲤鱼雌雄鉴别的方法

技术领域

本发明涉及一种用于鲤鱼雌雄鉴别的方法。

背景技术

目前，在鲤鱼生产和育种过程中，性别对鲤鱼的生长速度有明显的影响，一般而言，鲤鱼在10g以后的各个阶段，雌鱼平均的生长速度均快于雄鱼，因此，如果在早起能够进行雌雄鉴别，养殖户将显著的提高经济效益，而对于鲤鱼育种，早期鉴别可进行鲤鱼的二次选择，也可大大节约育种成本。

对雌雄鲤鱼特异性的分子标记，可用于鲤的分子育种中，先用特异性分子标记区分雌雄鱼，然后再进行设计育种，但是能够用蛋白检测的方法区分雌雄鲤鱼的研究还未见报道。

GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。因为GAPDH 作为看家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，因此在使用GAPDH内参抗体时，将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的GAPDH含量相除，得到每个样品目的蛋白的相对含量，然后才进行样品与样品之间的比较。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种用于鲤鱼雌雄鉴别的方法，该处理方法可以进行鲤鱼早起的性别鉴别。

本发明为实现上述目的，采用如下技术方案：

1、一种用于鲤鱼雌雄鉴别的方法，其特征在于按如下步骤实现：

（1）提取雌雄鲤总RNA；

（2）获得鲤鱼Cyprinus carpioBMP4基因cDNA序列：根据斑马鱼BMP4基因序列Genbank 登录号NM_131342设计引物序列为上游引物：F:5’- gatacccgaggaagggaaga-3’；

下游引物：R:5’- ggggtgtggctgccgctaaa -3’，获得鲤鱼的BMP4的cDNA，并根据上述cDNA对应氨基酸序列设计多肽，合成多肽，并对多肽进行修饰获得鲤鱼BMP4多肽，其氨基酸序列为QVLLGESSYASLIPEEGKc，其中c为增加的cys，用于多肽偶联；

（3）用鲤鱼BMP4多肽免疫新西兰大白兔，制备兔抗BMP4血清；

（4）用BMP4多肽对兔血清进行抗原亲和纯化，纯化后获得鲤鱼BMP4多克隆抗体，抗体进行ELISA效价检测，结果显示，ELISA Titer大于1:128000；

（5）用鲤鱼BMP4多克隆抗体western技术检测雌雄鲤鱼背部肌肉中BMP4基因的表达，结果显示雄性鲤鱼有BMP4蛋白的表达，而在雌性鲤鱼中没有检测到BMP4蛋白的表达。

具体来说：

首先获得高质量的鲤鱼BMP4抗体，其次，成功提取雌雄鲤鱼胸肌蛋白；然后用已检测的鲤鱼BMP4抗体对目标鲤鱼的胸肌蛋白进行检测，用GAPDH做目标蛋白的对照，如果能检测到55KD的蛋白，则为雄性鲤鱼，如果检测不到，则为雌性鲤鱼。

有益效果：我们在做BMP4在鲤鱼不同肌肉部位分布时发现雌雄鲤背部肌肉BMP4蛋白表达水平差异显著，因此，我们认为可以从BMP4蛋白水平上区分鲤鱼的雌雄，可用于分子育种，也可用于雌雄鱼在BMP4相关路径上的区别以及由于BMP4蛋白表达水平的不同因此雌雄鱼其它生理功能上的差别。

附图说明：图1为通过本方法进行鲤鱼雌雄鉴别的结果，其中1为雌性鲤鱼胸肌，2为雄性鲤鱼胸肌。

具体实施方式

材料：GAPDH蛋白抗体，鼠二抗，兔二抗购自吉尔生化（上海）有限公司；

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

（1）雌雄鲤（各5尾）取自中国水产科学研究院无锡淡水渔业研究中心宜兴养殖基地，取胸肌组织，液氮速冻后放置于-80°C冰箱冻存，以便于总RNA的提取。总RNA的提取按照RNAiso Plus操作说明书进行，提取完成后用DEPC水溶解。经琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取情况，分光光度法检测RNA的浓度，然后用反转录试剂盒把RNA反转录成cDNA，用于后续的PCR反应或-20°C保存，其余的RNA放于-80°C冰箱保存。

（2）获得鲤鱼（Cyprinus carpio）BMP4基因cDNA序列：根据斑马鱼BMP4基因序列（Genbank 登录号NM_131342）设计引物序列为上游引物：F:5’- gatacccgaggaagggaaga-3’；下游引物：R:5’- ggggtgtggctgccgctaaa -3’，

获得鲤鱼BMP4基因序列：

CTGTCGAGACATCATGATTCCTGGTAATCGAATGCTGATGGTCATTTTATTATGCCAAGTCCTACTGGGAGAGAGCAGCTATGCTAGTCTAATACCCGAGGAAGGGAAGAAGAAAGCGTCGGCTCAGCACCTGGGTCAGAGTCATGAACTGCTGCGGGACTTTGAAGCCACGCTGCTGCACATGTTTGGGCTGCAGAGGCGACCGCGACCCAGCTACTCGGCTGTGGTGCCCCAGTATCTGCTGGACCTGTATCGCCTGCAGTCAGGGGAGGCCGAAGAGGCCGGGGCCCACGACGTGAGCTTCGATTATCCCGAAAGGTCCACGAGTCGAGCAAACACTGTGAGAGGATTCCATCACGAAGAGCACATGGAAGAGCTGCAGTCAGACGGCTCACCGGAGACTCCTCTGCGCTTCGTCTTCAATCTCAGCAGCATCCCAGAGGAGGAACTCATTTCTACTGCAGAGCTTCGTATCTACAGGCAACAGATAGATGATGCAATCTCAGATCCCCAACCCACGGGAGACGACGGTCTACACCGAATAAACATATACGAGGTGCTGAAGCCCCCGCGGGCCGGGCAGCTCATCACGCAGCTGCTGGACACTCGACTGGTGCGCCACAACACGACCCAATGGGAGAGCTTTGACGTGAGCTCAGCCGTACTGCGCTGGACCCGTGACAAGAGCTCCAATCACGGCCTGGCTGTGGAGGTGGTGCCCCTGAACCGAACCTCGCATCACCAGGGACGCCACGTACGCGTAAGTCGCTCCTTGCATCCGCTTCCAGATGCAGACTGGAGCCAGCTTCGCCCCCTGCTGGTCACGTTCGGGCATGACGGCAAAAGTCACCCACTGACGCGGCGAGCGAAACGCAGCCCGAAGCAAAGAGGTCGCAAGCGCAACCGAAACTGTCGGCGGCACGCGCTTTATGTGGACTTCAGCGACGTGGGCTGGAACGACTGGATCGTGGCGCCGCCCGGATATCAGGCGTACTACTgTCACGGGAGTGTCCCTTTCCATTAGCCGATCATCTCAACTCCACCAATCACGCTATCGTACAGACACTGGTGAACTCGGTGAACACCAATATCCCCAAAGCCTGCTGCGTGCCCACTGAGCTCAGCGCAATCTCCATGCTTTACCTGGACGAAACGGACAGGGTGGTGCTGAAAAACTATCAGGAGATGGTGGTCGAGGGGTGTGGCTGCCGCTAAA；

根据鲤鱼BMP4基因的氨基酸序列为

MIPGNRMLMVILLCQVLLGESSYASLIPEEGKKKASALHLAQSH                

ELLRDFEATLLHMFGLQRRPRPSHSAVVPQYLLDLYRLQSGELEEAGAQHVSFDYPER         STSRANTVRGFHHEEHLEELQSDGSQETPLRFVFNLSSIPEDELISTAELRVYRQQID                DAFSDPDQTGDHGLHRINIYEVLKAPREGQLITQLLDTRLVRHNTSKWESFDVSPAVL           RWTQEKRSNHGLAVEVVQMKRNPVQKGRHVRVSRSVHPLPDEEWDQLRPLLVTFGHDG    KSHPLTRRAKRSPKQRGRKRNRNCRRHALYVDFSDVGWNDWIVAPPGYQAYYCHGECP     FPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNTNIPKACCVPTELSAISMLYLDETDRVVLKNYQEM           VVEGCGCR，设计多肽，合成多肽，并对多肽进行修饰获得鲤鱼BMP4多肽，其氨基酸序列为QVLLGESSYASLIPEEGKc（其中c为增加的cys，用于多肽偶联）；

（3）在（2）的基础上，上述的鲤鱼BMP4多肽免疫新西兰大白兔，5次加强免疫，制备兔抗BMP4血清；

（4）在（3）基础上，用BMP4多肽对兔血清进行抗原亲和纯化，纯化后获得鲤鱼BMP4多克隆抗体，抗体进行ELISA效价检测，结果显示，ELISA Titer大于1:128000；

（5）用鲤鱼BMP4多克隆抗体western技术检测雌雄鲤鱼背部肌肉中BMP4基因的表达，结果显示雄性鲤鱼有BMP4蛋白的表达，而在雌性鲤鱼中没有检测到BMP4蛋白的表达。

其中鲤鱼BMP4多克隆抗体western技术检测方法如下：

1.      总蛋白抽提  

1)      每个样分别取约50㎎鲤鱼组织，放入细胞裂解液中（碧云天-western及IP细胞裂解液）；

2)      用剪刀剪碎组织，然后用匀浆器匀浆；

3)      匀浆均匀后12，000rpm离心10min；

4)      将上清液转移到一新离心管中，加6×Loading Buffer；

5)      100℃加热煮沸，冰上放置5min，如此重复3次，然后-20℃储存。 

电泳

1）  SDS-PAGE胶制备：

根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的胶，具体体系如下：

选择分离胶浓度10%，浓缩胶浓度5%。

2）  上样：等胶凝固好后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样。

3）  电泳：恒压80V，45min之后恒压120V，1h。

免疫印迹

电泳结束后，将PAGE胶从玻板上卸下，装配转膜三明治，恒流300mA 条件下湿转90min，将蛋白转移到NC膜上。

免疫发光

1)        封闭：用封闭液（含5% 奶粉的PBST溶液）室温封闭1h； 

2)        孵育一抗：用新配制的封闭液稀释一抗

GAPDH蛋白抗体稀释比1:5000。

鲤鱼BMP4多克隆抗体稀释比1:50。

3)        4℃ 孵育膜过夜；

4)        洗膜：用PBST洗膜30min：第一次洗15min，第二，三，四次各洗5min；

5)        孵育二抗：用封闭液稀释各蛋白一抗对应的二抗（鼠二抗1:2000，兔二抗1:5000）。

6)        室温下孵育膜1h。

7)        洗膜：用PBST洗膜30min：第一次洗15min，第二，三，四次各洗5min；

8)      X光显影：在暗室中将膜置于平铺好的保鲜膜上，按1：1比例混合A液和B液（Thermo，supersignal west pico），将混合液均匀滴加于膜上，反应60s。

9)      将膜在吸水纸上沥干多余的ECL底物反应液，置于平板上，铺上保鲜膜，用保鲜膜包裹NC膜（避免产生气泡），放入暗盒，再放上适当大小的X光片，关闭暗盒，曝光。

10)     取出X光片，放入显影液中，待条带显好后取出，在清水中漂洗一下，放入定影液中定影。

11)    取出X光片，晾干，拍照记录。

综合以上步骤，我们可以得到，以斑马鱼BMP4基因序列为模版成功获得鲤鱼BMP4基因的cDNA序列，并在此基础上获得了鲤鱼BMP4基因的多克隆抗体，通过western技术检测发现：雄鱼可以检测到BMP4基因的表达，而雌鱼却无法检测到BMP4基因的表达，从而通过BMP4基因表达的检测可将鲤鱼雌雄鉴别开来，这也就为鲤鱼的早期雌雄鉴别提供了检测技术。[0027]  

                          SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

 

<120>  一种用于鲤鱼雌雄鉴别的方法

 

<130> 

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gatacccgag gaagggaaga                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ggggtgtggc tgccgctaaa                                                 20

 

 

<210>  3

<211> 1216

<212>  DNA

<213>  鲤鱼的BMP4基因

 

<400>  3

ctgtcgagac atcatgattc ctggtaatcg aatgctgatg gtcattttat tatgccaagt     60

 

cctactggga gagagcagct atgctagtct aatacccgag gaagggaaga agaaagcgtc    120

 

ggctcagcac ctgggtcaga gtcatgaact gctgcgggac tttgaagcca cgctgctgca    180

 

catgtttggg ctgcagaggc gaccgcgacc cagctactcg gctgtggtgc cccagtatct    240

 

gctggacctg tatcgcctgc agtcagggga ggccgaagag gccggggccc acgacgtgag    300

 

cttcgattat cccgaaaggt ccacgagtcg agcaaacact gtgagaggat tccatcacga    360

 

agagcacatg gaagagctgc agtcagacgg ctcaccggag actcctctgc gcttcgtctt    420

 

caatctcagc agcatcccag aggaggaact catttctact gcagagcttc gtatctacag    480

 

gcaacagata gatgatgcaa tctcagatcc ccaacccacg ggagacgacg gtctacaccg    540

 

aataaacata tacgaggtgc tgaagccccc gcgggccggg cagctcatca cgcagctgct    600

 

ggacactcga ctggtgcgcc acaacacgac ccaatgggag agctttgacg tgagctcagc    660

 

cgtactgcgc tggacccgtg acaagagctc caatcacggc ctggctgtgg aggtggtgcc    720

 

cctgaaccga acctcgcatc accagggacg ccacgtacgc gtaagtcgct ccttgcatcc    780

 

gcttccagat gcagactgga gccagcttcg ccccctgctg gtcacgttcg ggcatgacgg    840

 

caaaagtcac ccactgacgc ggcgagcgaa acgcagcccg aagcaaagag gtcgcaagcg    900

 

caaccgaaac tgtcggcggc acgcgcttta tgtggacttc agcgacgtgg gctggaacga    960

 

ctggatcgtg gcgccgcccg gatatcaggc gtactactgt cacgggagtg tccctttcca   1020

 

ttagccgatc atctcaactc caccaatcac gctatcgtac agacactggt gaactcggtg   1080

 

aacaccaata tccccaaagc ctgctgcgtg cccactgagc tcagcgcaat ctccatgctt   1140

 

tacctggacg aaacggacag ggtggtgctg aaaaactatc aggagatggt ggtcgagggg   1200

 

tgtggctgcc gctaaa                                                   1216

 

 

<210>  4

<211>  400

<212>  PRT

<213>  BMP4基因的氨基酸序列

 

<400>  4

 

Met Ile Pro Gly Asn Arg Met Leu Met Val Ile Leu Leu Cys Gln Val

1               5                   10                  15     

 

 

Leu Leu Gly Glu Ser Ser Tyr Ala Ser Leu Ile Pro Glu Glu Gly Lys

            20                  25                  30         

 

 

Lys Lys Ala Ser Ala Leu His Leu Ala Gln Ser His Glu Leu Leu Arg

        35                  40                  45              

 

 

Asp Phe Glu Ala Thr Leu Leu His Met Phe Gly Leu Gln Arg Arg Pro

    50                  55                  60                 

 

 

Arg Pro Ser His Ser Ala Val Val Pro Gln Tyr Leu Leu Asp Leu Tyr

65                  70                  75                  80 

 

 

Arg Leu Gln Ser Gly Glu Leu Glu Glu Ala Gly Ala Gln His Val Ser

                85                  90                  95     

 

 

Phe Asp Tyr Pro Glu Arg Ser Thr Ser Arg Ala Asn Thr Val Arg Gly

            100                 105                 110        

 

 

Phe His His Glu Glu His Leu Glu Glu Leu Gln Ser Asp Gly Ser Gln

        115                 120                 125            

 

 

Glu Thr Pro Leu Arg Phe Val Phe Asn Leu Ser Ser Ile Pro Glu Asp

    130                 135                 140                

 

 

Glu Leu Ile Ser Thr Ala Glu Leu Arg Val Tyr Arg Gln Gln Ile Asp

145                 150                 155                 160

 

 

Asp Ala Phe Ser Asp Pro Asp Gln Thr Gly Asp His Gly Leu His Arg

                165                 170                 175    

 

 

Ile Asn Ile Tyr Glu Val Leu Lys Ala Pro Arg Glu Gly Gln Leu Ile

            180                 185                 190        

 

 

Thr Gln Leu Leu Asp Thr Arg Leu Val Arg His Asn Thr Ser Lys Trp

        195                 200                 205            

 

 

Glu Ser Phe Asp Val Ser Pro Ala Val Leu Arg Trp Thr Gln Glu Lys

    210                 215                 220                

 

 

Arg Ser Asn His Gly Leu Ala Val Glu Val Val Gln Met Lys Arg Asn

225                 230                 235                 240

 

 

Pro Val Gln Lys Gly Arg His Val Arg Val Ser Arg Ser Val His Pro

                245                 250                 255    

 

 

Leu Pro Asp Glu Glu Trp Asp Gln Leu Arg Pro Leu Leu Val Thr Phe

            260                 265                 270        

 

 

Gly His Asp Gly Lys Ser His Pro Leu Thr Arg Arg Ala Lys Arg Ser

        275                 280                 285            

 

 

Pro Lys Gln Arg Gly Arg Lys Arg Asn Arg Asn Cys Arg Arg His Ala

    290                 295                 300                

 

 

Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala

305                 310                 315                 320

 

 

Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Tyr Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro

                325                 330                 335    

 

 

Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu

            340                 345                 350        

 

 

Val Asn Ser Val Asn Thr Asn Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr

        355                 360                 365            

 

 

Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Thr Asp Arg Val

    370                 375                 380                

 

 

Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg

385                 390                 395                 400

 

 

<210>  5

<211>  19

<212>  PRT

<213>  鲤鱼BMP4多肽

 

<400>  5

 

Gln Val Leu Leu Gly Glu Ser Ser Tyr Ala Ser Leu Ile Pro Glu Glu

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Lys Cys

           

 

                       

Claims (1)

1.一种用于鲤鱼雌雄鉴别的方法，其特征在于按如下步骤实现：

（1）提取雌雄鲤总RNA；

（2）获得鲤鱼Cyprinus carpioBMP4基因cDNA序列：根据斑马鱼BMP4基因序列Genbank登录号为NM_131342，设计引物序列为上游引物：F:5’- gatacccgaggaagggaaga-3’；

下游引物：R:5’- ggggtgtggctgccgctaaa -3’，获得鲤鱼的BMP4的cDNA，并根据上述cDNA对应氨基酸序列设计多肽，合成多肽，并对多肽进行修饰获得鲤鱼BMP4多肽，其氨基酸序列为QVLLGESSYASLIPEEGKc，其中c为增加的cys，用于多肽偶联；

（3）用鲤鱼BMP4多肽免疫新西兰大白兔，制备兔抗BMP4血清；

（4）用BMP4多肽对兔血清进行抗原亲和纯化，纯化后获得鲤鱼BMP4多克隆抗体，抗体进行ELISA效价检测，结果显示，ELISA Titer大于1:128000；

（5）用鲤鱼BMP4多克隆抗体western技术检测雌雄鲤鱼背部肌肉中BMP4基因的表达，结果显示雄性鲤鱼有BMP4蛋白的表达，而在雌性鲤鱼中没有检测到BMP4蛋白的表达。

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