CN108103014A - 一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法,其包括如下步骤:取足月脐带,鉴定符合要求后方可用;将脐带剪成组织段,剥离华通胶,将华通胶剪成块状;采用双酶法消化脐带组织块;过滤收集细胞,使用含有脐血血浆的培养基培养与扩增间充质干细胞;采用饥饿培养法,制备上清液;在上清液中加入保护剂进行保藏。本发明提供的脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法确保在4℃存放15天后,干细胞上清中的蛋白含量无明显变化,延长干细胞培养上清液在4℃的存放时间,降低干细胞培养上清的运输成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种脐带间充质干细胞培养 上清液的保藏方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种能够进行自 我更新、多分化潜能的多能干细胞,可以向神经细胞、心肌细胞、肌 细胞等多种终末组织器官的细胞分化,其在细胞替代治疗、支持造血、 基因治疗等方面有着广泛的应用前景。
脐带是连接胎儿和胎盘的管状结构,有两条动脉和一条静脉。研 究显示,在脐带血管和内壁之间含有疏松的胶状物质(称为华通胶), 该胶状物质里含有丰富的脐带间充质干细胞。从脐带分离出来的干细 胞更原始,有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低,大大 降低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微 生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单,对产妇及新生儿无任 何危害及损伤。以上原因使得脐带间充质干细胞成为研究的热点。
目前已报道的脐带间充质干细胞分泌成分主要分为3类:1、细 胞外基质类,如各种胶原蛋白和弹性蛋白等,可促进细胞外基质的重 塑;2、生长因子类,如TGF、HGF、VEGF和bFGF等;3、炎症因 子及趋化因子类,如PGE2、IL-6、IL-8等。由于脐带间充质干细胞 能够分泌多种因子,因此,越来越多的研究集中在干细胞的旁分泌作 用,研究表明,干细胞旁分泌作用对皮肤损伤修复,参与机体的免疫 应答反应等方面具有重要的作用。
脐带间充质干细胞分泌的多种因子多为蛋白成分,如何确保干细 胞上清中有效因子的含量,是目前急需解决的问题,也是直接影响干 细胞临床应用的瓶颈之一,目前延长蛋白保存时间的唯一有效的方法 是降低保存温度,常用的是-20℃以下温度保存,这也给蛋白类物质 的运输增加了成本,本发明立足于延长脐带间充质干细胞培养上清液 冷藏时的存放时间,确保干细胞分泌因子的含量,为临床使用干细胞 分泌因子提供可能。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明提供了一种脐带间充质干细胞培 养上清液的保藏方法。
本发明第一方面提出一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏 方法,包括如下步骤:
(1)取足月健康胎儿脐带,用胶体金、荧光定量PCR相结合的 方法检测脐带血清HbsAg,抗-HCV,HCV-RNA,抗-HDV,抗HEV, 抗-HIV-1/2,HIV-1-RNA,CMV-DNA,检测结果均为阴性的脐带方 可使用;
(2)将脐带剪开,平铺,用PBS缓冲液清洗脐带组织至无血色;
(3)将步骤(2)获得的脐带组织剪成组织段,然后剥离所述组 织段的华通胶,并将华通胶置于洁净的器皿中,用手术剪剪成块状;
(4)在步骤(3)获得的块状组织中,先后加入0.1%II型胶原 酶和0.25%胰酶进行消化,使用筛网过滤收集细胞溶液,然后离心, 去掉上清液;
(5)使用含有脐血血浆的培养基重悬步骤(4)获得的细胞沉淀, 放入纤维连结蛋白包被的培养瓶中,加入足量的含有脐血血浆的培养 基,置于CO2培养箱内培养;
(6)在培养后的4~5天进行第一次换液,以后3~4天 换一次液,待细胞融合度达到70%以上后,使用胰蛋白酶进行消化 后传代;
(7)按6000cells/cm2的密度接种P5代脐带间充质干细胞细胞于 培养瓶中,加入含有脐血血浆的培养基进行培养;
(8)待细胞长至80%融合时,使用PBS缓冲液冲洗细胞表面多 次,然后加入DMEM/F12培养基进行饥饿培养;
(9)收集步骤(8)获得的脐带间充质干细胞培养上清液至离心 管中,离心,弃沉淀;
(10)收集步骤(9)获得的上清液,使用5KD的透析袋对干细 胞上清进行浓缩,获取含有5KD以上分子量的有效干细胞分泌混合 因子;以及
(11)在步骤(10)获得的浓缩上清液中加入上清液保护剂,充 分混匀后置于4℃保藏。
根据本发明的一个实施例,步骤(3)所述组织段的长度为2~ 4cm。
根据本发明的一个实施例,步骤(3)所述块状的表面积为1~ 2mm3。
根据本发明的一个实施例,步骤(4)所述消化为先加入0.1%II 型胶原酶消化1小时,再加入0.25%胰酶消化0.5小时。
根据本发明的一个实施例,步骤(8)所述饥饿培养时间为36-72 小时。
根据本发明的一个实施例,所述上清液保护剂含有体积比10% 的甘油或体积比10%的甘露醇。
根据本发明的又一实施例,所述上清液保护剂含有体积比5%的 甘油和体积比5%的甘露醇。
根据本发明的一个实施例,所述含有脐血血浆的培养基为含有体 积比10%的脐血血浆的DMEM/F12培养基。
本发明具有以下有益效果:
(1)本发明提供的脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法, 由于在冷藏时加入了上清液保护剂,显著延长干细胞培养上清液在 4℃存放的时间,降低干细胞培养上清液的运输成本,为临床应用干 细胞分泌因子提供可能。
(2)根据本发明方法在4℃存放15天后,干细胞培养上清液中 的蛋白含量无明显变化,解决了低温冷藏时间长而导致蛋白含量下降 的问题。
(3)本发明采用脐血血浆代替胎牛血清培养脐带间充质干细胞, 避免了干细胞被病原体或其他动物源性成分污染及异种蛋白引起人 体免疫反应等不安全因素,且提高了培养过程中间充质干细胞的增值 速度。
(4)相对于传统组织贴壁法,本发明采用双酶法制备间充质干 细胞,操作简单,耗时少。且本发明采用纤维连结蛋白包被的培养瓶 进行干细胞培养,有助于干细胞更好地贴壁生长。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本申请作进一步详细说明。
实施例
脐血血浆的制备:脐血供者的筛选、脐血采集、处理及检测依照 脐血库标准操作规程完成。在去除血浆的步骤中,无菌操作下留取5 mL上层血浆,置于4℃保存,经细菌、真菌、HBsAg、HBeAg、HCV、 HIV、CMV及梅毒等病原微生物检测为阴性后,方可用于实验。将 至少20份检测合格的脐血血浆等体积混合。4℃1200rpm离心10 分钟,用注射器小心抽取上清,以0.22μm滤膜过滤,分装,-20℃ 保存待用。
1、获取10cm剖腹产新生儿脐带,用胶体金、荧光定量PCR相 结合的方法检测脐带血清HbsAg,抗-HCV,HCV-RNA,抗-HDV, 抗HEV,抗-HIV-1/2,HIV-1-RNA,CMV-DNA,检测结果均为阴性 的脐带方可使用。
2、将脐带剪开,平铺,用3wt%氨基青霉素和硫酸链霉素的PBS 缓冲液清洗脐带组织至无血色。
3、将清洗后的脐带组织剪成长度为2~4cm的组织段,然后 剥离组织段的华通胶,并将华通胶置于洁净的器皿中,用手术剪剪成 1~2mm3的块状。
4、在剪碎的块状组织中,先加入0.1%II型胶原酶消化1小时, 再加入0.25%胰酶消化0.5小时,然后使用200目筛网过滤收集消化 后的细胞溶液,收集滤液,1200rmp离心10分钟,去掉上清液。
5、使用含有体积比10%的脐血血浆的DMEM/F12培养基重悬步 骤(4)获得的细胞沉淀,放入纤维连结蛋白包被的培养瓶中,加入 足量的含有体积比10%的脐血血浆的DMEM/F12培养基,置于 5%CO237℃培养箱内培养。
6、在培养后的4~5天进行第一次换液,以后3~4天换 一次液,待细胞融合度达到70%以上后,使用0.25%胰蛋白酶37℃ 消化2分钟,加入4~5倍体积的培养基终止消化反应,然后1200rpm 离心10分钟,弃上清。沉淀用培养基重悬,以1:3比例传代。
7、按6000cells/cm2的密度接种P5代脐带间充质干细胞细胞于培 养瓶中,加入含有体积比10%的脐血血浆的DMEM/F12培养基,置 于5%CO237℃培养箱内培养。
8、待细胞长至80%融合时,使用PBS缓冲液冲洗细胞表面多2 次,吸尽PBS缓冲液,然后加入无脐血血浆的DMEM/F12培养基进 行饥饿培养72小时。
9、收集步骤8获得的脐带间充质干细胞培养上清液至离心管中, 1200rpm离心5分钟,弃沉淀。
10、收集离心后的上清液,使用5KD的透析袋对干细胞上清液 进行浓缩,获取含有5KD以上分子量的有效干细胞分泌混合因子。
11、在浓缩后的上清液中加入上清液保护剂(本实施例的上清液 保护剂分为三组:①体积比10%甘油、②体积比10%甘露醇、③体积 比5%甘油与5%甘露醇),充分混匀后置于4℃冰箱保藏。
12、存放15天后用CCK-8测定各组干细胞上清液中蛋白的浓度。 结果如表1。
对照例
以不添加上清保护剂的干细胞培养上清液作为对照。制备方法步 骤参考实施例1。
表1:干细胞培养上清液中的蛋白含量
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说 明,不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属 技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可 以做出若干简单推演或替换。
Claims (8)
1.一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
(1)取足月健康胎儿脐带,用胶体金、荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg,抗-HCV,HCV-RNA,抗-HDV,抗HEV,抗-HIV-1/2,HIV-1-RNA,CMV-DNA,检测结果均为阴性的脐带方可使用;
(2)将脐带剪开,平铺,用PBS缓冲液清洗脐带组织至无血色;
(3)将步骤(2)获得的脐带组织剪成组织段,然后剥离所述组织段的华通胶,并将华通胶置于洁净的器皿中,用手术剪剪成块状;
(4)在步骤(3)获得的块状组织中,先后加入0.1%II型胶原酶和0.25%胰酶进行消化,使用筛网过滤收集细胞溶液,然后离心,去掉上清液;
(5)使用含有脐血血浆的培养基重悬步骤(4)获得的细胞沉淀,放入纤维连结蛋白包被的培养瓶中,加入足量的含有脐血血浆的培养基,置于CO2培养箱内培养;
(6)在培养后的4~5天进行第一次换液,以后3~4天换一次液,待细胞融合度达到70%以上后,使用胰蛋白酶进行消化后传代;
(7)按6000cells/cm2的密度接种P5代脐带间充质干细胞细胞于培养瓶中,加入含有脐血血浆的培养基进行培养;
(8)待细胞长至80%融合时,使用PBS缓冲液冲洗细胞表面多次,然后加入DMEM/F12培养基进行饥饿培养;
(9)收集步骤(8)获得的脐带间充质干细胞培养上清液至离心管中,离心,弃沉淀;
(10)收集步骤(9)获得的上清液,使用5KD的透析袋对干细胞上清进行浓缩,获取含有5KD以上分子量的有效干细胞分泌混合因子;
(11)在步骤(10)获得的浓缩上清液中加入上清液保护剂,充分混匀后置于4℃保藏。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述组织段的长度为2~4cm。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述块状的表面积为1~2mm3。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)所述消化为先加入0.1%II型胶原酶消化1小时,再加入0.25%胰酶消化0.5小时。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(8)所述饥饿培养时间为36-72小时。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述上清液保护剂含有体积比10%的甘油或体积比10%的甘露醇。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述上清液保护剂含有体积比5%的甘油和体积比5%的甘露醇。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述含有脐血血浆的培养基为含有体积比10%的脐血血浆的DMEM/F12培养基。
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