CN106236776A - 一种宫内膜干细胞在制备治疗肝脏纤维化药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种宫内膜干细胞在制备治疗肝脏纤维化药物中的应用，所述宫内膜干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞，表达CD29、CD44、CD73和CD90，不表达CD34、CD45、CD117和HLA‑DR。本发明中，宫内膜干细胞获取方便，宫内膜干细胞制剂制备简单，输注技术简便、易操作，改善肝功能和降低肝纤维化效果显著，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。

Description

一种宫内膜干细胞在制备治疗肝脏纤维化药物中的应用
(一)技术领域
本发明涉及肝脏纤维化治疗领域，特别涉及宫内膜干细胞在肝脏纤维化治疗中的用途及其制备方法。
(二)背景技术
肝纤维化是肝炎、慢性酒精中毒、代谢和遗传性等原因引起的慢性肝脏疾病的主要病理特征，其后期导致的肝硬化和肝癌，严重威胁健康和生命。我国是肝炎大国，乙型肝炎尤其是慢性活动性乙型肝炎患者中，10％-15％的患者可能在5-10年内发展为肝炎后肝硬化。原位肝移植是治疗终末期肝硬化的有效手段，但供体缺乏、费用昂贵以及免疫排斥等因素限制了其广泛开展。因此开发有效的肝纤维化治疗药物和手段仍十分迫切。
近年来，干细胞研究的蓬勃发展为组织工程和疾病治疗带来了新思路和希望。宫内膜干细胞是近年来发现的一类成体干细胞，符合间充质干细胞一般标准，可以通过月经血、子宫内膜切除组织和常规诊断性刮宫等方式获取。目前研究证实宫内膜干细胞具有多向分化潜能，并且在心肌梗死、肌营养不良和I型糖尿病等多种疾病的动物模型中展现了积极的作用。此外，宫内膜干细胞还具有取材方便，体外增殖能力强，长期培养稳定性好，免疫原性低，并具有一定的免疫调节能力等一系列优点，是在组织损伤修复和疾病治疗等生物医学领域极具潜在应用价值的一类细胞。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种宫内膜干细胞在制备治疗肝脏纤维化药物中的应用，即利用宫内膜干细胞制成的细胞悬液制剂能够降低肝脏纤维化程度，为宫内膜干细胞提供了一种新用途。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种宫内膜干细胞在制备治疗肝脏纤维化药物中的应用。
进一步，所述宫内膜干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞，表达CD29、CD44、CD73和CD90，不表达CD34、CD45、CD117和HLA-DR。宫内膜干细胞来源于月经血，通过密度梯度离心和贴壁培养分离，收集3-5代细胞备用。
进一步，所述宫内膜干细胞以细胞悬液的形式作用，所述细胞悬液按如下方法制备：将宫内膜干细胞用血清制剂于37℃，5％CO2培养箱中培养24～48小时，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化，生理盐水洗涤后，再用生理盐水悬浮，即为宫内膜干细胞悬液；所述血清制剂是将肝纤维化供试血液于37℃水浴保温30min后，3500rpm离心10min，取上清，再将上清以体积终浓度1-5％的量加入含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、体积浓度1％两性霉素B、体积浓度1％谷氨酰胺和体积浓度20％胎牛血清的DMEM培养液中，即为血清制剂。
进一步，所述宫内膜干细胞悬液中细胞浓度为1～5×107个/ml。
进一步，所述药物用量以宫内膜干细胞个数计为4～20×107个/kg体重，静脉输注，每周1次，连续两周。
在本发明中，供试血液(即肝纤维化动物或患者血清)来源于肝纤维化动物模型或患者血液，经静置和离心后所得上清液。宫内膜干细胞制备的治疗肝脏纤维化药物的实际用法和用量如下：利用生理盐水悬浮宫内膜干细胞，并调整浓度至(1～5)×107个/毫升，然后按照(4～20)×107个/kg体重进行静脉输注，每周1次，连续两周。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明利用四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化小鼠模型，首次证明通过静脉导入宫内膜干细胞制剂能够显著改善肝功能、降低肝纤维化程度。
(四)附图说明
图1是各组天狼猩红染色检测肝脏纤维化图；A，肝组织天狼猩红染色；B，对着色阳性面积进行统计的结果；其中Normal、CCl4、Vehicle和MenSC分别表示正常组、肝纤维化模型组、肝纤维化模型生理盐水注射组、肝纤维化模型宫内膜干细胞注射组。***表示实验组与CCl4损伤组比较差异极显著(P﹤0.001)。Bar＝50μm。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：慢性肝损伤小鼠模型制备
利用10％(体积浓度)四氯化碳(CCl4，溶剂为橄榄油)对八周鼠龄的ICR小鼠(体重约25克)诱导化学肝损伤，腹腔注射，剂量为1ml CCl4/kg体重，每周2次，连续注射4周，建立肝纤维化模型，注射后的小鼠在无菌环境下正常饲喂。
实施例2：血清制剂的制备
血清制备：如实施例1所述的肝纤维化模型小鼠眼眶取血法采集血液，或从肝纤维化患者采集静脉血，37℃水浴保温30min后，3500rpm离心10min，取上清，-20℃冻存备用。
血清制剂制备：DMEM培养液+青霉素+100U/ml链霉素+体积浓度1％两性霉素B+体积浓度1％谷氨酰胺+体积浓度20％胎牛血清中添加体积终浓度为1～5％的上述血清，现用现配。
实施例3：宫内膜干细胞制剂
(1)宫内膜干细胞分离培养
收集供者经血样品，进行常规微生物和传染病病原体安全检测，采用1.0779/ml的Ficoll进行密度梯度离心，分离单核细胞，用生理盐水将分离到的单个核细胞洗涤3次，用DMEM培养液(添加100U/ml青霉素+100U/ml链霉素+体积浓度1％两性霉素B+体积浓度1％谷氨酰胺+体积浓度20％胎牛血清)调节细胞密度至(3～5)×106个细胞/ml，接种于底面积为75cm2的培养瓶中，置37℃，5％CO2培养箱中培养；48小时后，洗去未贴壁细胞，继续培养，至80％左右汇合，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化、传代。
(2)宫内膜干细胞制剂的制备
取步骤(1)3～5代长至90％左右汇合的宫内膜干细胞，用实施例2制备的血清制剂于37℃，5％CO2培养箱中培养处理24～48小时，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化，生理盐水洗涤2次后，用生理盐水悬浮并调整浓度至(1～5)×107个/ml，即为宫内膜干细胞制剂。
实施例4：宫内膜干细胞制剂输注改善肝功能、降低肝脏纤维化
如实施例1所述的肝纤维化模型小鼠分为4组：组1为正常组，组2为肝纤维化模型组，组3为肝纤维化模型生理盐水注射组，组4为肝纤维化模型宫内膜干细胞注射组，组4按(4～20)×107个/kg体重剂量对实验组小鼠尾静脉输注实施例3制备的宫内膜干细胞制剂，组3注射等体积生理盐水，每周1次，连续注射2周，组1和组2不经上述处理。期间组1正常饲养，组2、组3和组4小鼠继续按实施例1方法进行CCl4肝损伤，最后一次输注结束后，饲养至第28天，如实施例2所述方法采集小鼠血清，全自动生化分析仪检测肝功能指标(AST、ALT)；取小鼠肝脏组织，一部分肝脏石蜡包埋后进行组织切片，切片厚度5μm，天狼猩红染色，直观展示纤维化程度，并对阳性面积进行统计。结果见表1和图1。
表1肝功能指标ALT和AST检测结果
注：表1中，Normal、CCl4、Vehicle和MenSC分别表示正常组、肝纤维化模型组、肝纤维化模型生理盐水注射组、肝纤维化模型宫内膜干细胞注射组。**表示宫内膜干细胞注射组与模型组比较差异极显著(P﹤0.01)。
结果表明，宫内膜干细胞制剂输注组小鼠肝功能得到显著改善(详见表1)，天狼猩红染色证明肝脏纤维化程度明显降低(如图1所示)。由此说明静脉输注宫内膜干细胞制剂能够有效改善肝脏功能、降低肝脏纤维化。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种宫内膜干细胞在制备治疗肝脏纤维化药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述宫内膜干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞，表达CD29、CD44、CD73和CD90，不表达CD34、CD45、CD117和HLA-DR。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述宫内膜干细胞以细胞悬液的形式作用，所述细胞悬液按如下方法制备：将宫内膜干细胞用血清制剂于37℃，5％CO2培养箱中培养24～48小时，0.25％胰蛋白酶-EDTA消化，生理盐水洗涤后，再用生理盐水悬浮，即为宫内膜干细胞悬液；所述血清制剂是将肝纤维化供试血液于37℃水浴保温30min后，3500rpm离心10min，取上清，再将上清以体积终浓度1-5％的量加入含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、体积浓度1％两性霉素B、体积浓度1％谷氨酰胺和体积浓度20％胎牛血清的DMEM培养液中，即为血清制剂。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述宫内膜干细胞悬液中细胞浓度为1～5×107个/ml。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述药物用量以宫内膜干细胞个数计为4～20×107个/kg体重。
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