CN102676452B - 一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法和应用 - Google Patents
一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法和应用，建立了脐带间充质干细胞有限细胞系，鉴定其生物学特性；建立人脐带间充质干细胞分泌液制备方法；证明人脐带间充质干细胞(HUCMSC)分泌液在体外能够促进细胞再生、改善细胞功能、抑制细胞凋亡。ELISA检测证明人脐带间充质干细胞分泌液含有丰富的促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的细胞因子，如HGF、VEGF、bFGF等。
Description
技术领域
本发明属于生物医学的技术领域，尤其是一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法和应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是中胚层来源的具有自我复制、多向分化和免疫调控能力的多能干细胞，在组织工程、基因工程和干细胞移植领域具有较好的应用前景。目前已从骨髓、脂肪、胚肝、滑膜、羊膜液、胎盘、脐带血以及脐带等组织中分离出MSCs，其中脐带为医疗废弃物，来源丰富，对供者无不利影响，无伦理问题的限制，而且人脐带MSCs含量丰富，较为原始，分化能力强，可在体外进行分离、培养，扩增迅速且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可为实验和临床提供充足的细胞来源。脐带间充质干细胞相对纯净，与细胞输注相关的病毒和病原微生物感染率远低于骨髓移植，诸多学者认为脐带可作为极佳的间充质干细胞来源。
MSCs在临床和亚临床试验中治疗急性心肌梗死、脑卒中、急性肾损伤、糖尿病和骨折均取得了可喜的进展，但是具体的机制仍不是十分明确。MSCs在体外经诱导可以分化为骨、软骨、骨骼肌、心肌、血管内皮、神经胶质细胞、胰岛素分泌细胞等3个胚层的组织细胞，因此MSCs移植入体内分化为功能细胞替代受损细胞被认为是移植治疗的主要机制，但随着对MSCs特点的深入研究，对该机制的争议颇多。MSCs作为一种基质细胞的前体细胞，可以分泌多种细胞因子，通过组织间隙作用于周围细胞，发挥重要的旁分泌作用，除调控造血功能外，还广泛参与免疫调节、细胞增殖、凋亡、内源性前体细胞再生、血管再生等病理生理作用。
近年来，随着对间充质干细胞研究的逐渐深入，其旁分泌作用已成为众多研究者的关注热点。研究表明，MSCs的旁分泌物质对多种实验性器官和组织创伤模型如心肌梗塞、急性肾小管损伤、脑缺血和皮肤损伤有较好的促进创伤愈合和功能恢复的治疗效果，其作用机制主要是抑制细胞死亡、促进细胞分化、增殖而实现受损组织的修复。在FHF的动物模型中，Parekkadan B发现骨髓MSCs旁分泌物质具有抑制肝细胞死亡，刺激内源性再生作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法和应用，本发明在体外分离培养和鉴定人脐带间充质干细胞，建立了脐带间充质干细胞有限细胞系，提供了人脐带间充质干细胞旁分泌液制备方法，证明人脐带间充质干细胞分泌液在体外能够促进细胞再生、改善细胞功能、抑制细胞凋亡。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基的制备方法，步骤如下：
(1)收集脐带细胞后进行原代培养，待细胞长满瓶底，进行传代培养，每周传代1次，取第5-9代细胞经流式细胞仪检测表达CD29、CD49、CD90、CD105、HLA-1，基本不表达造血细胞标志CD34、CD45，内皮细胞标志CD31；
(2)制备含UCMSC分泌物的MSC条件培养基：将UCMSC培养至第五代；待细胞70％至80％融合时，充分洗涤培养瓶，倒入15mL含有0.05％牛血清白蛋白的DMEM；24小时后收集此培养基，用3kDa的离心超滤管，3800rpm，离心30分钟，即获得含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基。
而且，所述脐带细胞的收集方法如下：无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带，利用PBS冲洗脐动脉及脐静脉，将血液冲洗干净，体视镜下剥离脐动脉及脐静脉，将剩余组织剪碎至1mm3后，加入0.1％IV型胶原酶37℃振荡消化60min，然后加入0.25％胰酶继续37℃振荡消化30min，利用200目不锈钢滤网过滤后收集细胞，含5％FBS的DMEM重悬细胞接种于培养瓶内进行原代培养。
一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基，采用上述的方法制备得到。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明首次提供一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法，分离得到人脐带间充质干细胞分泌液，为医学特殊细胞培养及医学特殊细胞的治疗和鉴定开辟新的基础营养添加物和必要的手段，同时人脐带间充质干细胞分泌液也将应用于人体美容、皮肤外用、美白嫩肤、延缓衰老的各类化妆品。
2、本发明首次证明了脐带MSCs同样具有抑制肝细胞死亡和刺激肝细胞再生的作用。
3、本发明在体外分离培养和鉴定人脐带间充质干细胞(human umbilical cordmesenchymal stem cells，HUCMSCs)，建立了脐带间充质干细胞有限细胞系，鉴定其生物学特性，同时建立人脐带间充质干细胞旁分泌液制备方法；证明人脐带间充质干细胞(HUCMSC)分泌液在体外具有促进细胞再生、改善细胞功能、抑制细胞凋亡的功能。
4、本发明通过酶消化法可从脐带中获得间充质干细胞，方法较简单，体外增殖能力强，与骨髓来源间充质干细胞的免疫表型相一致，符合间充质干细胞基本的生物学特性，MSC分泌液易于收集制备，应用非常便利，适宜浓度的MSC-CM在体外可以刺激正常肝细胞再生，抑制受损肝细胞凋亡，改善肝细胞功能。
附图说明
图1为本发明原代细胞培养7天(×100)；
图2为本发明第4代细胞培养5天(×100)；
图3为本发明细胞生长曲线；
图4为本发明细胞周期分析；
图5为本发明诱导凋亡后的肝细胞经不同浓度MSC-CM处理后肝细胞免疫荧光染色，荧光显微镜下观察(400×)A：对照组。B：2％MSC-CM组。C：8％MSC-CM组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本实施例中涉及的百分比没有具体限定的均为重量百分比。本发明使用的细胞培养基均为本领域公知常识，不具有特殊性。
一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基的制备方法，步骤如下：
(1)收集脐带细胞后进行原代培养，24小时可观察到贴壁细胞，待生长至10天时可见细胞长满瓶底，进行传代培养，每周传代1次，取第5-9代细胞经流式细胞仪检测表达CD29、CD49、CD90、CD105、HLA-1，基本不表达造血细胞标志CD34、CD45，内皮细胞标志CD31，MTT实验显示细胞倍增时间为22h，细胞周期分析表明75％-85％细胞处于G0/G1，具体操作如下：
无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带，利用PBS冲洗脐动脉及脐静脉，将血液冲洗干净，体视镜下剥离脐动脉及脐静脉，将剩余组织剪碎至1mm3后，加入0.1％IV型胶原酶37℃振荡消化60min，然后加入0.25％胰酶继续37℃振荡消化30min，利用200目不锈钢滤网过滤后收集细胞，DMEM(5％FBS)重悬细胞接种于培养瓶内进行原代培养，待细胞生长至80-90％融合后进行1∶3传代培养，取传代培养细胞进行形态学观察，结果如下：
流式细胞仪检测：取P5代脐带MSC经0.25％胰酶消化后，充分吹打制备单细胞悬液，1000rpm×5min离心；弃上清，加入PBS充分洗涤脐带MSC，1600rpm×5min离心；弃上清，加入少量PBS重悬细胞，充分吹打制备1×105单细胞悬液，取少量分装入流式检测管中，分别加入CD29-FITC、CD49-FITC、CD34-PE、CD45-PE、CD105-FITC、CD90-PE，CD31-PE、HLA-1-PE等流式抗体；室温避光孵育30分钟；加入1％多聚甲醛1ml固定后，流式细胞仪进行检测。生长活性检测：细胞以1×104/ml密度接种到五个96孔培养板中每板各12孔，另设1孔为只加培养液的空白对照，每孔培养液200μl于培养箱内培养；次日细胞贴壁后，取一个96孔板，每孔加入MTT 20μl，放入培养箱内4h；弃去上清，加入DMSO 150μl，37℃振荡30min；全自动酶标仪测定波长540nm OD值；在接种后第1、3、5、7d重复上述操作，记录OD值；以天数为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。细胞的倍增时间(TD)由下述公式计算得出：TD＝t×lg2/(lgNt-lgN0)Nt：收集细胞数；N0：接种细胞数；t：培养时间)。细胞周期分析：取对数生长期的细胞，0.25％胰酶消化，1000rpm×5min离心后弃上清，加入PBS吹打制备单细胞悬液，酒精固定48h；1000rpm×5min离心弃上清，5ml PBS重悬；1600rpm×5min离心弃上清，加入1ml PI染液4℃避光染色30min；1600rpm×5min离心弃上清，加入少量PBS重悬细胞；1600rpm×5min离心弃上清，加入1ml 1％多聚甲醛充分混匀固定后上机检测，流式细胞仪在激发波长488nm下，测定细胞荧光强度，MultiCycle软件对该细胞周期DNA含量进行分析，确定细胞周期分布。检测结果见图1、图2、图3。
(2)制备含UCMSC分泌物的MSC条件培养基(Conditioned medium，MSC-CM)：将UCMSC培养至第五代；待细胞70％至80％融合时，即75cm2的培养瓶中大约3×106的细胞；充分洗涤培养瓶，倒入15mL含有0.05％牛血清白蛋白的DMEM；24小时后收集此培养基，用3kDa的离心超滤管，3800rpm，离心30分钟；此时15mL培养基浓缩为700μl，大约浓缩了22倍；把浓缩后的培养基定义为100％浓度的MSC的条件培养基(Conditioned medium，MSC-CM)；
本发明制备培养基制备两个浓度的应用如下：
2％MSC-CM(2％MSC-CM+98％肝细胞培养基)；
8％MSC-CM(8％MSC-CM+92％肝细胞培养基)。
上述两个培养基的各种性能实验具体如下：
(1)采用低浓度胶原酶原位循环灌流法分离肝细胞，取SD大鼠，乙醚麻醉、肝素腹腔注射抗凝，无菌常温环境下固定于操作台，剪开肌层，门静脉插管，剪断下腔静脉，用D-Hanks液灌洗净血管内血液，更换0.1-0.5％IV型胶原酶，灌洗至肝质变软，压之凹陷不易恢复后，撕碎肝脏并祛除纤维结缔组织，制成混合细胞悬液，筛网过滤，收集肝细胞，根据试验需求接种于相应培养基培养。0.4％台盼蓝染色判断肝细胞活性；试验分组：对照组、MSC-CM组。
(2)MTT比色法观察不同浓度MSC-CM对正常肝细胞增殖的影响：肝细胞接种于基底膜基质铺底的96孔培养板，培养24h后，移去含10％胎牛血清的肝细胞培养基，然后加入含0.4％胎牛血清的DMEM培养基继续培养24h，使细胞同步化于G0期后，移去培养液，加入含5％胎牛血清及2％MSC-CM、8％MSC-CM的肝细胞培养液，继续培养24h，MTT比色法检测肝细胞增殖情况。
(3)不同浓度MSC-CM对正常肝细胞功能的影响：肝细胞接种于12孔培养板，加入2％MSC-CM、8％MSC-CM的肝细胞培养液的MSC-CM，24小时后收集培养上清液，Albumin Assay Kit和Urea Assay Kit测定不同浓度MSC-CM组的肝细胞上清液中白蛋白、尿素的浓度。
(4)诱导肝细胞凋亡、MSC-CM处理及肝细胞活性分析：肝细胞在基底膜基质预铺底的12孔板内常规培养5天后，在培养基内加放线菌素D1小时，然后加入肿瘤坏死因子α，诱导肝细胞凋亡，与此同时分别加入相应浓度的MSC-CM，培养8小时后观察肝细胞活性。
(5)收集含0.4％胎牛血清的DMEM培养基培养24h的细胞培养上清，用ELISA方法检测HGF、VEGF、bFGF。
实验结果
(1)利用胶原酶及胰酶两步消化法能充分消化脐带，细胞易于获得，收集细胞后进行原代培养，24小时可观察到贴壁细胞，待生长至10天时可见细胞长满瓶底，进行传代培养，每周传代1次。取第5-9代细胞经流式细胞仪检测表达CD29、CD49、CD90、CD105、HLA-1，基本不表达造血细胞标志CD34、CD45，内皮细胞标志CD31。MTT实验显示细胞倍增时间为22h。细胞周期分析表明75％-85％细胞处于G0/G1。浓缩后的MSC-CM中含有高浓度的脐带间充质干细胞分泌物。
(2)MTT法测定肝细胞增殖，与对照组比较，MSC-CM组吸光度(A)540nm值明显增加(P＜0.01)，差异有统计学意义。测定MSC-CM组尿素和白蛋白的含量均高于对照组(P＜0.01)，有统计学差异。细胞活性分析试剂盒检测，MSC-CM组肝细胞存活率增加(P＜0.05)，有统计学意义。
表1不同浓度MSC-CM对大鼠肝细胞增殖的影响
注：*为与对照组比，P＝0.002
表2不同浓度MSC-CM对大鼠肝细胞合成ALB和Urea的影响
注：*为与对照组比，P＝0.003
▲为与对照组比，P＝0.008
表3不同浓度MSC-CM对大鼠肝细胞凋亡的影响
注：*为与对照组比，P＝0.013
表4bFGF含量(pg/ml)
表5VEGF含量(pg/ml)
表6HGF含量(pg/ml)
本发明的适用范围：
在生物医学领域里，人脐带间充质干细胞分泌液是特殊细胞培养的营养添加物。在美容领域：可用于人体皮肤外用，具有美白嫩肤，延缓衰老的奇特功效。可以开发为高档的美容化妆品重要组分。
Claims (1)
1.一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基的制备方法，其特征在于：步骤如下：
⑴收集脐带细胞后进行原代培养，24小时可观察到贴壁细胞，待生长至10天时可见细胞长满瓶底，进行传代培养，每周传代1次，取第5-9代细胞经流式细胞仪检测表达CD29、CD49、CD90、CD105、HLA-1，不表达造血细胞标志CD34、CD45，内皮细胞标志CD31，MTT实验显示细胞倍增时间为22h，细胞周期分析表明75%-85%细胞处于G0/G1，具体操作如下：
无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带，利用PBS冲洗脐动脉及脐静脉，将血液冲洗干净，体视镜下剥离脐动脉及脐静脉，将剩余组织剪碎至1mm3后，加入0.1%Ⅳ型胶原酶37℃振荡消化60min，然后加入0.25%胰酶继续37℃振荡消化30min，利用200目不锈钢滤网过滤后收集细胞，DMEM重悬细胞接种于培养瓶内进行原代培养，待细胞生长至80-90%融合后进行1：3传代培养，取传代培养细胞进行形态学观察，结果如下：
流式细胞仪检测：取传代至第五代的脐带MSC经0.25%胰酶消化后，充分吹打制备单细胞悬液，1000rpm×5min离心；弃上清，加入PBS充分洗涤脐带MSC，1600rpm×5min离心；弃上清，加入少量PBS重悬细胞，充分吹打制备1×105/ml单细胞悬液，取少量分装入流式检测管中，分别加入CD29-FITC、CD49-FITC、CD34-PE、CD45-PE、CD105-FITC、CD90-PE，CD31-PE、HLA-1-PE流式抗体；室温避光孵育30分钟；加入1%多聚甲醛1ml固定后，流式细胞仪进行检测，生长活性检测:细胞以1×104/ml密度接种到五个96孔培养板中每板各12孔，另设1孔为只加培养液的空白对照，每孔培养液200μl于培养箱内培养；次日细胞贴壁后，取一个96孔板，每孔加入MTT20μl，放入培养箱内4h；弃去上清，加入DMSO150μl，37℃振荡30min；全自动酶标仪测定波长540nm OD值；在接种后第1、3、5、7d重复上述操作，记录OD值；以天数为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线，细胞的倍增时间（TD）由下述公式计算得出：TD=t×lg2/(lgNt-lgN0),其中，Nt：收集细胞数；N0：接种细胞数；t：培养时间，细胞周期分析:取对数生长期的细胞，0.25%胰酶消化，1000rpm×5min离心后弃上清，加入PBS吹打制备单细胞悬液，酒精固定48h；1000rpm×5min离心弃上清，5mlPBS重悬；1600rpm×5min离心弃上清，加入1mlPI染液4℃避光染色30min；1600rpm×5min离心弃上清，加入少量PBS重悬细胞；1600rpm×5min离心弃上清，加入1ml1%多聚甲醛充分混匀固定后上机检测，流式细胞仪在激发波长488nm下，测定细胞荧光强度，MultiCycle软件对该细胞周期DNA含量进行分析，确定细胞周期分布；
⑵制备含UCMSC分泌物的MSC条件培养基：将UCMSC培养至第五代；待细胞70%至80%融合时，即75cm2的培养瓶中3×106/ml的细胞；充分洗涤培养瓶，倒入15mL含有0.05%牛血清白蛋白的DMEM；24小时后收集此培养基，用3kDa的离心超滤管，3800rpm，离心30分钟；此时15mL培养基浓缩为700μl，浓缩了22倍；把浓缩后的培养基定义为100%浓度的MSC的条件培养基。
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