CN110025564A - 一种防衰老护肤组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防衰老护肤组合物及其制备方法，组合物包括A组分和B组分；A组分为含有左旋维生素C的间充质干细胞分泌液，其中，左旋维生素C的添加量为0.1‑0.3g/mL；B组分为人参皂苷提取液；A组分和B组分的体积比为80‑120:1。通过将A组分和B组分按照所述体积比进行混合，得到防衰老护肤组合物，晚睡前取其均匀涂于面部，具有改善肤质，增强皮肤弹性、消除皱纹、淡化黑色素、美白、改善肤色和防止皮肤衰老的作用，可用于美容护肤品的制备和临床研究。

Description

一种防衰老护肤组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及护肤品技术领域，尤其涉及一种防衰老护肤组合物及其制备方法。

背景技术

随着年龄的增长，构成皮肤的胶原蛋白、弹性蛋白等的含量和排布逐渐改变，人们逐渐出现皮肤老化现象。皮肤老化是指皮肤功能衰老性损伤，使皮肤对机体的防护能力，调节能力等减退，由此皮肤不能适应内外环境的变化，出现颜色、色泽、形态、质感等外观整体状况的改变。皮肤的老化分为内源性老化和外源性老化。内源性老化是指皮肤随年龄增长的自然老化。表现为皮肤出现细小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等。外源性老化的最主要原因是日晒所致的光老化。表现为皱纹、皮肤松弛、粗糙、淡黄或灰黄色的皮肤变色、毛细血管扩张、色素斑形成等。目前，各种有害污染物、工作引起的压力增加以及日光引起的活性氧的增加，也加速了皮肤的退化和变性，因此皮肤基质被破坏并变得越来越薄皮肤衰老症状出现提前。

目前，随着美容技术及其设备的发展，越来越多的人群选择采用激光治疗皮肤老化，激光治疗方法基本可分为有创和无创两类。有创光嫩肤又可分为应用全表皮气化结合光热原理进行的表皮重建光嫩肤，与部分表皮气化结合局灶性光热原理进行的点阵表皮重建嫩肤两种形式，以达到表皮重建、胶原蛋白收缩和真皮再生，改善皮肤质量的目的。无创光嫩肤也可分为表浅的强光嫩肤治疗、扫描激光的真皮嫩肤治疗和局灶性的点阵激光嫩肤治疗等多种形式。然而，由于操作不当等原因造成术后并发症的人群在逐年增多。因操作不当会造成过多的组织损伤，严重的炎症反应，以及毛细血管怒张等等相反的效果，主要的副作用包括水肿、水疱、色素沉着、色素减退、毛细血管扩张、皮肤敏感性增高等等。因此，风险较高，而且需要专业机构的专业人士进行操作，价格高昂，不便于日常皮肤护理。

发明内容

本发明针对上述技术问题，提供一种防衰老护肤组合物及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供的一种防衰老护肤组合物，包括A组分和B组分；A组分为含有左旋维生素C的间充质干细胞分泌液，其中，左旋维生素C的添加量为0.1-0.3g/mL；B组分为人参皂苷提取液；A组分和B组分的体积比为80-120:1。

优选地，A组分中，左旋维生素C的添加量为0.2g/mL。

优选地，A组分和B组分的体积比为100:1。

优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

间充质干细胞(MSC，mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。目前已从骨髓、脂肪、胚肝、滑膜、羊膜液、胎盘、脐带血以及脐带等组织中分离出MSCs，其中脐带为医疗废弃物，来源丰富，对供者无不利影响，无伦理问题的限制，而且人脐带MSCs含量丰富，较为原始，分化能力强，可在体外进行分离、培养，扩增迅速且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可为实验和临床提供充足的细胞来源。间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，间充质干细胞在神经系统修复及更多方面具有长远的发展前景。近年来，人脐带来源间充质干细胞(以下简称“脐带MSC”)已经被广泛应用于科学研究和临床研究试验，对退行性疾病、免疫失调疾病等取得了较好的临床治疗效果，具有十分广阔的临床应用前景。原料来源于人产后采集不超过48h(2～8℃保存)在生理盐水中的新鲜脐带组织。原料可通过公共库或自体细胞库途径获取。供者经过人源性特定病毒(包括HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等)、梅毒螺旋体、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、谷丙转氨酶的项目检查，结果合格。

具体地，所述A组分的制备方法为：无菌条件下收集新生儿脐带，将血液冲洗干净，剥离脐动脉及脐静脉，将剩余组织剪碎至1mm³后，加入0.1％IV型胶原酶37℃振荡消化60min，然后加入0.25％胰酶继续37℃振荡消化30min，利用200目不锈钢滤网过滤后，收集细胞，DMEM重悬细胞接种于培养瓶内，在CO₂浓度为5％、37℃下进行原代培养，待细胞生长至80-90％融合后，收集细胞上清液至离心管中备用，细胞进行1：3传代培养，待细胞80％以上融合时，收集细胞上清液至离心管中备用，细胞再进行1：3传代培养，一直培养至第五代；收集P1-P5代细胞上清液，离心浓缩10倍，加入所述添加量的左旋维生素C，得到含有左旋维生素C的间充质干细胞分泌液。

所述B组分的制备方法为：取人参须根，粉碎，加pH为11的碱水浸泡过夜，超声提取3次，每次30min，抽滤，合并滤液，上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗脱液无色，再用80％乙醇洗脱至薄层色谱检查出液无皂苷为止，将乙醇洗脱液减压回收至干，残渣即为人参皂苷粗品，将粗品溶于20倍量的95％乙醇中超声溶解，抽滤，滤液减压回收至干，残渣溶于10倍纯水，得到人参皂苷提取液。

本发明还公开了上述的防衰老护肤组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)A组分的制备：无菌条件下收集新生儿脐带，将血液冲洗干净，剥离脐动脉及脐静脉，将剩余组织剪碎至1mm³后，加入0.1％IV型胶原酶37℃振荡消化60min，然后加入0.25％胰酶继续37℃振荡消化30min，利用200目不锈钢滤网过滤后，收集细胞，DMEM重悬细胞接种于培养瓶内，在CO₂浓度为5％、37℃下进行原代培养，待细胞生长至80-90％融合后，收集细胞上清液至离心管中备用，细胞进行1：3传代培养，待细胞80％以上融合时，收集细胞上清液至离心管中备用，细胞再进行1：3传代培养，一直培养至第五代；收集P1-P5代细胞上清液，离心浓缩10倍，加入所述添加量的左旋维生素C，得到含有左旋维生素C的间充质干细胞分泌液，4℃存储；

(2)B组分的制备：取人参须根，粉碎，加pH为11的碱水浸泡过夜，超声提取3次，每次30min，抽滤，合并滤液，上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗脱液无色，再用80％乙醇洗脱至薄层色谱检查出液无皂苷为止，将乙醇洗脱液减压回收至干，残渣即为人参皂苷粗品，将粗品溶于20倍量的95％乙醇中超声溶解，抽滤，滤液减压回收至干，残渣溶于10倍纯水，得到人参皂苷提取液，4℃存储；

(3)将A组分和B组分按照所述体积比进行混合，得到防衰老护肤组合物。

本发明还公开了上述防衰老护肤组合物的使用方法，即晚睡前洁面后取其10mL，摇均，均匀涂于面部，轻拍至皮肤完全吸收，操作简单，安全无副作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用的间充质干细胞分泌液，是一种间充质干细胞分泌细胞活性因子，是多重效果功能因子。主要成分包括表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、干细胞生长因子(SFC)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管内皮生长因子等，通过细胞的信号转导和相互粘附作用，可活化、刺激细胞生长，能促进表皮组织上皮细胞、角质细胞、成纤维细胞等多种细胞的生长、分裂，促进细胞新陈代谢、增殖、分化，调节皮肤免疫屏障，改善肤质，增强皮肤弹性、消除皱纹、淡化皱纹和防止皮肤衰老。同时，间充质干细胞分泌液还配以左旋维生素C，维生素C是一种强还原剂，具有抗氧化作用，可以保持细胞活性因子的活性，延长其使用效期。由于维生素C是具有旋光活性的分子，按照它的旋光度，可将其分为左旋和右旋。左旋维生素C是唯一可直接被人体肌肤所吸收的维生素C形式，它具有促进胶原蛋白增生和皮肤之新陈代谢，加速换肤，中和自由基，修复紫外线对肌肤的伤害，淡化黑色素等功能，使皮肤免于受损老化。此外，本发明采用的人参皂苷提取液，含有多种人参皂苷的单体成分，如人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2、Re、Rg1、Rg2、Rh1等，可影响多重的代谢通路，其效能也是复杂的，可促进DNA、RNA合成，修复皮肤细胞，促进组织愈合以及炎症和修复，与间充质干细胞分泌液起到协同作用，进一步促进细胞新陈代谢，对消除皱纹、淡化色斑、美白、改善肤色、滋润皮肤均具有显著的功效，本组合物可用于美容护肤品的制备和临床研究。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为使用案例一使用本发明的对比效果图；

图2为使用案例二使用本发明的对比效果图；

图3为使用案例三使用本发明的对比效果图；

图4为使用案例四使用本发明的对比效果图；

图5为使用案例五使用本发明的对比效果图；

图6为使用案例六使用本发明的对比效果图。

具体实施方式

本发明提供的一种防衰老护肤组合物，包括A组分和B组分；A组分为含有左旋维生素C的间充质干细胞分泌液，其中，左旋维生素C的添加量为0.1-0.3g/mL；B组分为人参皂苷提取液；A组分和B组分的体积比为80-120:1。优选地，A组分中，左旋维生素C的添加量为0.2g/mL。优选地，A组分和B组分的体积比为100:1。各个组分配比未在本发明前述的范围内，其效果稍差，可见每个护肤品中的原料之间的配比是个很重要的考察指标，只有在本发明的相应配比范围内，才能将其效果发挥到极致。优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。脐带间充质干细胞相对纯净，与细胞输注相关的病毒和病原微生物感染率远低于骨髓移植，脐带可作为极佳的间充质干细胞来源。本发明的防衰老护肤组合物，可添加相应辅料，制成霜剂、精华液、面膜、乳液、凝胶、水剂或冻干粉剂型。各种剂型的制备方法均为常规方法，按本领域常规操作即可。本发明的防衰老护肤组合物可以分装成小剂量真空包装，每个包装为一次用量10ml，晚睡前洁面后直接涂抹于面部，轻拍至皮肤完全吸收。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明的使用方法作进一步的详细介绍。

实施例1防衰老护肤组合物的制备

(1)A组分的制备：无菌条件下收集新生儿脐带，将血液冲洗干净，剥离脐动脉及脐静脉，将剩余组织剪碎至1mm³后，加入0.1％IV型胶原酶37℃振荡消化60min，然后加入0.25％胰酶继续37℃振荡消化30min，利用200目不锈钢滤网过滤后，收集细胞，DMEM重悬细胞接种于培养瓶内，在CO₂浓度为5％、37℃下进行原代培养，待细胞生长至80-90％融合后，收集细胞上清液至离心管中备用，细胞进行1：3传代培养，待细胞80％以上融合时，收集细胞上清液至离心管中备用，细胞再进行1：3传代培养，一直培养至第五代；收集P1-P5代细胞上清液，离心浓缩10倍，得到间充质干细胞分泌液，再加入左旋维生素C 0.1g/mL，得到含有左旋维生素C的间充质干细胞分泌液，4℃存储。本发明选用无血清培养基，可消除血清引起的过敏现象和不良反应。本发明组分不含防腐成分，而防腐剂的过量和不恰当使用会令表皮细胞发育不成熟，结构松散，以至于表皮层变薄，易受外界刺激，防御力下降；会损伤细胞DNA，令皮肤渐渐失去弹性，容易产生松弛和细纹；而受防腐剂损害的皮肤细胞则会不断缺陷繁殖，令肤质越来越差，特别是敏感肌受到防腐剂的刺激后还会出现过敏反应，使用护肤品得到效果适得其反。本发明组分A添加左旋VC，具有抗氧化作用，能维持活性因子活性，使其储存稳定性好，开封效期更长。

采用ELISA的方法检测不同储存时间下A组分中以下活性因子的含量(pg/ml)，试剂盒购于美国RD公司，每个样品测试三次取平均值，结果见表1。

(2)B组分的制备：取人参须根，粉碎，加pH为11的碱水浸泡过夜，超声提取3次，每次30min，抽滤，合并滤液，上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗脱液无色，再用80％乙醇洗脱至薄层色谱检查出液无皂苷为止，将乙醇洗脱液减压回收至干，残渣即为人参皂苷粗品，将粗品溶于20倍量的95％乙醇中超声溶解，抽滤，滤液减压回收至干，残渣溶于10倍纯水，除菌过滤，得到人参皂苷提取液，4℃存储。

(3)将A组分和B组分按照体积比80:1进行混合，得到防衰老护肤组合物。

实施例2防衰老护肤组合物的制备

(1)A组分的制备：间充质干细胞分泌液制备同实施例1，再加入左旋维生素C0.2g/mL，得到含有左旋维生素C的间充质干细胞分泌液，4℃存储。

(2)B组分的制备：同实施例1。

(3)将A组分和B组分按照体积比100:1进行混合，得到防衰老护肤组合物。

实施例3防衰老护肤组合物的制备

(1)A组分的制备：间充质干细胞分泌液制备同实施例1，再加入左旋维生素C0.3g/mL，得到含有左旋维生素C的间充质干细胞分泌液，4℃存储。

(2)B组分的制备：同实施例1。

(3)将A组分和B组分按照体积比120:1进行混合，得到防衰老护肤组合物。

实验例

2018年3月-2018年12月期间，共选取200名受试者，年龄25-60岁，其中女性170，男性30名，均出现不同程度的皮肤衰老现象，70％以上受试者为混合型肌肤，20％左右受试者为干性肌肤，10％受试者为油性肌肤，其中还有部分为敏感肌肤。每位受试者在领取本发明的试样前都会先对皮肤做一个简单的测试和记录，如皮肤细腻程度、皱纹、色斑情况等。每位受试者都会进行后续的跟踪调查，记录使用一个月后的使用效果。其中，90％的受试者认为皮肤色号有所提升，92％的受试者认为皱纹、色斑消除明显，95％的受试者认为肌肤弹性、毛孔、皮肤保湿程度等方面综合评价效果明显，以上试用过程中未出现一例过敏现象，好评率高达98％。下面就几个典型使用案例进行说明。

使用案例一：使用者李某，女，41岁，眼角皱纹明显，有色斑。于2018年3月12日-2018年4月11日期间，每晚睡前洁面后取实施例1制备的单一组分间充质干细胞分泌液10mL，均匀涂于面部，轻拍至皮肤完全吸收，使用一个月后，皱纹、色斑淡化不明显，如图1左所示。于2018年4月16日-2018年5月15日期间，李某每晚睡前洁面后取实施例1制备的防衰老护肤组合物10mL，摇匀后均匀涂于面部，轻拍至皮肤完全吸收，使用一个月后，皮肤细腻、弹性增强、紧致、色斑淡化明显、皱纹明显改善，如图1右所示。

使用案例二：使用者郭某，女，45岁，面部色素沉着严重，如图2左所示，于2018年5月7日-2018年6月6日期间，每晚睡前洁面后取实施例1制备的防衰老护肤组合物10mL，摇匀后均匀涂于面部，轻拍至皮肤完全吸收，使用一个月后，色斑淡化明显，皮肤细腻、紧致，如图2右所示。

使用案例三：使用者王某，男，49岁，额头皱纹明显，有多处色斑生成。于2018年4月25日-2018年5月24日期间，每晚睡前洁面后取实施例2制备的B组分10mL，均匀涂于面部，轻拍至皮肤完全吸收，使用一个月后，皱纹、色斑淡化不明显，如图3左所示。于2018年6月3日-2018年7月2日期间，王某每晚睡前洁面后取实施例2制备的防衰老护肤组合物10mL，摇匀后均匀涂于面部，轻拍至皮肤完全吸收，使用一个月后，皮肤皱纹明显改善、色斑淡化明显，如图3右所示。

使用案例四：使用者刘某，女，34岁，面部肤色发黄，无光泽，如图4左所示，于2018年6月20日-2018年7月19日期间，每晚睡前洁面后取实施例2制备的防衰老护肤组合物10mL，摇匀后均匀涂于面部，轻拍至皮肤完全吸收，使用一个月后，肤色均匀，皮肤细腻度、白皙度、光泽度均有所提高，如图4右所示。

使用案例五：使用者薛某，女，46岁，额头部具有瘢痕、皱纹色素沉着明显，如图5左所示，于2018年8月5日-2018年9月5日期间，每晚睡前洁面后取实施例3制备的防衰老护肤组合物10mL，摇匀后均匀涂于面部，轻拍至皮肤完全吸收，使用一个月后，额头瘢痕变浅，皱纹和色素淡化，如图5右所示。

使用案例六：使用者裴某，女，32岁，面部鼻两侧毛孔粗大，泛红，毛孔内有黑头，皮脂腺油脂分泌旺盛，如图6左所示，于2018年7月5日-2018年8月5日期间，每晚睡前洁面后取实施例3制备的防衰老护肤组合物10mL，摇匀后均匀涂于面部，轻拍至皮肤完全吸收，使用一个月后，鼻两侧毛孔变小，皮脂腺油脂分泌减少，皮肤细腻度提高，黑头减少，如图6右所示。

以上实施例和应用案例只是众多受试者中选出的部分案例，通过以上对比说明，本发明组合物(复合细胞因子增加左旋维生素C协同人参皂苷)对皮肤色素斑(非先天性)、皮肤浅效、皮肤成纤维细胞的修复、瘢痕的改变、皮质腺改变等皮肤老化症状有一定的作用可用于制备具有美白、祛斑、防衰老等功效的护肤品。

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

Claims (7)

1.一种防衰老护肤组合物，其特征在于，包括A组分和B组分；A组分为含有左旋维生素C的间充质干细胞分泌液，其中，左旋维生素C的添加量为0.1-0.3g/mL；B组分为人参皂苷提取液；A组分和B组分的体积比为80-120:1。

2.根据权利要求1所述的防衰老护肤组合物，其特征在于，左旋维生素C的添加量为0.2g/mL。

3.根据权利要求1所述的防衰老护肤组合物，其特征在于，A组分和B组分的体积比为100:1。

4.根据权利要求1-3任一项所述的防衰老护肤组合物，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的防衰老护肤组合物，其特征在于，所述A组分的制备方法为：无菌条件下收集新生儿脐带，将血液冲洗干净，剥离脐动脉及脐静脉，将剩余组织剪碎至1mm³后，加入0.1％IV型胶原酶37℃振荡消化60min，然后加入0.25％胰酶继续37℃振荡消化30min，利用200目不锈钢滤网过滤后，收集细胞，DMEM重悬细胞接种于培养瓶内，在CO₂浓度为5％、37℃下进行原代培养，待细胞生长至80-90％融合后，收集细胞上清液至离心管中备用，细胞进行1：3传代培养，待细胞80％以上融合时，收集细胞上清液至离心管中备用，细胞再进行1：3传代培养，一直培养至第五代；收集P1-P5代细胞上清液，离心浓缩10倍，加入所述添加量的左旋维生素C，得到含有左旋维生素C的间充质干细胞分泌液。

6.根据权利要求1所述的防衰老护肤组合物，其特征在于，所述B组分的制备方法为：取人参须根，粉碎，加pH为11的碱水浸泡过夜，超声提取3次，每次30min，抽滤，合并滤液，上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗脱液无色，再用80％乙醇洗脱至薄层色谱检查出液无皂苷为止，将乙醇洗脱液减压回收至干，残渣即为人参皂苷粗品，将粗品溶于20倍量的95％乙醇中超声溶解，抽滤，滤液减压回收至干，残渣溶于10倍纯水，得到人参皂苷提取液。

7.根据权利要求1-3任一项所述的防衰老护肤组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)A组分的制备：无菌条件下收集新生儿脐带，将血液冲洗干净，剥离脐动脉及脐静脉，将剩余组织剪碎至1mm³后，加入0.1％IV型胶原酶37℃振荡消化60min，然后加入0.25％胰酶继续37℃振荡消化30min，利用200目不锈钢滤网过滤后，收集细胞，DMEM重悬细胞接种于培养瓶内，在CO₂浓度为5％、37℃下进行原代培养，待细胞生长至80-90％融合后，收集细胞上清液至离心管中备用，细胞进行1：3传代培养，待细胞80％以上融合时，收集细胞上清液至离心管中备用，细胞再进行1：3传代培养，一直培养至第五代；收集P1-P5代细胞上清液，离心浓缩10倍，加入所述添加量的左旋维生素C，得到含有左旋维生素C的间充质干细胞分泌液，4℃存储；

(2)B组分的制备：取人参须根，粉碎，加pH为11的碱水浸泡过夜，超声提取3次，每次30min，抽滤，合并滤液，上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱至洗脱液无色，再用80％乙醇洗脱至薄层色谱检查出液无皂苷为止，将乙醇洗脱液减压回收至干，残渣即为人参皂苷粗品，将粗品溶于20倍量的95％乙醇中超声溶解，抽滤，滤液减压回收至干，残渣溶于10倍纯水，得到人参皂苷提取液，4℃存储；

(3)将A组分和B组分按照所述体积比进行混合，得到防衰老护肤组合物。