CN113117146B - 一种用于人工角膜的支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于人工角膜的支架及其制备方法，包括脱钙去细胞后的松质骨基质片→浸粘纳米级软骨、脐带等ECM细胞胞外基质于支架内外→复合自体间充质干细胞(骨髄、脂肪等细胞)，培养成活后放置于角膜的层间、前表面、结膜或粘膜下，用于人工角膜手术中替代骨、软骨或者牙齿骨，作为人工角膜的支架或者加固材料。本发明所述的用于人工角膜的支架，具有吸附诱导利于细胞胞体内外生长的微环境，能够促进间充质干细胞在体内分化成类软骨、成骨组织，便于固定人工角膜，提髙人工角膜的在位率。

Description

一种用于人工角膜的支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及人工角膜技术领域，特别涉及一种用于人工角膜的支架及其制备方法。
背景技术
人工角膜(Keratoprosthesis，Kpro)是用于替代病变角膜发挥其光学和生物学功能的人造装置，是无法用角膜手术复明的角膜混浊病人的最终复明手段。人工角膜一般包括镜柱(光学部分)和支架(加固材料)两部分，其中，镜柱是用光学特性优良、物理化学性质稳定的透明材料制成，用以替代病变后阻碍眼球光学通路的浑浊角膜。为达到理想的光学效果，人工角膜目前多采用贯通式，即人工角膜的镜柱贯通角膜全层，通过支架将镜柱固定在角膜中央。
人工角膜最重要的临床指标之一就是在位率，以往各种人工角膜由于组织溶解感染，异物反应等可致人工角膜排出。目前，国际上应用较广泛的人工角膜包括Boston人工角膜、骨齿型人工角膜(Osteo-Odonotokeratoprosthesis，OOKP)以及俄罗斯MICOF人工角膜。其中，Boston人工角膜是目前全球应用病例最多的类型，此类人工角膜一般由PMMA材料制成，但容易发生角膜溶解等严重并发症。上述三种角膜类型中，OOKP人工角膜在位率最好，最长保持可达20年，因牙骨作为人工角膜的固定材料，血管长入其中，充分血管化和充足的营养支持有助于提高人工角膜的在位率。但是，OOKP人工角膜需使用人体牙齿，对患者造成一定的副损伤，且无牙齿的患者无法使用该类型的人工角膜。此外，人体牙齿的抗弯强度低，使用中不易操作、制备困难，手术复杂，需要个体加工而不能批量生产等因素也限制了应用。
因此亟需一种能够克服上述缺点的人工角膜支架材料或者加固材料。
发明内容
本发明克服现有人工角膜支架的缺陷，提供了一种在位率高且对患者损伤小的人工角膜支架。
为达到上述发明目的，本发明提供的技术方案如下：
一种用于人工角膜的支架，其特征在于，包括软骨细胞胞外基质，骨基质，以及间充质干细胞。
在本发明中，所述软骨细胞胞外基质由动物的软骨细胞分泌，或者由异体骨的软骨细胞分泌。
在本发明中，所述软骨细胞胞外基质通过对软骨组织进行脱细胞得到。
在本发明中，所述骨基质通过对动物松质骨组织进行脱细胞得到。
在本发明中，所述软骨细胞胞外基质涂布于骨基质的至少一个表面。
在本发明中，所述间充质干细胞为选自如下的至少一种：(a)脂肪间充质干细胞；(b)骨髓间充质干细胞；(c)脐带间充质干细胞。
在本发明中，所述脂肪间充质干细胞取自患者脂肪组织。
在本发明中，所述骨髓间充质干细胞取自患者骨髓。
在本发明中，所述软骨细胞胞外基质和/或骨基质促进间充质干细胞分化形成软骨细胞。
在本发明中，所述软骨细胞胞外基质和/或骨基质促进间充质干细胞分化形成软骨细胞，由此提高人工角膜的在位率。
一种制备人工角膜支架的方法，所述方法包括步骤：(S1)对软骨组织进行脱细胞处理，以获得软骨细胞胞外基质；(S2)对松质骨组织进行脱细胞，以获得骨基质；(S3)将所述软骨细胞胞外基质涂布于所述骨基质的至少一个表面，以获得软骨细胞胞外基质/骨基质支架；(S4)原代培养间充质干细胞；(S5)将所述间充质干细胞充分浸润所述软骨细胞胞外基质/骨基质支架，接着进行细胞培养。
根据本发明的人工角膜支架，通过利用原位成软骨技术，促进间充质干细胞在体内分化成类软骨、成骨组织，在手术中更方便的包绕人工角膜的镜柱，并与镜柱紧密结合，从而减少人工角膜的排出、前移、以及降低漏水、感染等并发症的发生率。
附图说明
接下来，在附图和实施例的描述中，为了方便，将术语“软骨细胞胞外基质”简称为“DCECM”，将术语“骨基质”简称为“DBM”，将术语“间充质干细胞”简称为“rADMSCs”。
图1是根据本申请一些实施例制备人工角膜支架的示意性流程图；
图2是DCECM/DBM-rADMSCs复合支架的显微照片及扫描电镜图；
图3是DCECM-DBM-rADMSCs复合支架以及DCECM-DBM支架在植入兔眼角膜后临床以及病理组织学检查图；
图4是DCECM-DBM-rADMSCs复合支架和DCECM-DBM支架植入兔眼角膜后的成软骨特异性检查图；
图5是DCECM-DBM-rADMSCs复合支架和DCECM-DBM支架植入兔眼角膜后，支架与受体角膜的结合情况图。
具体实施方式
在下文中，将根据示例性的实施例对本发明进行详细的描述，但本发明并不限于这些实施例。本发明以下述的多种形式具体化，但是不应被解释为限于本文阐明的示例性实施例。因此，本发明的详细描述及实施例将向本领域的普通技术人员传达本发明的范围，并且被解释为处于本发明的范围内。
本发明所提供的用于人工角膜的支架，为新型的生物材料，其包括软骨细胞胞外基质，骨基质，以及间充质干细胞。
作为本发明支架的主要组分，软骨细胞胞外基质具有促进软骨组织形成的功能，其可以有多种来源，例如，来源于动物的软骨细胞、异体骨等。其中，胎牛的关节软骨细胞是优选的。应用于本发明支架的软骨细胞胞外基质，可以通过对软骨组织进行脱细胞处理后获得。
作为本发明支架的主要组分，骨基质也可以来源于动物或异体骨，通过对动物或异体骨来源的松质骨进行脱细胞处理后获得。
关于本发明的间充质干细胞，为降低术后排斥反应导致的人工角膜在位率低的问题，优选患者自身的间充质干细胞，例如，脂肪间充质干细胞或骨髓脂肪间充质干细胞。为降低对患者的损伤，优选对患者创伤性极低的脂肪间充质干细胞。此外，脐带血来源的间充质干细胞也是可选的。
本发明的用于人工角膜的支架，可以根据下列方法来制造，但是不能将本发明限制于此。
图1是根据本申请一些实施例制备人工角膜支架的示意性流程图。
在步骤110中，可以对软骨组织进行脱细胞处理，以获得软骨细胞胞外基质。更具体地，可以首先将软骨组织浸泡于乙酸和过氧化氢中，随后进行粉碎和离心处理，以获得纳米级的软骨细胞胞外基质。进一步地，可以加入三蒸水以获得稀释的软骨细胞胞外基质。
在步骤120中，可以对松质骨组织进行脱细胞，以获得骨基质。更具体地，首先将胎牛松质骨锯薄的骨片，骨片厚度优选为0.1-10mm，更优选1-2mm，然后高压枪冲洗以去除骨髓脂肪及骨髓细胞，脱钙后获得脱细胞的骨基质。
在步骤130中，可以将所述软骨细胞胞外基质涂布于所述骨基质的至少一个表面，以获得软骨细胞胞外基质/骨基质支架。
优选的，将软骨细胞胞外基质匀浆均匀地涂于骨基质的上下各表面，确保骨基质的各面及其内部均被软骨细胞胞外基质填满，接着冷冻干燥，以获得软骨细胞胞外基质/骨基质支架。在一些实施例中，可以用骨基质浸粘所述软骨细胞胞外基质，以获得软骨细胞胞外基质/骨基质支架。
在步骤140中，可以原代培养间充质干细胞。具体的，将获取的间充质干细胞置于细胞培养液中培养，至细胞进行第一次传代时，弃掉细胞培养液，制备并吸取细胞悬浮液，进行细胞培养。
在步骤150中，可以将间充质干细胞充分浸润软骨细胞胞外基质/骨基质支架，接着进行细胞培养，以获得成活的人工角膜支架。在一些实施例中，所述人工角膜支架可以是多孔结构，例如，海绵状结构。所述人工角膜支架可以放置于角膜的层间、前表面、结膜或粘膜下，用于人工角膜手术中替代骨、软骨或者牙齿骨，作为人工角膜的支架或者加固材料。
实施例1软骨细胞胞外基质/骨基质-脂肪间充质干细胞(DCECM/DBM-rADMSCs)复合支架的制备
【制备软骨细胞胞外基质/骨基质(DCECM/DBM)支架】
1-1软骨细胞胞外基质(DCECM)的制备
(1)取出生一天的胎牛关节软骨100g，用无菌蒸溜水清洗3次，每次10分钟；
(2)1％乙酸浸泡3次，每次3小时；
(3)-20℃冰柜低渗冻融8小时；
(4)化冰弃水加蒸溜水洗2次；
(5)3％过氧化氢液浸泡灭菌6小时；
(6)无菌三蒸水洗3次，每次10分钟；
(7)置粉碎机中粉碎至呈毫米、微米、纳米级有细胞的匀浆；
(8)置离心机上1000转离心10分钟后取上层微米、纳米级有细胞的匀浆；
(9)置离心机上5000转离心20分钟后取上层镜下观察无细胞的纳米级细胞外基质；
(10)置离心机上10000转离心30-40分钟后弃清亮三蒸水，取下层纳米级细胞外基质沉淀，加三蒸水混匀配成2％的细胞外基质匀浆，此即为脱细胞的关节软骨细胞胞外基质(DCECM)。
1-2骨基质(DBM)的制备
(1)取刚出生一天的胎牛松质骨锯成1-2mm厚的骨片，蒸馏水高压枪冲洗去除骨髓脂肪及骨髓细胞至外观呈乳白色
(2)1％乙酸浸泡6小时破细胞后用蒸馏水冲洗2次
(3)3％双氧水浸泡2次，每次6小时至外观呈白色
(4)蒸馏水洗2次，加入0.6％胰蛋白酶、10％乙二胺四乙酸(EDTA)和4％氢氧化钠将PH值调至7后脱细胞、脱钙至骨片空无骨髓，骨小梁基质变软，呈多孔的外观，即得到脱细胞的骨基质(DBM)。
(5)蒸馏水冲净残留后冷冻干燥24小时，置4度冰箱保存备用。
1-3软骨细胞胞外基质/骨基质(DCECM/DBM)支架的制备
(1)将脱细胞的关节软骨细胞胞外基质(DCECM)匀浆均匀地涂于脱细胞的骨基质(DBM)上下各表面，确保骨基质(DBM)的各面及其内部均被软骨细胞胞外基质(DCECM)填满；
(2)冷冻干燥24小时；
(3)将碳化二氧化铵(EDAC)加入95％乙醇中制成交联液，将DCECM/DBM置于该交联液中交联12小时；
(4)蒸馏水洗10次，每次5分钟；
(5)冷冻干燥24小时后用钴60灭菌3天；
【制备软骨细胞胞外基质/骨基质-脂肪间充质干细胞(DCECM/DBM-rADMSCs)复合支架】
1-4脂肪间充质干细胞(rADMSCs)的原代培养
(1)取患者皮下脂肪，并暂时存放于盛有5ml细胞培养液的瓶子里；
(2)瓶中加入2ml PBS冲洗脂肪块两遍，加入细胞培养液，用无菌剪刀剪碎脂肪块直至呈乳糜状，移液管吹打混匀，每次抽取2ml脂肪组织混悬液置于小的纱巾细胞培养瓶中，尽量将脂肪碎块置于纱巾上面，加入少量细胞培养液至刚刚没过脂肪组织块，注意不要让脂肪碎块漂起，将细胞培养瓶放在37℃、5％CO2细胞培养箱中；
(3)12小时后待脂肪组织块在纱巾上黏着完全后加入适量细胞培养液至纱巾漂起，以后每48h换一次细胞培养液；
(4)当细胞进行第一次传代时，弃掉培养液，用PBS冲洗3遍，加入胰酶轻微震荡10秒后弃掉胰酶，将细胞培养瓶水平放置约1分钟，加入8ml细胞培养液，吹打瓶壁多次，吸取细胞混悬液4ml传至另外1个培养瓶中，两个培养瓶分别加入2-3ml培养液后置于细胞培养箱中，24小时后换液，之后每24小时换液一次。
1-5软骨细胞胞外基质/骨基质-脂肪间充质干细胞(DCECM/DBM-rADMSCs)复合支 架的制备
(1)弃细胞培养液，5mlPBS冲洗3次；
(2)加入1ml0.25％EDTA消化1分钟；
(3)加入6mlPBS，一次性移液管反复吹打瓶壁细胞；
(4)将细胞混悬液加入盛有3ml细胞培养液的50ml离心管中；
(5)按照上述方法将余下培养瓶中的细胞移入前述的50ml离心管中；
(6)将50ml离心管置离心机上按照3700转离心5分钟后弃掉上清液，加入1ml细胞培养液，轻轻吹打细胞团至呈混悬液；
(7)吸取细胞混悬液将其均匀地滴在DCECM/DBM支架上至支架完全被细胞混悬液浸润，将盛有DCECM/DBM支架的离心管倾斜置于细胞培养箱中，离心管与水平面呈15度角以防细胞从支架上漏到管底，静置培养4h。DCECM/DBM支架事先被分装在5ml的无菌离心管中；
(8)4小时后加入4ml细胞培养液，将离心管竖直放置于细胞培养箱中培养12小时待用。
实施例2软骨细胞胞外基质/骨基质-兔脂肪间充质干细胞(DCECM/DBM-rADMSCs)复合支架的病理组织学检查
2-1以与实施例1相同的方式制备软骨细胞胞外基质/骨基质(DCECM/DBM)支架
2-2兔脂肪间充质干细胞(rADMSCs)的原代培养
(1)速眠新+氯胺酮(1:1)按照0.3ml/kg肌肉注射麻醉；
(2)将兔子置于手术台上，剔除手术区域毛发，碘伏棉球消毒术野三遍，酒精擦拭三遍；
(3)于兔子右下腹股沟处做长约3cm切口，深度达皮下组织，钝性分离皮下组织，边分离边探查直至找到皮下脂肪，小心剪取块状脂肪组织，过程注意避开大血管防止出血，剪下的脂肪组织暂时存放于盛有5ml 10％DMEM-F12细胞培养液的瓶子里，止血，3-0线分层缝合筋膜及皮肤，碘伏消毒，包扎；
(4)瓶中加入2ml PBS冲洗脂肪块两遍，加入5ml10％DMEM-F12细胞培养液，用无菌剪刀剪碎脂肪块直至呈乳糜状，移液管吹打混匀，每次抽取2ml脂肪组织混悬液置于小的纱巾细胞培养瓶中，尽量将脂肪碎块置于纱巾上面，加入少量10％DMEM-F12细胞培养液至刚刚没过脂肪组织块，注意不要让脂肪碎块漂起，将细胞培养瓶放在37℃、5％CO2细胞培养箱中；
(5)12小时后待脂肪组织块在纱巾上黏着完全后加入适量10％DMEM-F12细胞培养液至纱巾漂起，以后每48h换一次细胞培养液；
(6)当细胞生长到第10天的时候进行第一次传代，弃掉培养液，用PBS冲洗3遍，加入1.5ml 0.25％胰酶轻微震荡10秒后弃掉胰酶，将细胞培养瓶水平放置约1分钟，加入8ml10％DMEM-F12细胞培养液，吹打瓶壁多次，吸取细胞混悬液4ml传至另外1个培养瓶中，两个培养瓶分别加入2-3ml培养液后置于细胞培养箱中，24小时后换液，之后每24小时换液一次。
2-3软骨细胞胞外基质/骨基质-兔脂肪间充质干细胞(DCECM/DBM-rADMSCs)复合 支架的制备
(1)弃细胞培养液，5mlPBS冲洗3次；
(2)加入1ml0.25％EDTA消化1分钟；
(3)加入6mlPBS，一次性移液管反复吹打瓶壁细胞；
(4)将细胞混悬液加入盛有3ml 10％DMEM-F12细胞培养液的50ml离心管中；
(5)按照上述方法将余下培养瓶中的细胞移入前述的50ml离心管中；
(6)将50ml离心管置离心机上按照3700转离心5分钟后弃掉上清液，加入1ml10％DMEM-F12细胞培养液，轻轻吹打细胞团至呈混悬液；
(7)吸取细胞混悬液将其均匀地滴在DCECM/DBM支架上至支架完全被细胞混悬液浸润，将盛有DCECM/DBM支架的离心管倾斜置于细胞培养箱中，离心管与水平面呈15度角以防细胞从支架上漏到管底，静置培养4h。DCECM/DBM支架事先被分装在5ml的无菌离心管中；
(8)4小时后加入4ml 10％DMEM-F12细胞培养液，将离心管竖直放置于细胞培养箱中培养12小时待用。
图2示出了软骨细胞胞外基质/骨基质-兔脂肪间充质干细胞(DCECM/DBM-rADMSCs)复合支架的显微照片及扫描电镜图，确认了DCECM-DBM支架上，布满了大量的-rADMSCs。
其中，图2中A-C为对照组，其示出了rADMSCs的细胞形态，通过对rADMSCs分别进行HE、甲苯胺蓝染色及藩红固绿染色，在显微镜下观察，可见rADMSCs细胞呈典型的纺锤体外观，中间有1～2个细胞核。
图2中D-I示出了通过对DCECM/DBM-rADMSCs复合支架分别进行HE、甲苯胺蓝染色及藩红固绿染色后的显微照片，可见支架呈多孔状，支架表面及内部分布着大量的胶原纤维，支架上布满大量的rADMSCs。
图2中J-L为DCECM-DBM-rADMSCs支架的扫描电镜图，可见支架呈多孔状，支架上的胶原纤维清晰可见，支架上可见大量的rADMSCs。
实施例3软骨细胞胞外基质/骨基质-兔脂肪间充质干细胞(DCECM/DBM-rADMSCs)复合支架软骨生成效果的动物实验
3-1根据实施例2制备软骨细胞胞外基质/骨基质-兔脂肪间充质干细胞(DCECM/ DBM-rADMSCs)复合支架
3-2兔眼角膜软骨细胞胞外基质/骨基质-兔脂肪间充质干细胞(DCECM/DBM- rADMSCs)复合支架自体移植术
(1)陆眠新：咪达唑仑＝1:1，0.2ml/Kg肌肉注射麻醉；
(2)将兔置于手术台上，碘伏消毒右眼，酒精脱碘，铺无菌孔巾，置开睑器，倍诺喜点术眼；
(3)用角膜上皮刀刮除角膜上皮；
(4)距角膜缘2mm处做一长约3mm的板层切口，深度达角膜深基质层，用角膜板层刀由角膜缘向角膜中心边剥离边进刀，最终剥离出一个直径约5mm的角膜基质囊袋；
(5)将直径10mm的DCECM/DBM-rADMSCs复合支架置入角膜囊袋内，8-0线缝合角膜切口；
(6)360°分离球结膜，分离第三眼睑，将第三眼睑覆盖于角膜上，8-0线缝合固定于角巩膜缘，最后用8-0线将结膜对端缝合固定于第三眼睑上；
(7)术毕立即用地塞米松眼膏涂术眼，术后1周内每3天用左氧氟沙星滴眼液滴涂术眼；
(8)将搭载不同兔子脂肪间充质干细胞的复合支架分别移植到相应的兔角膜中以确保完成的是自体移植。
图3示出了DCECM-DBM-rADMSCs复合支架以及DCECM-DBM支架在植入兔眼角膜后临床以及病理组织学检查，从左到右依次为兔眼角膜的临床观察图、HE、甲苯胺蓝染色及天狼猩红染色。其中，图3中A为两种支架在植入兔眼角膜3个月后的检查结果，图3中B为两种支架在植入兔眼角膜6个月后的检查结果，图3中C为两种支架在植入兔眼角膜12个月后的检查结果。
DCECM-DBM-rADMSCs自体植入后随着时间的推移，从外观来看，支架没有发生大范围的降解，未出现明显的炎症以及排斥反应。并且，随着时间的推移，支架逐渐体现出软骨或骨的外观。从病理组织学的角度来看，随着时间的推移，支架与受体角膜结合得越来越紧密，未见炎症细胞，支架未发生明显的降解。
DCECM-DBM植入后随着时间的推移，从外观来看，支架逐渐被降解，到术后第12个月的时候，受体角膜中基本上观察不到支架的存在。从病理组织学的角度来看，随着时间的推移，支架逐渐降解，支架与受体角膜无法结合。
图4示出了DCECM-DBM-rADMSCs复合支架和DCECM-DBM支架植入兔眼角膜后成软骨特异性检查，左侧为藩红固绿染色，右侧为茜素红染色。
参见图4中A，DCECM-DBM-rADMSCs自体移植术后第3个月，通过藩红固绿染色可见受体角膜内的支架中出现了红色的软骨基质和蓝色的软骨细胞核(方框)，在同一个位置的茜素红染色中观察到了红色的骨细胞(圆框)；而DCECM-DBM组则未观察到上述表现。
参见图4中B，DCECM-DBM-rADMSCs自体移植术后第6个月，通过藩红固绿染色和茜素红染色可见许多类软骨(方框)及类骨组织(圆框)出现在受体角膜内的支架中以及支架与受体角膜连接处；而DCECM-DBM组则未观察到上述表现。
参见图4中C，DCECM-DBM-rADMSCs自体移植术后第12个月，通过藩红固绿染色和茜素红染色可见受体角膜内出现了大量的特异性的软骨板和骨板(五星)及软骨陷窝(三角)；而DCECM-DBM组则未观察到上述表现。
图5示出了DCECM-DBM-rADMSCs复合支架和DCECM-DBM支架植入兔眼角膜后，支架与受体角膜的结合情况。
DCECM-DBM-rADMSCs自体移植术后第3个月，支架(黑色箭头)与受体角膜(白色箭头)之间尚存在较大的空隙(白色虚线)，说明支架与受体角膜还不能进行有效的结合；术后第6个月，支架与受体角膜之间的空隙变小了，支架与受体角膜开始进行有限的结合；术后第12个月，支架与受体角膜之间未见明显的空隙，支架与受体角膜结合非常紧密。
DCECM-DBM移植术后，随着时间的推移，支架与受体角膜之间的空隙逐渐增大，支架与受体角膜不能结合在一起。
如在以上结果中所确定的，本发明的用于人工角膜的支架，有利于固定并紧密结合镜柱，减少人工角膜的排出、感染等的发生率。
应当理解的是，本文所述的示例性实施方式应仅在描述意义上考虑，而非用作限制目的。各实施方式中的特征或方面的描述通常应该被认为对于其他实施方式中的类似特征或方面而言也是可行的。

Claims (9)

1.一种用于人工角膜的支架，其特征在于，所述人工角膜支架为多孔结构，包括软骨细胞胞外基质，骨基质，以及间充质干细胞，其中，所述骨基质通过对动物松质骨组织进行脱细胞得到；所述软骨细胞胞外基质涂布于骨基质的至少一个表面；所述间充质干细胞在所述软骨细胞胞外基质和所述骨基质的作用下分化形成软骨细胞。
2.如权利要求1所述的支架，其特征在于，其中所述软骨细胞胞外基质由动物的软骨细胞分泌，或者由异体骨的软骨细胞分泌。
3.如权利要求2所述的支架，其特征在于，其中软骨细胞胞外基质通过对软骨组织进行脱细胞得到。
4.如权利要求1所述的支架，其特征在于，其中，所述间充质干细胞为选自如下的至少一种：(a)脂肪间充质干细胞；(b)骨髓间充质干细胞；(c)脐带间充质干细胞。
5.如权利要求4所述的支架，其特征在于，其中，所述脂肪间充质干细胞取自患者脂肪组织。
6.如权利要求4所述的支架，其特征在于，其中，所述骨髓间充质干细胞取自患者骨髓。
7.如权利要求1-6任一项所述的支架，其特征在于，所述软骨细胞胞外基质和/或骨基质促进间充质干细胞分化形成软骨细胞，由此提高人工角膜的在位率。
8.一种包含光学部分及支架的人工角膜，其中所述支架是权利要求1-7中的任一项所述的支架。
9.一种制备如权利要求1-7中任一项用于人工角膜的支架的方法，所述人工角膜支架为多孔结构，所述方法包括步骤：
(S1)对软骨组织进行脱细胞处理，以获得软骨细胞胞外基质；
(S2)对松质骨组织进行脱细胞，以获得骨基质；
(S3)将所述软骨细胞胞外基质涂布于所述骨基质的至少一个表面，以获得软骨细胞胞外基质/骨基质支架；
(S4)原代培养间充质干细胞；
(S5)将所述间充质干细胞充分浸润所述软骨细胞胞外基质/骨基质支架，接着进行细胞培养，其中，所述间充质干细胞在所述软骨细胞胞外基质和所述骨基质的作用下分化形成软骨细胞。
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