CN104837494A - 使用软骨来源细胞的胞外基质膜的治疗血管生成疾病的组合物、以及角膜或结膜的移植物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗血管生成疾病的新的组合物，所述组合物使用具有膜或膜片形式的软骨来源细胞的胞外基质膜，所述胞外基质膜是在将分离自动物软骨的软骨细胞进行单层培养时由所培养的软骨细胞分泌，本发明还提供用于角膜或结膜的移植物。本发明所述的治疗血管生成疾病的组合物以及用于角膜或结膜的移植物抑制内皮细胞的附着和增殖并阻碍内皮细胞的运动，从而抑制血管内皮细胞生长和血管浸润，由此最终抑制血管生成。

Description

使用软骨来源细胞的胞外基质膜的治疗血管生成疾病的组合物、以及角膜或结膜的移植物

技术领域

本发明涉及使用软骨细胞来源的胞外基质膜的用于治疗血管生成(angiogenesis)相关疾病的组合物、以及角膜或结膜的移植物。具体而言，本发明涉及基于软骨细胞来源的胞外基质膜的抗血管生成活性来治疗血管生成相关疾病(例如翼状胬肉)的组合物、以及角膜或结膜的移植物。

具体而言，本发明涉及基于支架的抗血管生成活性来治疗角膜血管生成相关疾病(例如翼状胬肉)的组合物、以及角膜或结膜的移植物，其中，所述支架使用得自动物的软骨组织和/或软骨细胞的软骨细胞来源的胞外基质以膜形式制作。

另外，本发明涉及与基于抗血管生成活性的软骨细胞来源的胞外基质膜相关的新用途，其中，由动物中的软骨组织和/或软骨细胞分泌形成的软骨细胞来源的胞外基质膜抑制血管内皮细胞的附着和增殖。另外，软骨细胞来源的胞外基质膜抑制血管内皮细胞的迁移，以抑制血管化(vascularization)或血管浸润，从而抑制血管生成。

背景技术

血管生成(或者也称为新生血管化)是指新血管的生成，推测基于发育过程和伤口愈合而诱导或调控。然而，血管生成引起组织退化的情况是人们所不期望的。特别是，血管生成与疾病(例如癌症、软骨的增生和血管浸润症、角膜血管生成症、糖尿病性视网膜病变、脉络膜血管生成相关疾病、黄斑部变性)密切相关。就这方面而言，推测抑制血管生成能提高上述疾病的治疗效果。

关于血管生成的机制，已知血管生成因子(例如血管内皮生长因子(VEGF)、FGF或PIGF)在形成相对于外周血管的微血管的癌细胞或组织中表达。另外，已知上述血管生成因子的表达通过缺血性损伤和炎症诱导。

角膜是无血管组织，为保持视力需要维持角膜的透明性。但是，在眼睛中也出现了血管生成症，并相应地引起眼部血管生成相关疾病。角膜血管生成能够降低眼部透明性，造成视力丧失。另外，视网膜血管生成可引起血管的不正常形成，通过血管中的渗出现象引起的视网膜细胞退化造成视力丧失。与此类眼部新生血管化相关的疾病包括角膜血管生成、糖尿病性视网膜病变、脉络膜血管生成相关疾病以及黄斑部变性。因此，眼部血管生成是不期望的，应当尽可能进行抑制。

就这方面而言，由于近年来平均寿命的增加、户外活动和运动的增多，外伤性眼科疾病的发病率也在增高，因此，对于有效且能够补充眼部血管生成相关疾病的现有疗法和外科手术的缺点的新的治疗进展的需求在显著增高。

例如，角膜血管生成涉及的翼状胬肉，在早期接受药物治疗，但是在严重损伤的情况下，实施外科手术(例如，血管切开术和结膜自体移植术)。然而，在血管生成相关疾病的情况下，存在高复发率(10％-45％)和并发症的问题。尤其是，上述外科手术不能被用于二次手术或者大范围的过量翼状胬肉的情况。

再次，角膜血管生成存在药物相关的副作用、并发症和外科手术局限性，需要开发新的治疗剂、医疗材料及治疗方法。基于这一要求，近来用于治疗角膜的新的生物医疗材料备受关注。

目前可使用的治疗角膜血管生成的医疗材料主要包括：用于青光眼的多孔胶原海绵，治疗烧伤、角膜损伤及翼状胬肉的来源于完整组织的羊膜。

关于使用上述羊膜的医疗材料，Bioland公司生产的AmniSite-Cornea在韩国开发，其它大部分产品都由美国公司开发。例如，由IOP公司生产的Ambio-dry2^TM被进口至韩国被用于翼状胬肉及角膜损伤。然而，所有这些产品均未被医疗保险涵盖，由于高的外科手术费用而由此造成患者的巨大负担。

因此，考虑到在大部分情况下依赖于昂贵的进口医疗产品的现状，迫切需要开发新技术和生物材料，以治疗血管生成相关疾病，由此取代进口产品。新产品也能够创造新的市场份额并预先占据优势。

关于这方面，韩国专利公开号10-0947553公开了通过将来源于动物或人体的羊膜用酒精、胰蛋白酶、碱性溶液和酸性溶液进行处理制备羊膜组织移植物材料的方法。依据该公开内容，其提供了当移植于具有角膜上皮缺陷的犬类模型中时，增强角膜上皮再生的羊膜。此外，韩国专利公开号100996846公开了作为由羊膜和非粘膜上皮细胞构成的角膜或结膜的移植物，该角膜或结膜的移植物具有足够的粘蛋白分泌细胞，从而有助于眼部表面稳定化，并在移植后具有高的植入和持久性。

然而，这些现有技术基于使用羊膜作为基础材料，从而生产角膜或者结膜的移植物。因而，同样存在与羊膜安全化相关的高生产成本的问题，大量生产受到限制。因此，在本发明中，认为迫切需要开发能够替代羊膜的新的医疗材料，能够用于以低成本大量生产并具有出色的生物相容性和疗效。

正因为如此，本发明人着眼于由血管生成引起的角膜混浊、以及随后的视力下降和失明并发症。作为潜心研究的结果，开发出能够防止血管生成的医疗材料，再次确认了软骨细胞来源的胞外基质膜具有优异的血管生成抑制效果。现在，将软骨细胞来源的胞外基质膜用于开发治疗血管生成相关疾病的组合物(包括角膜或结膜的移植物)。

发明内容

技术问题

本发明提供了利用软骨细胞来源的胞外基质膜的血管生成抑制作用，用于治疗角膜的新生血管化疾病(例如翼状胬肉)的组合物、以及角膜或结膜的移植物。

具体而言，本发明提供了利用软骨细胞来源的胞外基质膜的血管生成抑制作用，用于治疗角膜的血管生成相关疾病(例如翼状胬肉)的组合物、以及角膜或结膜的移植物，所述软骨细胞来源的胞外基质膜由来自动物的经培养的软骨细胞分泌而形成，并以膜状支架的形式制备。

另外，本发明提供了基于血管生成抑制作用的软骨细胞来源的胞外基质膜相关的新用途，所述软骨细胞来源的胞外基质膜由动物的软骨组织和/或软骨细胞分泌而形成，抑制血管内皮细胞的附着和增殖。另外，软骨细胞来源的胞外基质膜抑制血管内皮细胞的迁移，从而阻止血管化或血管浸润，由此最终抑制血管生成。

技术手段

本发明一方面提供了用于治疗血管生成相关疾病的新的组合物、以及角膜或结膜的移植物。

本发明的用于治疗血管生成相关疾病的组合物包含软骨细胞来源的胞外基质作为有效组分，其中，所述胞外基质由动物软骨分泌。

优选的是，软骨细胞来源的胞外基质主要由胶原蛋白和糖胺聚糖组成。

具体而言，软骨细胞来源的胞外基质可通过如下得到：将软骨组织进行脱细胞，将无细胞软骨组织用蛋白酶进行处理并中和；或者可通过如下得到：在分离自软骨组织的软骨细胞的单层培养过程中，对从软骨细胞分泌形成的胞外基质膜进行脱细胞。

本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物可抑制血管内皮细胞的附着和增殖。另外，本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物可抑制血管化和血管浸润，从而抑制血管生成。

例如，本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物可用于治疗角膜血管生成相关疾病，例如翼状胬肉或外伤性角膜溃疡。另外，本发明所述的用于治疗血管生成疾病的组合物可用于治疗糖尿病性视网膜病变、脉络膜血管生成相关的疾病或黄斑部变性。

本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物可通过如下得到：将软骨细胞来源的胞外基质膜变成粉末形式，并与药学上可接受的载体混合，从而制成滴眼剂或注射剂的滴注剂形式、或者膏剂或注射剂的凝胶形式。

也就是说，当本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物与药学上可接受的载体混合时能够以多种形式制备。例如，本文中使用的药学上可接受的载体可为粘结剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、助溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、染料、矫味剂等。在注射制剂的情况下，可将缓冲剂、防腐剂、缓和剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等用于混合物中。在注射制剂的情况下，本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物可制成单位剂量的安培瓶、或多倍剂量形式。另外，在局部给予的情况下，可使用基质、赋形剂、润滑剂、防腐剂等，但是本发明不限于此。根据本发明，对本领域普通技术人员来说显而易见的是，能够创造通过包含多种载体或添加剂制备的处于多种形式的用于治疗血管生成相关疾病的组合物。

同时，只要软骨细胞来源的胞外基质膜成分能够到达眼球，本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物可利用任何给予途径，例如所述途径可包括，针对眼球的局部给予或玻璃体内给予、或者向角膜给予、向结膜给予、向眼周给予、向前房给予、视网膜下给予或结膜下给予，但是并不限于此。

本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物的治疗有效量，可参考期望血管生成相关疾病的治疗效果所需的给予量。因此，可根据患者的疾病类型、疾病严重度、待给予的软骨细胞来源的胞外基质膜的制剂类型、患者年龄、患者性别、患者体重、患者健康状况和患者的饮食、给予时间、给予方法、给予途径、以及本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物的排出速度，对有效量进行调控。例如，当将本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物每天一次给予成人时次，组合物的量可为约0.1μg/kg-100mg/kg。

另外，本发明所述的角膜或结膜的移植物可通过如下形成：1)将软骨组织进行脱细胞得到软骨细胞来源的胞外基质，将无细胞软骨组织用蛋白酶进行处理并中和；或者2)在分离自软骨组织的软骨细胞的单层培养过程中，对从软骨细胞分泌形成的胞外基质膜进行脱细胞，得到软骨细胞来源的胞外基质。

关于本发明所述的角膜或结膜移植物，可将眼部细胞移植到软骨细胞来源的胞外基质膜中并进行培养。此处，眼部细胞为角膜干细胞，所述角膜干细胞经历了在围绕角膜的眼部表面边缘处的细胞分裂。例如，可将角膜缘干细胞、口腔粘膜细胞、或者非粘膜细胞移植到软骨细胞来源的胞外基质膜中并进行培养。

本发明所述的角膜或结膜移植物抑制血管内皮细胞的附着和增殖。另外，本发明所述的角膜或结膜移植物抑制血管化和血管浸润，从而抑制血管生成。

技术效果

根据本发明，可将软骨细胞来源的胞外基质膜的抑制血管生成的作用用来提供用于治疗角膜血管生成相关疾病(例如翼状胬肉等)的新的组合物，并可用来生产角膜或结膜的移植物。例如，可将软骨细胞来源的胞外基质膜的抑制血管生成的作用用来提供用于治疗角膜血管生成相关疾病(例如翼状胬肉)的新的组合物，以及形成角膜或结膜的移植物，所述软骨细胞来源的胞外基质膜通过对分离自动物的软骨组织的经培养的软骨细胞在膜状支架中分泌而形成。

另外，本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物以及角膜或结膜移植物可通过软骨细胞来源的胞外基质膜抑制血管内皮细胞的附着和增殖，所述软骨细胞来源的胞外基质膜由分离自动物的软骨组织的经培养的软骨细胞在膜状支架中分泌而形成。另外，本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物以及角膜或结膜移植物除抑制血管内皮细胞的迁移之外，还可抑制血管内皮细胞的血管化及血管浸润，从而最终抑制血管内皮细胞的血管生成。

因此，当使用本发明所述的治疗血管生成相关疾病的组合物以及角膜或结膜移植物时，可防止角膜的血管生成，从而防止角膜溃疡和损伤后的血管生成导致的角膜混浊以及随后的视力降低和失明并发症。

附图说明

接下来，在附图和实施例的描述中，为了方便，将术语“软骨细胞来源的胞外基质膜”简称为“CD-ECM”。

图1A为示出培养板中的软骨细胞和血管内皮细胞的附着率(％)的图，CD-ECM实验组及羊膜实验组各自在膜上接种软骨细胞，图1B为示出所测量的荧光强度的图，所述荧光强度用来表明培养板中的附着细胞的数量，CD-ECM实验组及羊膜实验组各自在膜上接种软骨细胞。

图2为示出培养板中的软骨细胞和血管内皮细胞的增殖率(％)的图，CD-ECM实验组及羊膜实验组各自在膜上培养软骨细胞。

图3示出表明如下各组中的血管生成活性的照片，仅包被Geltrex的细胞对照组、Geltrex/CD-ECM粉末的实验组、Geltrex/羊膜粉末的实验组，上述各组各自在确定的培养基中培养血管内皮细胞。

图4为示出如下各组中的每视野的血管数和血管长度的图，仅包被Geltrex的细胞对照组、Geltrex/CD-ECM粉末的实验组、Geltrex/羊膜粉末的实验组，上述各组各自在确定的培养基中培养血管内皮细胞。

图5示出了各脊髓样品的三维照片，在向裸鼠的脊髓中注入或者移植仅基质胶、基质胶/CD-ECM粉末、基质胶/羊膜粉末后一周获得样品，用相机拍照。

图6示出了表明各样品的组织切片的血管生成及免疫染色状态的显微照片，通过对向裸鼠的脊髓中注入仅基质胶、基质胶/CD-ECM粉末、基质胶/羊膜粉末一周后获得的样品进行化学染色(H&E)及免疫组织化学染色(α-SMA，CD31)来拍摄照片。

图7为示出了每单位面积的血管数和血管直径的图，所述血管数和血管直径相对于染色的显微照片使用IMAGE J程序进行测量和定量。

图8示出了表明各样品的组织切片的免疫染色状态的显微照片，通过对向裸鼠的脊髓中注入仅基质胶、基质胶/CD-ECM粉末、基质胶/羊膜粉末一周后获得的样品进行免疫染色(VEGF、HIF-1α、内皮抑制素)来拍摄照片。

图9示出了表明如下的照片：在兔的双眼中引起实验性的角膜新生血管化后，在向左眼球(实验组)中移植CD-ECM、而向右眼球(对照组)中没有进行任何移植的情况下，与未经CD-ECM处理的右眼球的对照组相比，在经CD-ECM处理的左眼球的实验组中，新生血管化受到了更大的抑制。

图10示出了在移出兔子眼球并对眼球进行免疫染色(CD31)以表明血管化状态之后得到的显微照片，其中，在兔子的双眼中引起实验性的角膜新生血管化后，兔子的左眼球移植CD-ECM(实验组)，兔子的右眼球未进行任何移植(对照组)。

图11示出了关于兔子眼部组织中的VEGF蛋白质表达水平的蛋白质印迹结果的图，其中，在兔子的双眼中引起实验性的角膜新生血管化后，兔子的左眼球移植CD-ECM(实验组)，兔子的右眼球未进行任何移植(对照组)。

图12示出了细胞片的显微照片，所述照片表明在移植至本发明所述CD-ECM上后的良好的细胞植入。

图13示出了组织学数据的显微照片，所述组织学数据证明了将上皮细胞片移植入兔子背部皮下组织中三周后的移植组织的植入，其中，上皮细胞片通过在本发明的CD-ECM上培养上皮细胞获得。

图14示出了免疫化学数据的显微照片，所述免疫化学数据证明了将上皮细胞片移植入兔子背部皮下组织中三周后的移植组织的植入，其中，上皮细胞片通过在本发明的CD-ECM上培养上皮细胞获得。

图15示出了表明如下的电子显微照片：上皮细胞与下部角膜基质层形成紧密接合(tight junction)，所述显微照片通过观察将上皮细胞片移植入兔子背部皮下组织中三周后的移植组织而获得，其中，上皮细胞片通过在本发明的CD-ECM上培养上皮细胞获得。

具体实施方式

本发明提供用于治疗血管生成相关疾病的新的组合物、以及角膜或结膜的移植物。

本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物包含软骨细胞来源的胞外基质，所述胞外基质由动物软骨分泌形成。

优选的是，软骨细胞来源的胞外基质主要由胶原蛋白以及糖胺聚糖形成。

具体而言，软骨细胞来源的胞外基质可通过如下得到：将软骨组织进行脱细胞，将无细胞软骨组织用蛋白酶进行处理并中和；或者可通过如下得到：在分离自软骨组织的软骨细胞的单层培养过程中，对从软骨细胞分泌形成的胞外基质膜进行脱细胞。

本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物抑制血管内皮细胞的附着与增殖。另外，本发明所述的用于治疗血管生成相关疾病的组合物抑制血管化和血管浸润，从而抑制血管生成。

本发明所述的角膜或结膜的移植物通过如下形成：1)将软骨组织进行脱细胞得到软骨细胞来源的胞外基质，将无细胞软骨组织用蛋白酶进行处理并中和；或者2)在分离自软骨组织的软骨细胞的单层培养过程中，对从软骨细胞分泌形成的胞外基质进行脱细胞，得到软骨细胞来源的胞外基质。

关于本发明所述的角膜或结膜移植物，可将眼部细胞移植到软骨细胞来源的胞外基质膜中并进行培养。此处，眼部细胞为角膜干细胞，所述角膜干细胞经历了在围绕角膜的眼部表面边缘处的细胞分裂，以便组织生长。例如，可将角膜缘干细胞、口腔粘膜细胞、或者非粘膜细胞移植到软骨细胞来源的胞外基质膜中并进行培养。

本发明所述的角膜或结膜移植物抑制血管内皮细胞的附着和增殖。另外，本发明所述的角膜或结膜移植物抑制血管化和血管浸润，从而抑制血管生成。

实施例

接下来，将根据示例性的实施例对本发明进行详细的描述，但本发明并不限于这些实施例。本发明以下述的多种形式具体化，但是不应被解释为限于本文阐明的示例性实施例。因此，本发明的详细描述及实施例将向本领域的普通技术人员传达本发明的范围，并且被解释为处于本发明的范围内。本文引用的所有参考文献以引用的方式并入本文。

实施例1：CD-ECM及羊膜的制备

本发明的示例性实施例所述的作为用于治疗角膜血管生成相关疾病的组合物以及角膜或结膜移植物的基础材料使用的软骨细胞来源的胞外基质膜(以下简称“CD-ECM”)是通过如下制备的膜状支架。

CD-ECM是通过对来自无菌猪中的膝软骨的软骨细胞进行收集和培养而制备的膜状的胞外基质膜。本文中使用的CD-ECM是目前在临床上用于仅为了软骨再生目的的矫形术中的材料。将在分离自无菌猪中的膝软骨的软骨细胞的单层培养过程中分泌的胞外基质干燥为膜形式或膜片形式，使用酶(例如DNase I)进行脱细胞，然后用PBS缓冲液漂洗。由此得到的胞外基质是厚度为10-20μm的生物膜，含有胶原蛋白和糖胺聚糖作为主要成分，并具有约25N/mm²的抗拉强度和10％的百分伸长率(参见韩国专利公布号10-0816395)。

此外，CD-ECM是通过分离自无菌猪的膝软骨的软骨细胞分泌得到的胞外基质成分制备的膜状的胞外基质膜。将无菌猪中的软骨组织粉碎成粉末，使用低渗裂解缓冲液(hypotonic lysis buffer)和酶(例如DNaseI)进行脱细胞，然后用蒸馏水或PBS进行漂洗，从而得到动物软骨来源的胞外基质粉末(参见韩国专利公布号10-1056069)。动物软骨来源的胞外基质粉末用加入蛋白酶的酸性水溶液进行处理，然后进行中和以重整成膜状支架。

对于本发明所述的使用CD-ECM的治疗血管生成疾病的组合物以及角膜或结膜的移植物，使用羊膜作为对照组，羊膜从Bioland公司得到(Cheonan，Chungcheongnam-do，韩国)。

另外，将在下述实施例中使用的CD-ECM粉末和羊膜粉末各自通过如下制备：将CD-ECM粉末和羊膜粉末各自的膜在-70℃的温度下冷冻干燥，并使用低温样品粉碎机(JFC-300，JAI，日本)。CD-ECM粉末和羊膜粉末在使用前于27℃的温度下使用离子气体灭菌24小时。

实施例2：细胞培养

将待用于体外试验及体内试验的、各自附着至实施例1的CD-ECM及对照组(即，羊膜)的血管内皮细胞和软骨细胞预先按照如下进行培养。

首先，将作为血管内皮细胞的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)在补充有生长因子(Promega，Wisconsin，USA)、10μg/ml bFGF及2％FBS的含内皮细胞的培养基中培养，放置于培养板上以每板接种1×10⁶个细胞，然后，在37℃的温度下于5％CO₂的培养箱内培养。在接种HUVEC两天后，移除未附着至培养板的细胞，而附着至培养板的细胞继续培养。在接种人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)14天后，通过使用胰蛋白酶移除附着至培养板的人脐静脉血管内皮细胞，然后，在180g下离心7分钟。将通过离心得到的细胞团块重悬于细胞培养基中。考虑到细胞增殖，将HUVEC再次放置到培养板上以每板接种1×10⁶个细胞，然后，培养至细胞稠密度达到70％-80％。

接着，从两周龄的雌性新西兰白兔(New Zealand white rabbit)的膝软骨中收集软骨组织，并用其中具有1mg/ml胶原蛋白酶(Worthington，NJ，USA)的DMEM进行处理，从而分离软骨细胞。将通过胶原蛋白酶处理得到的软骨细胞悬浮液使用尼龙网细胞滤器(nylon mesh cell strainer)(BD，MA，USA)仅过滤软骨细胞，并进行离心(1700rpm下10分钟)，从而仅分离软骨细胞。将分离的软骨细胞团块重悬于补充有10％FBS和1％抗生素-抗真菌剂(antibiotic-antimycotic)的DMEM中，放置在培养板上以每板接种1.5×10⁶个细胞，然后，在37℃的温度下于5％CO₂的培养箱内培养。然后，每三天更换新鲜的培养基。

实施例3：软骨细胞和血管内皮细胞(例如，HUVEC)的细胞附着分析

取决于实施例1的CD-ECM和对照组(即，羊膜)的材料，软骨细胞和血管内皮细胞(例如，HUVEC)在附着率方面的差异通过如下证实。

首先，将CD-ECM(直径为5mm)和羊膜各自独立地附着至24孔皿，干燥，并使用离子气体灭菌。然后，将在其上各自独立地包被CD-ECM和羊膜的24孔皿分别接种1×10³个软骨细胞和1×10³个血管内皮细胞。为进行细胞的荧光染色，向其中加入40μl钙黄绿素AM(2μg/ml)(Invitrogen，Wisconsin，USA)，然后，在37℃的温度下于5％CO₂的培养箱内培养24小时。此处，将补充有10％FBS和DMEM的培养基用于培养软骨细胞，而将补充有10μg/ml bFGF、2％FBS和内皮细胞生长培养基的培养基用来培养血管内皮细胞。同时，作为对照组，将典型的细胞培养板(其上的膜未粘附)用于在与上述相同的条件下移植并培养软骨细胞和血管内皮细胞。

在24小时后，移除培养基以对未附着至培养基的细胞数量进行计数，通过计算细胞的附着率而对其进行定量。另外，对附着至培养基的细胞进行荧光染色，以使用酶标仪测定染色细胞的荧光强度，由此对附着至培养基的细胞数量进行定量。定量结果数据使用GraphPad软件通过student t检验进行分析。student t检验重复5次，结果以平均值和标准偏差示出(统计学意义：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

结果示于图1A中，在CD-ECM实验组与羊膜实验组的比较中，各组移植了软骨细胞，比起羊膜实验组，CD-ECM实验组显示出了相对更高的软骨细胞附着率(％)。然而，在CD-ECM实验组与羊膜实验组的比较中，各组移植了血管内皮细胞，证实了比起CD-ECM实验组，羊膜实验组显示出相对更高的血管内皮细胞附着率(％)。

这些结果与图1B中所示的荧光强度的测量结果一致。关于附着细胞的数量和荧光强度测量结果，确认了在CD-ECM实验组与羊膜实验组之间存在显著差异。也就是说，在使用形成CD-ECM的材料的情况下，软骨细胞的附着率高，但是与血管生成相关的血管内皮细胞的附着受到显著抑制。然而，在使用形成羊膜的材料的情况下，与形成CD-ECM的材料相比，与血管生成相关的血管内皮细胞的附着率更高，而血管内皮细胞的附着未受到抑制。

实施例4：软骨细胞和血管内皮细胞(例如，HUVEC)的细胞增殖分析

取决于实施例1的CD-ECM和对照组(即，羊膜)的材料，软骨细胞和血管内皮细胞(例如，HUVEC)在增殖率方面的差异通过如下证实。

首先，将CD-ECM(直径5mm)和羊膜各自独立地附着至24孔皿，干燥，并使用离子气体灭菌。然后，将在其上各自独立地包被CD-ECM和羊膜的24孔皿分别接种1×10³个软骨细胞和1×10³个血管内皮细胞。将细胞在37℃的温度下于5％CO₂的培养箱内培养7天。此处，将补充有10％FBS和DMEM的培养用于培养软骨细胞，而将补充有10μg/mlbFGF、2％FBS和内皮细胞生长培养基的培养基用于培养血管内皮细胞。每三天更换新鲜的培养基。然后，在细胞培养第一天、第四天和第七天进行MTT分析，从而确定分别包被在CD-ECM和羊膜上的细胞的增殖率(其中，将酶标仪用于比较性地计算在460nm下测量的光密度值)。同时，作为对照组，将典型的细胞培养板(其上的膜未粘附)用于在上述相同的条件下移植并培养软骨细胞和血管内皮细胞。

结果示于图2中，在CD-ECM实验组与羊膜实验组之间的比较中，各组移植了软骨细胞，比起羊膜实验组，在细胞培养的第四天和第七天，CD-ECM实验组显示出了相对更高的软骨细胞增殖率。

然而，在CD-ECM实验组与羊膜实验组之间的比较中，各组移植了血管内皮细胞，确定了比起CD-ECM实验组，在细胞培养的第四天和第七天，羊膜实验组显示出了相对更高的血管内皮细胞增殖率。

因此，关于在细胞培养的第四天和第七天的软骨细胞和血管内皮细胞的增殖率，确定了在CD-ECM实验组与羊膜实验组之间存在显著差异。也就是说，在使用形成CD-ECM的材料的情况下，软骨细胞的增殖率高，但是与血管生成相关的血管内皮细胞的增殖受到抑制。然而，在使用形成羊膜的材料的情况下，与形成CD-ECM的材料相比，与血管生成相关的血管内皮细胞的增殖率高，而血管内皮细胞的附着未受到抑制。

实施例5：血管化分析

如下所述，对用于形成实施例1的CD-ECM的材料进行评价，从而确定该材料是否能够抑制血管内皮细胞的血管生成。

将100μl Geltrex基质膜(Gibco BRL，Cat.12760-021)包被在24孔皿上，然后，将皿在37℃的温度下孵育30分钟，从而使各孔中的Geltrex聚合。然后，将实施例1的CD-ECM粉末及羊膜粉末加入到包被有聚合Geltrex的各皿里，然后，向24孔皿的各孔接种1.9×10⁴个血管内皮细胞，由此培养细胞24小时。另外，为实施用于确定培养后的血管内皮细胞的血管生成的染色，向细胞中加入钙黄绿素AM(2μg/ml)(Invitrogen，Wisconsin，USA)。此处，将补充有100ng/ml bFGF、10％FBS和内皮细胞生长培养基的培养基用于培养血管内皮细胞。同时，作为对照组，将仅包被Geltrex而不含CD-ECM粉末及羊膜粉末的24孔皿在与上述相同的条件下移植并培养血管内皮细胞。

在细胞染色后，对培养后的各实验组观察24小时。然后，基于通过利用数码相机得到的照片对各孔的10个视野中的血管数进行计数，然后，利用Image J程序计算血管的长度和面积。使用GraphPad软件依据studentt检验得到用于分析每视野的血管数和血管长度的定量结果数据。studentt检验重复五次，结果以平均值和标准偏差示出(统计学意义：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

结果示于图3中，确认混有CD-ECM粉末的实验组抑制了血管生成。此外，如图4所示，当对每视野的血管的数量和长度进行定量时，确认了与混有羊膜粉末的实验组相比，混有CD-ECM粉末的实验组显示出更少数量的血管(参见图4A)，并且与混有羊膜粉末的实验组相比，混有CD-ECM粉末的实验组显示出更短的血管(参见图4B)。

因此，确认了本发明的CD-ECM粉末能够强烈地抑制血管内皮细胞的血管生成，而传统的羊膜粉末不能显著地抑制血管内皮细胞的血管生成。

根据实施例3-5的体外实验，确认本发明用于形成CD-ECM的材料能够抑制血管内皮细胞的附着和增殖，并且还能抑制血管内皮细胞的血管化和血管浸润，由此最终抑制血管内皮细胞的血管生成。

实施例6：基质胶的血管浸润的肉眼观察

使用于形成实施例1的CD-ECM的材料接受评价，以确定该材料是否可以抑制血管浸润，所述评价采用基质胶浸润分析(BDBioscience，Cat.354234和356234)以裸露眼球进行测试。

首先，将实施例1的CD-ECM粉末或羊膜粉末与基质胶混合，然后，将混合物注射入裸鼠的背部皮下组织。作为对照组，仅将基质胶注射入裸鼠的背部皮下组织。此处，将“基质胶”、“基质胶+CD-ECM粉末”和“基质胶+羊膜粉末”各自沿脊椎的两侧注射入10只裸鼠中，以便移植物处于纵向方向。在移植一周后，将各脊椎样品进行收集并进行肉眼观察，从而确定样品的形状、大小及样品中的血管浸润的存在。

图5中示出了通过CCD照相机拍摄的三维图像的结果，确认了如下：仅用基质胶进行处理的对照组与用基质胶和羊膜粉末处理的实验组表现出增高的血管浸润，而用基质胶和CD-ECM粉末处理的实验组表现出抑制血管浸润。

因此，确认了与传统的羊膜材料相比，本发明的用于形成CD-ECM的材料对血管浸润具有更强的抑制作用。

实施例7：基质胶的血管浸润的免疫组织化学观察与分析

使用于形成实施例1的CD-ECM的材料接受评价，从而确定该材料是否可以抑制血管化及血管浸润，并且所述评价使用基质胶浸润分析在免疫组织化学上进行观察和分析。

首先，将实施例1的CD-ECM粉末或羊膜粉末与基质胶混合，然后，将混合物注射入裸鼠的背部皮下组织。作为对照组，仅将基质胶注射入裸鼠的背部皮下组织。此处，将“基质胶”、“基质胶+CD-ECM粉末”和“基质胶+羊膜粉末”各自沿脊椎的两侧注射入10只裸鼠中，以便移植物处于纵向方向。在移植一周后，收集各脊椎样品。

将收集的样品用4％福尔马林固定24小时，然后脱水，在进行石蜡包埋后制作4μm厚的切片。另外，为观察血管的分布和形态，根据本领域众所周知的方法使用苏木精/曙红(H&E)进行染色。

此外，为确定α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)标记物与血管内皮细胞标记物(CD31)的表达(表明各样品中存在血管生成)，使收集的样品各自接受根据本领域公知的方法进行的免疫化学染色

此外，根据各样品的化学染色(例如，H&E染色)和免疫化学染色(针对α-SMA和CD31)，通过使用显微镜(Nikon E600，日本)检测确定血管生成的存在(参见图6)。根据染色的显微照片，通过使用Image J程序(Wayne Rasband，National Institutes of Health，USA)对每单位面积的血管数和血管的直径进行测定和定量(参见图7)。

结果示于图6和图7中。图6示出在进行化学染色(例如，H&E染色)和免疫化学染色(针对α-SMA和CD31)后的各样品组织切片在400×放大倍数(Nikon E600，日本)下的显微照片。通过实施化学染色(例如，H&E染色)识别血管生成的存在，作为结果确认了：仅用基质胶处理的对照组与用基质胶和羊膜粉末处理的实验组表现出血管浸润，而用基质胶和CD-ECM粉末处理的实验组表现出抑制血管化及血管浸润。

此外，作为使用针对α-SMA和CD31的免疫化学染色识别各实验组中的血管生成的存在的结果，确认了仅用基质胶处理的对照组与用基质胶和羊膜粉末处理的实验组显示出表明α-SMA及CD31的表达的免疫化学染色图像，而用基质胶和CD-ECM粉末的实验组显示出清晰的未染色的图像(表明α-SMA和CD31未表达)。此处，在用基质胶和CD-ECM粉末处理的实验组中未识别出血管结构。

另外，如图7中所示，当根据染色的组织切片对每单位面积的血管数(即，毛细结构/mm²)和血管直径(即，毛细结构直径，μm)进行测定和定量时，用基质胶和CD-ECM粉末处理的实验组显示出无血管结构。同时，与用基质胶和CD-ECM粉末处理的实验组以及仅用基质胶处理的对照组相比，用基质胶和羊膜粉末处理的实验组显示出更长的血管和更多数量的血管。

因此确认了，与传统的羊膜材料相比，本发明的用于形成CD-ECM的材料具有更强的血管化及血管浸润的抑制作用。

实施例8：血管生成因子及抗血管生成因子的免疫组织化学观察与分析

按照与本发明实施例7相同或相似的方法来收集各样品，然后，实施免疫组织化学分析和评价以确认各实验组中的血管生成因子(angiogenic factor)和抗血管生成因子(anti-angiogenic factor)的表达。

将按照与本发明实施例7相同或相似的方法收集的各样品，根据本领域公知的方法进行免疫化学染色以识别血管生成因子(例如，VEGF、HIF-1α等)和血管生成抑制因子(例如，内皮抑制素)的表达。然后，通过显微镜(Nikon E600，日本)识别经由在各样品上实施的免疫化学染色(针对VEGF、HIF-1α和内皮抑制素)观察到的血管生成的存在(参见图8)。

图8显示了进行免疫化学染色(针对VEGF、HIF-1α和内皮抑制素)后的各样品组织切片在400×放大倍数(Nikon E600，日本)下的显微照片。通过针对血管生成因子(例如VEGF和HIF-1α)进行免疫化学染色识别各实验组中血管生成的存在，作为结果确认了，仅用基质胶处理的对照组与用基质胶和羊膜粉末处理的实验组显示出经免疫染色的VEGF和HIF-1α(表明了它们的表达)。然而，用基质胶和CD-ECM粉末处理的实验组显示出未染色的VEGF及HIF-1α(表明它们未表达)。此处，在用基质胶和CD-ECM粉末处理的实验组中未识别出血管结构。

同时，通过针对抗血管生成因子(例如，内皮抑制素)进行免疫化学染色来识别各实验组中的血管生成的存在，作为结果确认了，内皮抑制素在血管化及血管浸润的区域表达，因此，识别出了针对内皮抑制素的阳性染色。

因此确认了，与传统的羊膜材料相比，本发明的用于形成CD-ECM的材料具有更强的抑制血管化及血管浸润的作用，因此，在形成血管的组织中观察到抗血管生成因子的表达。

因此，根据实施例3-8的实验确认了，本发明的用于形成CD-ECM的材料能够抑制血管内皮细胞的附着和增殖，并且除抑制血管内皮细胞的运动外，还能有效地抑制血管内皮细胞的血管化和血管浸润，由此最终抑制血管内皮细胞的血管生成。因此，可将本发明的用于形成CD-ECM的材料用来形成治疗血管生成相关疾病的组合物以及进行角膜或结膜移植。

实施例9：角膜血管生成抑制效果的动物实验

为确认本发明的用于形成CD-ECM的材料是否能够用来形成治疗血管生成相关疾病的组合物以及进行角膜或结膜移植，实施了动物实验。也就是说，将八周龄的新西兰白兔用于实验性地引起双眼球中的角膜血管生成。然后，将一只眼球(左眼球：实验组)移植CD-ECM，同时另一只眼球(右眼球：对照组)不进行移植，由此比较本发明的CD-ECM的角膜血管生成的抑制效果。实验方法及实验结果如下。

A.引起角膜血管生成发生的模型的制备

为引起角膜血管生成的发生，使新西兰白兔的角膜缘接受使用7-0mersilk在中层基质(mid-stromal level)处构建的四点缝合。

B.制备CD-ECM和羊膜

通过本发明实施例1的CD-ECM制备CD-ECM，采用在剖腹产术后立即从产妇的胎盘分离的羊膜来制备羊膜，其中，所述产妇在乙肝、丙肝、HIV及梅毒的血清检查中呈阴性。将由此分离的羊膜用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗后，在硝化纤维素纸上展成薄层从而以相对的方向获取羊膜上皮，加入培养基，所述培养基中的DMEM(Dulbecco’s ModifiedEagle Medium)与100％的甘油按照1:1的比例混合，然后放入冰箱或者置于-70℃的温度下。

C.CD-ECM及羊膜的移植

在制备与眼球中的血管生成相关的模型4天后，使新西兰白兔接受向股肌中肌内注射舒泰(zoletil)(15mg/mg)和赛拉嗪(5mg/mg)(阿托品2A/只)，然后实施全身麻醉。随后，将0.5％盐酸丙美卡因(Alcon Laboratories,Inc.，Fort Worth，Texas，USA)向新西兰白兔的眼中滴入两次，实施局部麻醉。

为将CD-ECM及羊膜固定在新血管的周围，使新西兰白兔接受10-0尼龙线缝合。然后，每天3次向新西兰白兔施用左氧氟沙星(Santen Pharmaceutical Company，Osaka，日本)眼药水至一周。

D.抗血管化效果(血管生成抑制效果)的评价

最后，经过四天的血管生成诱导，从动物模型移除缝合线，然后使动物模型经历CD-ECM外科手术程序。七天后，用裸眼观察在麻醉下的动物模型的眼球，以便检测血管生成的程度。肉眼观察的结果示于图9中，确认了与没有用CD-ECM进行处理的右眼球对照组相比，用CD-ECM处理的左眼球的实验组中的血管生成在更大程度上受到抑制。

此外，在CO₂箱中处死在麻醉状态下的兔子，摘除兔子的眼球进行组织学分析。首先，为了解手术部位的血管化程度，使血管内皮细胞标记物CD31接受本领域公知的免疫化学染色，从而观察血管数量的变化。如图10中所示，在实施针对血管内皮细胞标记物CD31的免疫化学染色后，对眼部组织切片进行分析。结果确认了，与未移植CD-ECM的右眼球对照组相比，移植了CD-ECM的左眼球实验组中的血管化和CD31的表达显著降低。

另外，在血管生成中起重要作用的VEGF的表达量通过本领域公知的蛋白质印迹方法进行分析。如图11中所示，将从眼部组织提取的蛋白质进行蛋白质印迹分析，以检测VEGF的表达量，结果确认了，与未移植CD-ECM的右眼球对照组相比，移植了CD-ECM的左眼球实验组的VEGF的表达量显著降低。

因此，当将本发明的用于形成CD-ECM的材料用来形成治疗血管生成相关疾病的组合物以及进行角膜或结膜移植时，可防止角膜的血管生成，由此防止角膜溃疡和损伤后的血管生成导致的角膜混浊以及随后的视力下降和失明并发症。

实施例10：作为对位于角膜缘的角膜上皮干细胞进行移植的介质的可能性

认为角膜的透明性是眼睛正常功能中最基本且重要的因素。角膜上皮干细胞通过位于角膜缘的干细胞而持续地维持健康状态，但是一旦受到热损伤或化学损伤、Stevens-Johnson综合征、多次手术、感染性疾病等，可能会出现致命且不可逆的视力丧失。另外，长期佩戴隐形眼镜的正常患者群中可能会经历角膜上皮细胞损伤。就这方面而言，对于眼部表面疾病的处理存在很大的需求。

使本发明的用于形成CD-ECM的材料接受检测，从而确定是否可将该材料用作施行引起严重的视力丧失的眼部表面疾病中的角膜上皮干细胞移植的基础材料。从2.5kg重的白兔中取得角膜缘干细胞，在用于形成CD-ECM的材料上增殖，然后，再移植至移除了上皮的角膜组织中，以便指明在组织中用作移植材料的适宜性和可能性。

首先，将从白兔提取的角膜缘组织分为12片，并放入组织培养容器中。将这些片用分散酶缓冲液进行处理，以由此分离上皮细胞，然后，接受连续的培养。随后，为将培养的上皮细胞移植到切成6mm圆形的CD-ECM中，将制备的CD-ECM铺放在组织培养容器的底部。将经培养的细胞分出用于培养，以便制备细胞片。

如图12中所示，观察到预先用PKH26标记的上皮细胞为红色，表明上皮细胞聚集在一起形成密集状态(参见图12A)。在图12中还确认了，红色的上皮细胞在横断面组织中形成双层，表明其中的良好的植入(参见图12B)。

然后，使白兔的角膜接受环锯手术以切成6mm大小，从而获得角膜组织。随后，根据环锯手术，通过使用20％乙醇将上皮细胞全部移除。将预先制备的上皮细胞片移植入角膜组织的上皮部位，然后，移植入无胸腺Balb/C小鼠的背部皮下组织。经三周培养后，观察移植组织以确定植入。

在图13中示出对在皮下组织培养三周后的组织进行分析的结果，确认了与CD-ECM上皮细胞片未附着的对照组(A-B)以及仅CD-ECM附着的对照组(C-D)相比，附着了CD-ECM的上皮细胞片的实验组(E-F)的上皮细胞以更好地方式形成。另外还确认了，上皮细胞与下部角膜基质层形成紧密结合。

此外，在图14中示出了对免疫化学染色进行分析的结果，确认了与CD-ECM上皮细胞片未附着的对照组(A-B)以及仅CD-ECM附着的对照组(C-D)相比，在附着CD-ECM上皮细胞片的实验组(E-F)中，对上皮细胞具有特异性的CK 3+/MUC 5A-以更好的方式体现表型。

另外，图15示出了表明角膜上皮细胞与下部角膜基质层形成紧密接合的电子显微照片。

如在以上结果中所确定的，认为在引起角膜盲的难治性眼部表面疾病方面，本发明的用于形成CD-ECM的材料是有用的材料，可用于与如下相关的处理：培养自身或其它来源的角膜缘干细胞、口腔粘膜细胞、或非粘膜细胞，以及移植细胞片。

应当理解的是，本文所述的示例性实施方式应仅在描述性意义上考虑，而非用作限制的目的。各实施方式中的特征或方面的描述通常应该被认为对于其它实施方式中的类似特征或方面而言也是可行的。

工业实用性

根据本发明，可将CD-ECM的血管生成抑制作用用来提供治疗角膜血管生成相关疾病(例如翼状胬肉)的新的组合物、以及角膜或结膜的移植物，其中，所述CD-ECM通过来源于养殖动物中的软骨的软骨细胞分泌并在膜状支架中形成。

Claims (13)

1.一种用于治疗血管生成相关疾病的组合物，所述组合物包含软骨细胞来源的胞外基质作为有效成分，所述胞外基质由动物的软骨细胞分泌。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述软骨细胞来源的胞外基质主要由胶原蛋白和糖胺聚糖组成。

3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述软骨细胞来源的胞外基质通过如下得到：将软骨组织进行脱细胞，将无细胞软骨组织用蛋白酶进行处理并中和。

4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述软骨细胞来源的胞外基质通过如下得到：在分离自软骨组织的软骨细胞的单层培养过程中，对从所述软骨细胞分泌形成的胞外基质膜进行脱细胞。

5.如权利要求1所述的组合物，其中，所述软骨细胞来源的胞外基质抑制血管内皮细胞的附着和增殖。

6.如权利要求1所述的组合物，其中，所述软骨细胞来源的胞外基质抑制血管化和血管浸润，由此抑制血管生成。

7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中，所述血管生成相关疾病包括：角膜血管生成相关疾病、糖尿病性视网膜病变、脉络膜血管生成相关疾病或黄斑部变性。

8.如权利要求7所述的组合物，其中，所述角膜血管生成相关疾病是翼状胬肉或外伤性角膜溃疡。

9.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中，所述组合物通过如下得到：将所述软骨细胞来源的胞外基质与药学上可接受的载体混合，制成滴眼剂或注射剂的滴注剂形式、或者膏剂或注射剂的凝胶形式。

10.由软骨细胞来源的胞外基质形成的角膜或结膜的移植物，其中，所述软骨细胞来源的胞外基质通过如下形成：1)将软骨组织进行脱细胞，将无细胞软骨组织用蛋白酶进行处理并中和；或者2)在分离自软骨组织的软骨细胞的单层培养过程中，对从所述软骨细胞分泌形成的胞外基质膜进行脱细胞。

11.如权利要求10所述的角膜或结膜的移植物，其中，所述角膜或结膜的移植物通过如下获得：在所述软骨细胞来源的胞外基质膜上培养角膜缘干细胞、口腔粘膜细胞、或者非粘膜细胞。

12.如权利要求10或11所述的角膜或结膜的移植物，其中，所述角膜或结膜的移植物抑制血管内皮细胞的附着和增殖。

13.如权利要求10或11所述的角膜或结膜的移植物，其中，所述角膜或结膜的移植物抑制血管化和血管浸润，由此抑制血管生成。