KR101948156B1 - 알칼리 화상을 이용한 각막 혼탁증 동물모델 및 각막 혼탁증 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents
알칼리 화상을 이용한 각막 혼탁증 동물모델 및 각막 혼탁증 예방 또는 치료용 약학조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 동물의 중심 각막에 강염기를 이용한 알칼리 화상을 일으킴으로써 효과적으로 혼탁이 유도된 동물모델을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따라 유도된 각막 혼탁증 동물모델을 이용하여 시력손실에 가장 큰 원인이 되는 각막 혼탁증 치료용 의약제를 효과적으로 스크리닝할 수 있다. 또한 본 발명은 상기 동물모델 및 각막 혼탁증 치료제 스크리닝 방법을 통하여 검증된 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular membrane; CDECM)을 함유하는 혼탁증 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 각막 혼탁 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있는 알칼리 화상으로 유도된 각막 혼탁증 동물모델 및 스크리닝 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 각막 혼탁증 동물 모델을 이용한 치료제 스크리닝을 통하여 검증된 각막 혼탁증 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
각막의 여러 특징 중 하나인 무혈관 구조는 시력보존을 위하여 항상 투명성을 유지해야 한다. 그러나 각막 반흔 및 혼탁은 눈의 창문 역할을 하는 각막이 여러 가지 원인에 의해 투명성을 잃고 불투명해져 외관상 하얗게 되거나 각막의 일부가 뿌옇게 변한 상태를 말한다.
각막은 중심부 두께가 0.5mm 정도인 얇은 조직으로 심한 충격에 쉽게 파열될 수 있다. 또한 치유되더라도 그 자리에 하얗게 치유성 반흔이 남게 된다. 특히 눈 수술을 여러 차례 받은 경우, 각막이 그 자체를 맑게 유지하는 능력에 장애가 생겨 투명성을 잃고 하얗게 변할 수 있다. 이러한 수술후유증 외에도 눈에 염증이 생긴 경우 염증만 치유되고 혼탁이 남을 수 있는데 염증의 원인으로 콘택트렌즈에 의한 각막염 또는 각막의 상처, 부종, 지질 침적이 있으며 이와 같은 안구 장애는 시력을 감소시키고 면역세포 순환을 유도하여 각막의 면역 회피 및 각막 이식술 이후 이식 생존율을 감소시킨다.
각막의 알칼리 화상은 재발되는 상피세포 손상, 기질 세포사 및 심한 염증에 의한 전체 각막 층의 심각한 손상을 유도하는 모델 시스템으로 널리 사용되는 방법으로 주요 염증 세포 침윤, 광범위하게 형성되는 흉터 조직, 궤양, 간질 부종 및 각막 혼탁을 유발한다.
또한 알칼리 화상은 많은 염증성 세포들을 손상부위로 끌어들여 염증성 캐스케이드 반응을 유도하며 알칼리 화상에 의해 유도된 염증성 세포들은 혈관내피세포성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 염기성 섬유모세포 생장인자(basic fibroblast growth factor: bFGF), 매트릭스 메탈로 단백질효소(matrix metallopreoteinases; MMPs)의 합성을 유도함으로써 손상부위에 혼탁을 일으킨다.
상기 전술한 바와 같이 각막의 혼탁으로 인한 시력 손실은 전 세계적으로 문제가 되는 대표적인 건강문제로 눈의 각막 혼탁 관련 질환에 대하여 기존의 시술들의 단점을 보완하면서 효과적이고 안전한 치료법 개발의 필요성이 요구되어졌다.
따라서 이러한 각막 혼탁 치료를 위한 효율적인 방법으로 신뢰성있는 각막의 혼탁을 유도할 수 있는 동물모델의 확립과 치료제의 개발이 필요하다.
본 발명은 사람의 시력손상에 치명적인 각막 혼탁을 예방 또는 치료하기 위하여 알칼리 화상으로 유도된 각막 혼탁증 동물모델과 그 동물모델을 이용한 각막 혼탁 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 각막 혼탁증 동물모델을 이용한 치료제 스크리닝을 통하여 검증된 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular membrane; CDECM)을 유효성분으로 함유하는 각막 혼탁을 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 강염기를 이용하여 동물의 각막에 알칼리 화상을 유도함으로써 얻어진 각막 혼탁증 동물모델을 제공한다.
상기 강염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘 및 수산화바륨으로 이루어진 강염기 군에서 선택될 수 있다.
보다 상세하게는 상기 동물모델은 0.5 내지 5 노르말농도(N)의 수산화나트륨을 동물의 중심 각막에 적용하여 알칼리 화상을 유도하여 얻어진 각막 혼탁증 동물모델을 제공한다.
상기 동물모델은 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지 및 염소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 비인간 동물일 수 있다.
다른 구체예로 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular membrane; CDECM)을 유효성분으로 함유하는 각막 혼탁증 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
상기 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular membrane; CDECM)은 동물의 무릎관절 연골 세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질일 수 있다.
상기 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular membrane; CDECM)은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 10 중량부로 함유될 수 있다.
또한 상기 약학조성물은 상기 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular membrane; CDECM)을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 필름제로서 제공될 수 있다.
또 다른 구체예로 상기 각막 혼탁증 동물모델을 이용한 각막 혼탁 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
보다 상세하게는 상기 각막 혼탁증 동물모델을 이용하여 동물모델의 한쪽 눈에는 선별해낸 후보물질을 투여하고 다른 쪽 눈을 대조군으로 하여 후보물질의 각막 혼탁 치료 효과를 검증하는 것을 특징으로 하는 각막 혼탁 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따르면, 동물의 중심 각막에 강염기인 수산화나트륨을 이용하여 알칼리 화상을 유도함으로써 효과적인 각막 혼탁 동물모델을 제공할 수 있다. 또한 본 발명에 따라 유도된 동물모델을 이용하여 각막의 혼탁 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있는 각막 혼탁증 치료제를 스크리닝하는 방법 및 상기 치료제 스크리닝을 통하여 검증된 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular membrane; CDECM)을 유효성분으로 함유하는 각막 혼탁증 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 토끼 각막의 알칼리 화상 후 CDECM을 처리하여 0, 10 및 20일 후 CDECM의 효과를 나타낸 임상결과로 A는 가상 현미경(NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)으로 각막을 촬영한 결과이고 B는 신생혈관 생성 정도를 나타낸 그래프이며, C는 혼탁 정도를 나타낸 그래프이다.**P <0.01, ***P<0.001, NS는 유의한 차이를 보이지 않음을 의미하다.
도 2는 토끼 각막의 알칼리 화상 후 대조그룹과 CDECM 처리 실험 그룹의 10일 후 각막 두께 측정한 결과로 A는 가상 현미경(NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)을 이용하여 각막 두께 촬영결과이며, B는 측정된 두께를 그래프로 나타낸 결과로 ±표준편차 값을 이용하였으며 ***P<0.001, NS는 유의한 차이를 보이지 않음을 의미하다.
도 3은 토끼 각막의 알칼리 화상 후 CDECM에 의한 조직학적 변화를 가상 현미경(NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)으로 확인한 결과로 화살표 부분은 알칼리 화상 후 생성된 신생혈관과 CDECM의 신생혈관 생성 억제효과를 나타낸 결과이다. 도면의 *는 섬유증을 나타낸다.
도 4는 알칼리 화상으로 유도된 화학 손상 토끼 각막의 면역 조직 분석을 통한 CDECM의 효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 알칼리 화상으로 유도된 화학 손상 토끼의 각막 면역 블롯을 통하여 알칼리 화상 후 각막의 신생혈관 생성 유전자 및 핵 전사 인자의 발현에 미치는 CDECM의 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 알칼리 화상으로 유도된 각막 화학 손상 토끼를 이용하여 CDECM의 신생혈관 생성 억제 매커니즘을 확인하기 위한 면역 블롯 결과이다.
도 2는 토끼 각막의 알칼리 화상 후 대조그룹과 CDECM 처리 실험 그룹의 10일 후 각막 두께 측정한 결과로 A는 가상 현미경(NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)을 이용하여 각막 두께 촬영결과이며, B는 측정된 두께를 그래프로 나타낸 결과로 ±표준편차 값을 이용하였으며 ***P<0.001, NS는 유의한 차이를 보이지 않음을 의미하다.
도 3은 토끼 각막의 알칼리 화상 후 CDECM에 의한 조직학적 변화를 가상 현미경(NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)으로 확인한 결과로 화살표 부분은 알칼리 화상 후 생성된 신생혈관과 CDECM의 신생혈관 생성 억제효과를 나타낸 결과이다. 도면의 *는 섬유증을 나타낸다.
도 4는 알칼리 화상으로 유도된 화학 손상 토끼 각막의 면역 조직 분석을 통한 CDECM의 효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 알칼리 화상으로 유도된 화학 손상 토끼의 각막 면역 블롯을 통하여 알칼리 화상 후 각막의 신생혈관 생성 유전자 및 핵 전사 인자의 발현에 미치는 CDECM의 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 알칼리 화상으로 유도된 각막 화학 손상 토끼를 이용하여 CDECM의 신생혈관 생성 억제 매커니즘을 확인하기 위한 면역 블롯 결과이다.
본 발명은 강염기를 이용하여 동물의 각막에 알칼리 화상을 유도하여 얻어진 각막 혼탁증 동물모델을 제공할 수 있다.
상기 강염기는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘 및 수산화바륨으로 이루어진 강염기 군에서 선택될 수 있다.
보다 상세하게는 상기 동물모델은 0.5 내지 5 노르말농도(N)의 수산화나트륨을 동물의 중심 각막에 적용하여 알칼리 화상을 유도함으로써 얻어진 각막 혼탁증 동물모델을 제공한다.
상기 동물모델은 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지 및 염소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 비인간 동물일 수 있다.
다른 구체예로 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular membrane; CDECM)을 유효성분으로 함유하는 각막 혼탁증 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.
상기 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular membrane; CDECM)은 동물의 무릎 관절 연골 세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질일 수 있다.
상기 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular membrane; CDECM)은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 10 중량부로 함유될 수 있다.
또한 상기 약학조성물은 상기 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular membrane; CDECM)을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 필름제로서 제공될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 CDECM을 유효성분으로 함유하는 각막 혼탁증 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 점안제, 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, CDECM을 유효성분으로 함유하는 각막 혼탁증 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 CDECM의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 각막 혼탁증 동물모델을 이용한 각막 혼탁증 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
보다 상세하게는 상기 각막 혼탁 동물모델을 이용하여 동물모델의 한쪽 눈에는 선별해낸 후보물질을 투여하고 다른 쪽 눈을 대조군으로 하여 후보물질의 각막 혼탁 치료 효과를 검증하는 것을 특징으로 하는 각막 혼탁 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 하기 실시예 2와 같은 방법으로 알칼리 화상에 의해 제작된 각막 혼탁 동물 모델에 각막 혼탁 치료제 후보 물질인 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular matrix; CDECM)을 오른쪽 눈에 투여하고 시간경과에 따라 대조군인 왼쪽 눈 내지 HAM 필름 처리 실험그룹과 비교하여 치료제 후보 물질을 스크링한 결과, 도 1을 참조하면 대조군인 알칼리 화상그룹 또는 HAM 처리 실험그룹보다 후보 물질인 CDECM 처리 실험그룹의 각막 혼탁 개선 효과가 좋은 것이 확인되었다. 또한 각막 화학 손상 동물 모델을 이용한 각 실험 그룹의 각막 두께 확인 결과인 도 2에서도 CDECM 처리 실험그룹의 월등한 개선효과를 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
하기의 참조예는 본 발명에 따른 각각의 실시예에 적용되는 참조예를 제공하기 위한 것이다.
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참조예
> 통계 분석
각각의 분석은 최소 3회 수행하였다. 그 결과를 Windows(SPSS, Chicago, IL)사의 SPSS version 18.0으로 분석하고 값을 ±표준편차로 나타내었다. 또한 실험 그룹간의 ANOVA-Tukey' test 분산분석을 이용한 통계 분석을 수행하여 p<0.01 및 p<0.001을 통계적으로 유의한 값으로 보았다.
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실시예
1>
CDECM
및
HAM
필름 제조
이미 보고되어진 방법(Biomaterials 2010; 31: 5355-5365)에 따라 CDECM 필름을 제조하였다. 먼저, 돼지의 무릎 관절연골 유래의 초대 연골세포를 단층 배양하여 확장시킨 후 3주 동안 세포 시트 멤브레인에서 더 배양하였다. 이렇게 얻어진 멤브레인을 200 U/mL DNase I으로 처리하고 인산완충액(PBS; Gibco, Carlsbad, CA)으로 3회 철저하게 세정하였다. HAM 필름은 Bioland (Cheonan, Korea)로부터 구매하여 사용하였다. 각 필름을 생검 펀치로 잘라 8 mm 직경 원을 준비하였다.
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실시예
2> 알칼리 화상 동물모델의 제작
2.0 kg 내지 2.5 kg의 중량을 갖는 뉴질랜드 흰 토끼(숫컷, 9마리)를 Samtako (Osan, Korea)에서 구입하였으며, 눈과 시력 연구를 위한 동물의 사용을 인제대학교 의과대학과 ARVO Statement에 승인된 동물실험 지침에 따라 수행하였다.
전신 마취는 케타민 염산염(30 mg/kg body weight, Huons, Jecheon, Korea)과 자일라진 염산염(2. 5 mg/kg, Bayer Korea Ltd., Seoul, Korea)의 혼합물을 근육 내로 주사하여 유도하였고, 국소 마취는 알케인 프로프라케인을 눈으로 점안하여 유도하였다. 각막 신생혈관은 1N NaOH에 담근 8 mm의 와트만 4 여과지를 1분 동안 오른쪽 중심각막에 적용하여 유도하였다. 10일 후, 토끼를 무작위로 다음과 같이 3개의 실험군으로 나누었다. 즉, 제1군은 알칼리 화상 실험군(n=3), 제2군은 CDECM 이식 실험군(n=3), 제3군은 HAM 이식 실험군(n=3)이었다. 각 토끼의 왼쪽 눈은 대조군으로 사용하였다. CDECM 및 HAM은 각막 표면에 이식되어 절제된 영역을 완전히 덮었고, 10-0 나일론 봉합사(Ethicon)를 이용하여 봉합되었다. 이렇게 준비된 토끼들을 이식 후 10일째에 각각 희생시켰다.
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실시예
3> 각막 혼탁 정도 평가
앞서 제작된 동물모델에서 각막 혈관신생 및 혼탁화의 임상적 평가는 종래 알려진 방법(Ophthamology 2007; 114(7): 1294-1302)을 이용하여 수행하였다. 이식 후 10일째에 모든 토끼 눈의 임상적 특징을 평가하였다.
각막 혼탁의 중증도도 0 내지 3으로 점수를 주었으며, 이때 0점은 홍채 세부정보를 갖는 깨끗한 각막을 명확하게 볼 수 있음, 1점은 홍채 세부정보를 부분적으로 볼 수 없음, 2점은 동공 가장자리에서 좋지 않게 보이는 홍채 세부정보만을 볼 수 있음, 3점은 홍채 및 동공 세부정보를 전혀 볼 수 없음으로 구분하였다.
상기 방법으로 이식 10일 후 모든 토끼 눈의 혼탁 정도를 분석한 결과 도 1과 같이 알칼리 화상에 따른 각막 혼탁이 점차 증가하여, 알칼리 화상 20일째 혼탁점수가 3점에 가깝게 유의할 정도로 증가하였으며, 광범위한 검구유착 형성이 나타났다.
HAM 이식 실험군에서는 상기 알칼리 화상에 의한 임상적 변화가 개선되지 않았으며 알칼리 화상 실험군 역시 유의한 변화가 확인되지 않았다.
반면, CDECM 이식 실험군에서는 각막 혈관신생과 혼탁 점수가 주목할만한 감소를 나타내었다.
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실시예
4> 조직 분석
알칼리 화상에 따른 각막의 조직학적 변화를 관찰하기 위하여, 앞서 희생된 토끼의 눈을 3.5% 파라포름알데히드로 고정시키고, 최적 배양 온도 화합물(OCT; Tissue-Tek, Sakura Fine Technical Co., Ltd., Tokyo, Japan)에 담구었다. 각 조직을 액체 질소로 냉동시켜 조직 분석에 사용하였다. 각 시료를 4% 포름알데히드에서 24시간 동안 고정하고 탈수시킨 후, 파라핀 왁스에 담구었다. 8 ㎛ 두께의 절편을 준비하여 헤마톡실린/에오신으로 염색하였다. 각 절편 이미지를 가상 현미경(NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)으로 촬영하고 각막의 두께를 측정하였다.
상기 방법으로 수행된 헤마톡실린/에오신 염색 결과인 도 2를 참고하면, 알칼리 화상군의 각막 두께는 보통 두께인 662.4±16.6㎛에서 1114.8±7.3㎛까지 증가되었으나 CDECM 이식 실험군의 이식 10일 후 각막 두께는 957.4±107.7㎛로 알칼리 화상군보다 각막 두께의 주목할 만큼 감소되었다.
반면, HAM 이식 실험군은 1139.1±4.7㎛로 알칼리 화상군과 비교하여 주목할 만한 각막 두께 감소가 나타나지 않았다.
헤마톡실린/에오신 염색 결과인 도 3으로부터 알칼리 화상은 각막에서 상피의 표면적 기질까지의 확장과 각막부종, 염증세포의 증식, 기질 섬유화 및 신생혈관 생성을 유도할 수 있음이 확인되었다.
또한 CDECM 이식은 상기 알칼리 화상으로 인한 각막 현상들을 개선하고 상피세포의 증식 및 기질 섬유화를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
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실시예
5> 면역조직 분석
면역조직 분석을 위하여, 조직을 6 ㎛ 두께의 절편으로 잘랐다. 상기 절편을 3.5% 파라포름알데히드로 고정하고, 0.1% 트리톤 X-100을 침투시키고, 2% 소 혈청 알부민(BSA; all from sigma)으로 불활성화시킨 후, 1차 항체로 항-CD31, 항-bFGF, 항-MMP-9(1:1,000; all from Bioss Antibodis, Woburn, MA) 및 항-VEGF-A(Abbiotec, San Diego, CA)를 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 그 후, 상기 절편을 2차 항체(DAKO Corp, Glostrup, Denmark)로 45분 동안 반응시켰다. 이때, 면역 반응은 디아민벤지딘(DAB) 발색체로 가시화시켰고, 절편을 Mayer’s hematoxylin (Sigma)으로 실온에서 30초 동안 대비염색시켰다. 상기 절편의 이미지를 가상 현미경(NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)으로 촬영하였다.
상기 방법으로 각막 혼탁과 관련된 특이적 마커인 CD31, VEGF, bFGF 및 MMP-9을 면역염색한 결과인 도 4를 참고하면 알칼리 화상 실험군에서는 알칼리 화상에 의한 섬유성 기질 세포에서 상기 각막 혼탁 특이적 마커들이 강하게 나타났다.
또한 HAM 이식 실험군의 기질하에서는 bFGF와 MMP-9의 발현이 감소 되었으나 CD31과 VEGF의 감소는 발견되지 않았다.
그러나 CDECM 이식 실험군은 각막 혼탁과 관련된 CD31, VEGF, bFGF 및 MMP-9와 같은 모든 각막 혼탁 마커 발현의 유의한 감소가 확인되었다.
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실시예
6> 면역
블롯
분석
단백질 추출 용액(Intron Biotechnology, Gyeonggi-do, Korea)을 이용하여 토끼 각막으로부터 단백질을 추출하였다. 세포 용출물로부터 얻어진 핵 단백질 추출물은 NucBusterTM 단백질 추출 키트(Novagen,Darmstadt,Germany)를 이용하여 준비하였다. 상기 단백질 농도는 표준물질로 소혈청알부민을 이용하여 상업용 단백질 분석 키트(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 정하였다.
동량의 단백질 농도를 이용하여 7.5%-12.5% 소듐도데실설페이트-폴리아크릴아마이드겔 전기영동을 수행하였고, 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인로 전이시켰다. 실온에서 1시간 동안 5% 비지방 탈지유를 함유한 PBS로 반응을 정지시킨 후, 각 멤브레인을 특이적 1차 항체를 이용하여 4℃에서 밤새도록 반응시켰다. 이때, 상기 1차 항체로는 항-CD31, 항-bFGF, 항-MMP-9(1:1,000, all from Bioss Antibodies), 항-VEGF-A (Abbiotec), 항-ERK, 항-SAPK/JNK, 항-p38 MAPK, 항-Akt, 항-포스포-ERK, 항-포스포-SAPK/JNK, 항-포스포-p38 MAPK, 항-포스포-Akt (Thr308) 및 항-IκBα (all from Cell Signaling Technology, Beverly, MA), 항-PKCθ (Thr538) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 항-PKCα, 항-포스포-PKCα (Ser657), 항-NF-κB p65 및 항-β-액틴 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)을 사용하였다. 그리고, 0.1% 트윈-20이 함유된 PBS(PBST)로 2회 세척한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 항-마우스, 항-래빗, 또는 항-고우트 IgG 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 실온에서 1시간 동안 각 멤브레인과 반응시켜 면역 블로팅을 수행하였고, PBST로 3회 세정한 후, 증강 화학발광(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)을 이용하여 시각화하고 퓨젼 Fx 화상 수집체계(Vilber Lourmat, Torcy, France) 를 이용하여 밴드 강도를 측정하였다.
상기 면역블롯 분석을 통하여 CDECM의 각막 신생혈관 형성 억제의 매커니즘을 확인한 결과, 도 5 내지 도 6과 같이 알칼리 화상은 각막 혼탁 마커인 CD31, bFGF 및 MMP-9의 과발현을 유도하였으며 상기 면역 조직분석과 동일한 결과를 확인하였다. 또한 도 5A와 같이 CDECM 이식 실험군에서는 상기 각막 혼탁 마커의 과발현을 유의하게 감소시켰으나 HAM 이식 실험군에서는 감소 효과가 없었다.
추가적으로 본 발명자는 CDECM의 각막 신생혈관에 의한 NF-κB 활성 감소 효과를 확인한 결과 도 5B와 같이 알칼리 화상은 IκBα분해와 NF-κB p65의 핵내 이동을 증가시키는데 CDECM 이식 실험군에서는 NF-κB p65의 핵내 이동이 점차 감소 되었고 세포질 IκBα는 약간 증가하였다.
상기 알칼리 화상에 의한 NF-κB 활성과 관련된 상위 경로를 조사하기 위하여 Akt, PKC 및 MAPK 신호를 측정한 결과 도 6A와 같이 알칼리 화상에 따른 SAPK/JNK 및 p38 MAPK의 인산화와 발현의 증가가 확인되었으나 ERK에서는 영향이 나타나지 않았으며 CDECM 이식 실험군과 HAM 이식 실험군에서는 신호의 감소가 나타나지 않았다.
또한 도 6B를 참고하면 알칼리 화상 실험군에서 PKCθ(Thr538)와 Akt (Thr308)의 주목할만한 인산화 증가가 확인되었으나 CDECM 이식 실험군에서는 발현 수준이 감소한 반면, HAM 이식 실험군에서는 포스포-PKCθ와 포스포-Akt 발현이 증가되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (10)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 동물의 무릎 관절 연골세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular membrane; CDECM)을 유효성분으로 함유하며, 상기 연골세포 유래 세포외 기질은 알칼리 화상에 의해 유도되는 각막 혼탁증을 예방하거나 치료하는 것을 특징으로 하는 각막 혼탁증 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 삭제
- 청구항 5에 있어서, 상기 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular membrane; CDECM)은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 10 중량부로 함유되는 것을 특징으로 하는 각막 혼탁증 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 약학조성물은 상기 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte derived extracellular membrane; CDECM)을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하여 필름제로서 제공되는 것을 특징으로 하는 각막 혼탁증 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 삭제
- 삭제
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-
2013
- 2013-12-10 KR KR1020130153011A patent/KR101948156B1/ko active IP Right Grant
-
2014
- 2014-01-03 WO PCT/KR2014/000037 patent/WO2015088093A1/ko active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR101539700B1 (ko) * | 2012-09-05 | 2015-07-28 | 아주대학교산학협력단 | 연골세포 유래 세포외 기질막을 이용한 신생혈관질환 치료용 조성물 및 각막 또는 결막 이식재 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| "양막에 배양한 윤부세포를 알칼리화상모델에 이식한 후 유착복합체 형성관찰", 대한안과학회지 제45권제10호(2004년 공개) |
| 고분자과학과 기술 제22권1호 ‘세포유래 생체소재’(2011년 2월)* |
| 박동원의 동아대학교 석사학위논문 (2001년 12월 공개)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2015088093A1 (ko) | 2015-06-18 |
| KR20150067516A (ko) | 2015-06-18 |
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