KR101327663B1 - 안지오제닌의 신규 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 안지오제닌 또는 그의 단편을 유효성분으로 포함하며, 상기 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 안지오제닌 또는 그의 단편인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 NO 생성 증가 및 쉴렘관의 확장과 세포간 간격 증가를 통한 방수유출 활성화를 통해 안압을 하강시키는 효과를 보여, 녹내장의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

안지오제닌의 신규 용도 {Novel Use Of Angiogenine}

본 발명은 안지오제닌의 안압 하강 효과를 바탕으로 한 신규한 녹내장 예방 및 치료 용도에 관한 것이다.

안지오제닌은 닭 배아의 양요막에서 혈관신생 유도능을 가지며, 또한 각막과 토끼 슬관절의 메니스커스에 혈관 형성을 유도한다. 그 작용기전은 기저막과 세포외기질을 분해하는 프로테아제를 활성화시키고, 혈관 내피 세포의 유착과 침투를 촉진하여, 혈관세포의 세관을 형성함으로써 혈관 신생을 촉진하는 것이다. 안지오제닌과 유사한 혈관 생성 촉진 물질로는 VEGF, bFGF, IL-12등이 알려져 있으며, 이들 물질들은 주로 심장 및 맥관계에서의 허혈성 질환의 치료 목적으로 연구되고 있다.

안지오제닌은 123개의 아미노산으로 이루어진 14.4 kDa의 긴 단일 사슬로 이루어진 단백질로서 세포증식과 다른 혈관신생인자에 의해서 혈관신생을 유도시키는 기능을 가진다. 특히 안지오제닌의 핵 이동 과정은 혈관신생과정의 결정적 단계로 알려져있다. 그러나 여전히 안지오제닌의 세포 내 기전은 명확하지 않다. 최근 연구 중 야간 감은 눈에서 채취한 눈물 내에서 안지오제닌의 농도 증가를 보고한 최근 연구가 있다. 이 연구에서는 이러한 안지오제닌을 비롯한 각종 성장인자에 의한 야간 눈물 내 농도 증가로 인한 인체 방어기전을 설명하였다.

안압의 일차변동에 관한 많은 논란이 있으나 여러 연구에서는 야간 안압이 주간 안압보다 높다고 보고하고 있으며, 이에 따라 녹내장 환자에게 있어서 시신경 손상은 이러한 야간 안압상승에 의해서 이루어진다고 하였다. 그러나 최근 연구에서는 야간 안압이 오히려 주간 안압보다 낮다고 보고되고 있으며, 이는 방수의 생산 감소와 방수 유출능의 증가에 따른 결과로 알려지고 있다.

녹내장의 병인은 아직 명확하게 밝혀져 있지 않으나 안압상승이 녹내장의 중요한 위험인자로 알려져 있다. 이러한 안압 상승의 원인은 방수유출 경로 중 쉴렘관과 섬유주 부위의 저항이 몇몇 병리조직학적 변화에 의하여 증가하여 생긴다고 알려져있다. 또한 높은 안압에 의한 시신경의 기계적 손상 이외에 최근 혈류인자가 관여하리라는 보고가 있어 왔다. 즉 어떠한 원인에 의하여 시신경의 혈액 관류압이 감소하면 시신경 유두에 허혈성 손상을 일으킨다는 것이다. 또한 최근에는 녹내장의 병인을 면역학적으로 접근하려는 시도가 이루어지고 있다. 앞선 허혈성 이론의 하나로서 녹내장은 지속적인 시신경 축삭과 망막 신경절 세포의 소실로 인한 만성 신경퇴행질환으로 이해될 수 있으며, 이는 혈관수축에 의한 국소적인 허혈로 설명된다는 것이다. 이때 혈관 수축은 면역 관련 질환의 특징적인 소견으로서 녹내장의 진행 역시 면역반응으로 이해될 수 있다는 것이다. 이러한 가설은 자가 면역질환 환자에서 녹내장의 발병율이 높다는 것에서도 뒷받침된다. 또한 정상 안압 녹내장 환자에게 있어서 정상범위의 안압을 유지함에도 지속적인 시신경의 손상이 지속되는 여러 증례들에서도 보듯 녹내장은 안압 이외에도 허혈성 변화, 면역학적 원인 등 여러 인자에 의해 질병이 진행되는 다원적 질환이다.

이러한 녹내장의 병인에 근거한 많은 약제들이 개발되어 왔으며 그중 프로스타글란딘(prostaglandin) 계열의 약제는 섬모체근의 세포외 기질의 변화를 유발하여 포도막 공막 유출로를 통한 방수유출을 증가시켜 효과적으로 안압을 하강시키므로서 최근 녹내장 치료제로서 사용이 급증하고 있다. 이러한 prostaglandin(PG)제제의 주된 작용기전은 근육이완을 유발하는 NO(nitric oxide)의 생성과 조절에 의하여 매개될 가능성이 연구되어 왔으며, 몇 연구에서는 NO에 의한 직접적인 안압하강효과가 보고되고 있다.

안압의 일중 변동과 안지오제닌의 눈물 내 변화 양상은 안압에 대한 인체의 방어기전으로 연관되어 생각될 수 있으며, 이에 본 발명의 발명자들은 안지오제닌에 의한 방수유출로의 변화와 이에 따른 안압 변화를 연구하였고, 이를 통해 안지오제닌이 NO 생산, 면역매개물질과 상호작용을 보이며 이를 통해 안압 하강 효과를 보임을 새로이 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 안지오제닌의 신규한 녹내장의 예방 및 치료 용도를 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 안지오제닌 또는 그의 단편을 유효성분으로 포함하며, 상기 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 안지오제닌 또는 그의 단편을 유효성분으로 포함하고 안구학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하며, 상기 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 녹내장의 예방 또는 치료용 점안제를 제공한다.

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본 발명의 안지오제닌 또는 그의 단편인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 NO 생성 증가 및 쉴렘관의 확장과 세포간 간격 증가를 통한 방수유출 활성화를 통해 안압을 하강시키는 효과를 보여, 녹내장의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 사체 안구 전방각에 대한 면역 조직화학 염색 결과 사진이다. A는 Haematoxylin-Eosin 염색, B는 안지오제닌에 대한 IHC 염색, C는 IDO에 대한 IHC 염색 결과 사진이다.
도 2는 실험 녹내장 모델에 대한 안압 측정 결과 그래프이다.
도 3은 안지오제닌 점안에 의한 안압변동을 정상 쥐를 대상으로 실험한 결과 그래프이다. A는 주간 실험 모델에 대한 실험 결과이고, B는 야간 실험 모델에 대한 실험 결과 그래프이다.
도 4는 안지오제닌 점안에 의한 안압변동을 녹내장 흰쥐를 대상으로 실험한 결과 그래프이다. A는 주간 실험 모델에 대한 실험 결과이고, B는 야간 실험 모델에 대한 실험 결과 그래프이다.
도 5는 안지오제닌과 안지오제닌 억제제 혼합투여에 의한 안압 변동 측정 결과 그래프이다. A는 상공막 정맥 소작 녹내장 모델, B는 스테로이드 유발 녹내장 모델에 관한 실험 결과이다.
도 6은 상공막 정맥 소작 녹내장 모델에 대한 H&E 염색 사진이다. A는 정상 흰쥐, B는 상공막 정맥 소작 녹내장 모델이다.
도 7은 점안 전 시행한 녹내장 모델(A)과 안지오제닌 점안 후(B)의 전방각 내 쉴렘관 주변 조직에 대한 동일한 비율의 H&E 염색 확대 사진이다.
도 8은 녹내장 모델에서 시행된 안지오제닌 면역특수염색 사진이다. A는 점안 전, B는 안지오제닌 점안 후, C는 네오마이신과 안지오제닌 혼합투여, D는 PD98059 및 안지오제닌 혼합투여 군에 대한 사진이다.
도 9는 안지오제닌 점안에 의한 방수 내 NO 농도를 정상 쥐를 대상으로 실험한 결과 그래프이다.
도 10은 안지오제닌 점안에 의한 방수 내 NO 농도를 녹내장 모델을 대상으로 실험한 결과 그래프이다.
도 11은 Latanoprost 점안 후 단기간 눈물 내 안지오제닌 농도변화 양상에 대한 결과 그래프이다. 단기간 실험 결과를 A에 나타내었고, 장기간 실험 결과를 도 B에 나타내었다.

본 발명은 안지오제닌 또는 그의 단편을 유효성분으로 포함하며, 상기 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

이하 본 발명의 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 안지오제닌 또는 그의 단편인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 녹내장 쥐모델에 적용된 경우 쉴렘관의 확장과 세포간 간격 증가를 유도하였으며, 이를 통해 안압의 유의한 하강이 관측되었다. 또한 NO 측정 시험에서, 안지오제닌의 점안에 의해 녹내장 쥐 모델 방수 내 NO 농도가 유의하게 증가함을 확인할 수 있었는데, 이를 통해 본 발명의 안지오제닌은 종래 사용되고 있는 프로스타글란딘 제제와 같이 NO 생성 증가에 의한 근육이완을 통한 안압하강 기전을 통해서도 안압 하강을 유도하는 것으로 확인 할 수 있었다. 또한 안지오제닌의 C-말단 단편만으로 수행한 실험에서도 동일한 효과가 나타남을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명에 따른 안지오제닌 또는 그의 단편인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한 조성물은 녹내장의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

따라서 본 발명은 안지오제닌을 또는 그의 단편인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 녹내장 예방 또는 치료용 약학 조성물, 녹내장 치료제의 제조를 위한 안지오제닌 또는 그의 단편인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 용도, 그리고 치료상 유효량의 안지오제닌 또는 그의 단편인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 녹내장의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 안지오제닌의 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 이에 해당될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 안지오제닌 또는 그의 단편인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 NO 생성 증가 및 쉴렘관의 확장과 세포간 간격 증가를 통한 방수유출 활성화를 통해 안압을 하강시키는 효과가 있는 바, 녹내장의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 안지오제닌 또는 그의 단편인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 안지오제닌 또는 그의 단편인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 통상적인 방법에 따라 과립제, 산제, 피복정, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 제형화하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

보다 구체적으로 안지오제닌 또는 그의 단편인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 안과적으로 허용 가능한 조성물로서, 점적제로 제형화되어 안구내로 투여될 수 있다.

따라서 본 발명은 안지오제닌 또는 그의 단편인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하고 안구학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 녹내장의 예방 또는 치료용 점안제를 제공한다.

상기 "안과적으로 허용 가능한 담체"라는 것은 광범위한 의미로 사용되는데, 여기에는 안지오제닌 또는 그의 단편인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 함유하며 이를 방출할 수 있는 임의의 물질 또는 조성물이 포함된다. 전형적으로 안과적으로 허용 가능한 담체로는 물 또는 수성 용액 또는 현탁액이 있지만, 또한 안구 삽입제로 사용된 것과 같은 연고 및 중합체 매트릭스를 제조하는데 사용된 오일류도 여기에 포함된다.

상기 안과용 조성물은, 계면활성제, 부가적인 의약을 포함하는 보조제, 완충액, 항산화제, 긴장성 조정체, 방부제, 증점제 및 점도 개질제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 제형 내의 첨가제로 바람직한 것은, 염화나트륨, EDTA, 벤잘코늄 클로라이드, 소르빈산, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 클로로헥시딘, 글리세린 및 나트륨 퍼보레이트가 있다.

상기 안지오제닌 또는 이의 단편인 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 후보 약물을 동물 모델에 투여하는 단계;

상기 동물 모델의 생물학적 시료내 안지오제닌 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및

상기 단백질 수준을 정상 동물의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 녹내장 치료 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 후보약물은 통상의 제형으로 제조된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어 직접 주사를 위한 액제 형태, 경구 투여를 위한 캡슐제, 점안제 등을 사용할 수 있으나 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 투여는 직접 주사, 경구 투여, 혈관 주사 등 통상의 투여방식에 따라 실시될 수 있으며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 동물로는 제브라피쉬, 생쥐, 집쥐, 기니피그, 토끼, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 비비, 또는 침팬지 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 생물학적 시료는 이제 제한되는 것은 아니나, 구체적으로 조직, 세포, 혈액 또는 혈장을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 눈물을 사용할 수 있다.

단백질 수준을 측정하기 위한 방법으로는, 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 프리시피틴 반응, 겔 확산 프리시피틴 반응, 응집 분석법, 형광 면역분석법, 단백질 A 면역분석법, FACS, 단백질 칩 등과 같은 경쟁 또는 비경쟁 공지된 분석 방법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.

상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등의 다양한 ELISA 방법을 포함한다.

단백질 수준을 측정한 결과, 후보약물의 처리로 인해 정상 동물의 안지오제닌 단백질 수준보다 안지오제닌의 양이 증가하였다면, 상기 후보약물을 녹내장 치료제로 사용할 수 있다는 판단을 내릴 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 사체 안구 전방각에 대한 면역 조직 화학 염색

연구용으로 기증된 안구를 대상으로 하여 6시간 동안 4% 파라포름알데히드 용액에 전 고정한 후 조직을 각막에 수직으로, 각막, 윤부, 결막이 포함되게 절제하여 상온에서 6시간 고정하였다. 고정된 조직을 급속냉동 시킨 후 동결절편조직을 만들어 슬라이드글라스에 부착시킨다. 이후 면역 조직 화학 염색을 위하여 조직표본을 증류수에서 10분 간 세척한 후 1% 과산화수소액에 20분간 처리하고, 이후 0.02M 인산완충용액에 3회 세척하고 normal horse serum으로 30분간 처리하였다. 이후 혈청에 angiogenin, Indoleamine 2,3-dioxygenase(IDO)의 일차항체를 48시간 적용시킨 후 PBS로 세척하고 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 적용시켰다. 면역 조직 화학법에 의한 염색이 끝난 후 poly-mount로 봉입하고 광학현미경으로 관찰하였다.

결과를 도 1에 나타내었다. 도 1의 A는 Haematoxylin-Eosin 염색, B는 안지오제닌에 대한 IHC 염색, C는 IDO에 대한 IHC 염색 결과 사진이다.

도 1을 참조하면, 사체 안구의 전방각에 대한 안지오제닌 면역 조직화학 염색 결과 모양체에서부터 섬유주에 이르는 전방각에 안지오제닌이 광범위하게 염색되었으며, 특히 섬유주 세포와 주변에 위치한 쉴렘관, 집합관에 이르는 부위에 안지오제닌이 강하게 발현되는 것이 관찰되었다(도 1B 참조). 또한 전방각에 대한 IDO염색결과 안지오제닌 염색결과와 비슷한 양상으로 섬유주세포 주변으로 IDO가 강하게 발현됨을 알 수 있었다(도 1C 참조).

Ryu 등에 의하면 IDO는 인체 각막에서 발현되며 국소적 면역 억제 인자로 작용하여 각막의 면역 조절을 담당한다고 알려져있다. 따라서 이에 비추어 볼 때 안지오제닌에 의한 IDO의 발현증가를 통하여 전방각 내 국소적 면역 조절이 이루어지고 이를 통하여 녹내장의 면역학적 병인에 의한 질병 진행이 억제될 생각된다.

< 실시예 2> 녹내장 쥐 모델에서 안지오제닌 점안에 의한 안압변동 검토

(1) 실험 녹내장 모델 제작

상공막 정맥 소작 녹내장 모델을 만들기 위하여 수컷 흰쥐를 사용하였다. 쥐를 마취하고 윤부 가장자리를 4등분하여 90도 간격으로 각각 2 mm 절개를 한 후 윗쪽 절개의 가장자리로 2개의 방사상 결막 절개를 시행하였다. 조직을 뒤쪽으로 밀어서 외안근이 보이게 한 뒤 상직근 근처에 위치한 2개의 등쪽 상공막정맥과 외직근 근처에 있는 1개의 귀쪽 상공막 정맥을 분리하였다. 상공막 정맥은 외안근보다 더 깊이 위치하고 상대적으로 유동성이 적으며 직경이 크고 혈관내에 더 짙은 색의 혈액이 보이며 주위의 정맥총과 연결되어 있어 구분이 가능하다. 정맥의 수술적 분리 후에 주변조직에서 멀리 떨어지도록 3 mm 넓이의 wooden spatula를 사용하여 들어올린 후 주변조직에 열손상이나 접촉에 의한 기계적 손상이 없도록 주의하여 전기소작 하였다. 시술 후에는 클로람페니콜 점안제를 투여하였다. 안압은 Tonopen (Solan, Florida, USA)을 이용하여 3번 이상 연속 측정하였고 5 % 이내의 안정된 안압으로 확인된 값만을 기록하였으며, 시술 전과 시술 후 1, 3일 및 1, 2주에 측정하여 시술 전 안압보다 5mmHg 이상 상승된 쥐만을 대상으로 하였다.

또한 스테로이드 유발 녹내장 모델을 만들기 위하여 1% prednisolone 을 하루 2회 4μl씩 30일간 점안하여 시술 전 안압보다 5mmHg 이상 상승된 쥐만을 대상으로 하였다.

결과를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 상공막 정맥 소작을 시행한 모델에서는 모든 쥐에서 안압 상승이 확인되었으며, 스테로이드 유발 모델에서는 사망한 1마리를 제외한 모든 쥐에서 유의한 안압 상승이 관찰되었다. 상공막 정맥 소작에 의한 녹내장 모델 제작하고 2주간 관찰하였을 때 시술 전 측정한 안압은 13.9±3.9mmHg였으며, 시술 다음날부터 안압이 25.4±3.5mmHg로 상승되었으며, 2주 후까지 23.7±3.8mmHg로 유의한 안압 상승을 유지하였다. 스테로이드 유발 녹내장 모델은 점안 시작 1일째까지는 유의한 안압 변동을 보이지 않았으나 1주부터 안압이 19.5±2.2mmHg로 점안 전 측정된 13.6±mmHg과 비교하여 유의하게 상승되었으며 2주 째 까지 안압 상승이 확인되었다.

(2) 안지오제닌 점안에 의한 안압변동 검토

흰쥐를 생리식염수 점안군, 안지오제닌 (재조합 인간 안지오제닌, R&D systems, USA) 50μg/ml 점안군, 안지오제닌 단편(angiogenin 108-122, 서열번호 1, BACHEM, USA) 점안군, latanoprost 50μg/ml 점안군으로 군 당 6마리 12안의 쥐를 대상으로 하였으며, 점안 실험은 정상 쥐와 녹내장 모델 쥐에서 반복 실험되었다. 점안제의 투여는 주간과 야간 점안효과를 비교하기 위하여 오전 8시와 오후 8시에 4μl 씩 점안하고 점안 후 1, 3, 6, 9, 12, 24시간째에 안압이 측정되었다.

정상 쥐에 대한 실험 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 A는 주간 실험 모델에 대한 실험 결과이고, B는 야간 실험 모델에 대한 실험 결과 그래프이다.

정상 흰쥐를 대상으로 점안한 주간 실험에서 점안 전 안압을 0으로한 상대적 안압 하강 비교 시 안지오제닌 50μg/ml 점안군의 평균 안압은 점안 1시간 째부터 유의하게 하강하기 시작하여 점안 9시간째까지 점안 전 안압과 비교하여 -1.8±0.4mmHg의 안압하강 효과를 유지하였다.

안지오제닌 단편 점안군은 안지오제닌 점안시보다 초기에 더 효과적인 안압하강 효과를 보였다. 즉 점안 1시간 평균 안압 하강은 -2.9±0.4mmHg이었으며 이후 점차 안압하강정도가 낮아서 점안 6시간 째까지 유의한 안압하강이 유지되었다.

latanoprost 50μg/ml 점안군은 3시간째부터 -2.8±0.4mmHg의 유의한 안압하강효과를 보이기 시작하여 점안 12시간 이후까지 유지되었다. (도 3A 참조)

정상 흰쥐를 대상으로 시행한 야간 점안 실험에서 상대적 안압하강 비교시 안지오제닌 50μg/ml 점안군과 안지오제닌 단편 점안군 두 군 모두 점안 1시간 째부터 유의한 안압하강을 보였으며 안지오제닌 단편 점안군이 -3.4±0.6mmHg로 더 높은 하강 효과를 보였다. 안지오제닌 50μg/ml 점안 군은 점안 전과 비교하여 24시간까지 -1.5±0.4mmHg로서 유의한 안압하강 효과를 유지하였으며, 안지오제닌 단편 점안군은 12시간 까지만 유의한 안압하강이 유지되었다.

녹내장 흰쥐를 대상으로 시행한 주간, 야간 점안 실험의 실험 결과를 도 4에 나타내었다. A는 주간 실험 모델에 대한 실험 결과이고, B는 야간 실험 모델에 대한 실험 결과 그래프이다.

도 4를 참조하면, 녹내장 흰쥐를 대상으로 수행한 실험 역시 정상 안압 쥐와 비슷한 양상의 안압하강효과를 확인할 수 있었다. 주, 야간 두 실험 모두에서 초기 1시간 째 안지오제닌 단편이 가장 높은 안압하강효과를 보였으며, 이후 가장 빠르게 안압하강효과가 소실되었다. 안지오제닌 점안 군은 주간 점안 실험시 6시간까지 유의한 안압하강 효과가 유지되었으나, 야간 점안 시에는 점안 후 12시간까지 안압하강 효과가 유지되었다.

(3) 안지오제닌과 안지오제닌 억제제의 혼합투여에 의한 안압변동 검토

녹내장 모델에서 안지오제닌과 안지오제닌의 nuclear translocation inhibitor인 네오마이신 250mM(neomycin sulfate, SantaCruz, USA)의 혼합 점안 군과 안지오제닌과 안지오제닌 ERK pathway inhibitor인 PD98059 0.5mM(PD98059, Biovision, USA) 혼합점안 군에서 군 당 6마리 12안에서 4μl 씩 혼합 점안하고 점안 전, 후 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24시간째 안압을 측정하였다.

결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 A는 상공막 정맥 소작 녹내장 모델, B는 스테로이드 유발 녹내장 모델에 관한 실험 결과이다.

도 5를 참조하면, 상공막 정맥 소작 녹내장 모델과 스테로이드 유발 녹내장 모델에서 안지오제닌과 네오마이신의 혼합 투여시 두가지 모델 모두에서 유의한 안압하강이 보이지 않았으나, 안지오제닌과 PD98059를 혼합투여한 경우 두 가지 녹내장 모델에서 모두 안지오제닌만 투여한 군과 비슷한 양상으로 점안 6시간 째까지 -1.7±0.3mmHg와 -4.1±0.5mmHg의 유의한 안압하강을 보임을 알 수 있었다.

(4) 안지오제닌 점안 후 쥐 모델 안구 전방각에 대한 면역조직화학염색

상공막 정맥 소작에 의한 녹내장 쥐 모델을 대상으로 하여 생리식염수 점안, 안지오제닌 점안, 안지오제닌과 네오마이신 혼합 점안, 안지오제닌과 PD98059 혼합 점안 1시간 후 각 군에서 1안씩 적출된 안구를 대상으로 하여 인체 안구에서와 동일하게 안지오제닌에 대한 면역조직화학염색을 시행하고 광학현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 6 내지 도 8에 나타내었다.

도 6을 참조하면, 상공막 정맥 소작 녹내장 모델에 대한 H&E 염색 소견 상 정상 흰쥐 조직 소견(A)과 대조적으로 상공막 정맥 소작(B)으로 인해 전방각 주변 상공막 내 혈관의 울혈 소견이 관찰되었다.

도 7을 참조하면, 점안 전 시행한 녹내장 모델(A)과 안지오제닌 점안 후(B)의 전방각 내 쉴렘관 주변 조직에 대한 동일한 비율의 H&E 염색 확대 소견상 점안 전과 비교하여 안지오제닌 투여한 쥐의 쉴렘관의 직경과 세포사이 간격이 확장된 소견이 관찰되었다(도 7 화살표 참조).

도 8을 참조하면, 녹내장 모델에서 시행된 안지오제닌 면역특수염색 소견상 점안 전(A)보다 안지오제닌 점안 후 전방각 내 안지오제닌의 염색이 증가된 소견(B)이 보였으며, 이는 PD98059 혼합점안시(D)에도 유지가 되었다. 그러나 네오마이신과 안지오제닌의 혼합 투여시(C) 섬유주주변의 안지오제닌의 염색이 감소된 소견이 관찰되었다.

따라서 Erk 경로 억제제인 PD98059에 의하여서는 안지오제닌에 의한 안압하강을 억제하지 못하였으나, PI3K와 nuclear translocation 억제제인 네오마이신에 의하여서는 안지오제닌의 안압하강효과가 억제됨에 비추어 볼 때, 안지오제닌의 안압하강기전은 NO생성경로인 PI3K와 nuclear translocation에 의하여 이루어지며 이는 최종 생성물인 NO에 의하여 이루어 짐을 알 수 있었다. 이는 이하의 실시예 3의 실험 결과로도 뒷받침된다.

< 실시예 3> 안지오제닌 점안 후 정상과 녹내장 쥐 모델 방수 내 NO 농도 변화 분석

정상 쥐 모델을 각 6마리 12안씩 4군으로 나누어서 오전 8시와 오후 8시에 안지오제닌 50μg/ml, 안지오제닌 단편 50μg/ml, latanoprost 50μg/ml을 각 군마다 점안하고 점안 후 1, 3, 6시간 째 군당 2마리 4안에서 각각 15~20μl의 방수를 추출하였다. 방수 추출은 먼저 쥐를 마취하고 안구의 외측 9시방향에서 microkeratome으로 각막절개를 시행하고 절개창으로 capillary tube를 접촉시켜 방수가 흡수되게 한 후 eppendroff tube에 옮겨서 -70도에 냉동보관하였다. 이후 방수내 nitric oxide(NO)농도 측정은 Griess assay(nitric oxide colorimetric assay kit, Biovision, USA)를 이용하여 측정하였다. 방수는 10배 희석한 후 동량의 griess 용액과 혼합하여 10분간 반응시킨 후 well plate에 옮겨 NO생성 반응물인 아질산염의 양을 spectrophotometer로 540nm에서 흡광도를 측정하여 표준치와 비교하여 정량화하였다.

도 9를 참조하면, 주간과 야간 정상 쥐의 방수 내 NO의 농도는 유의한 차이를 보이지 않았으나, 주간과 야간 정상 쥐와 녹내장 모델 쥐의 방수 내 NO는 유의한 차이를 보였다. 즉 주간과 야간 녹내장 모델 쥐의 방수 내 평균 NO 농도는 각각 15.1± 3.7μM, 16.5± 3.5μM로 정상 쥐의 방수 내 NO 농도인 29.1± 4.5μM, 27.5± 5.1μM보다 통계적으로 의미있게 낮았다.

도 10을 참조하면, 정상 녹내장 모델에서 안약 점안 전 후로 시행한 방수 내 NO 농도 분석 결과상, 주간과 야간 실험에서 각 점안 군 모두 비슷한 양상의 결과를 보였다. 즉 두 실험 모두에서 안지오제닌이 초기 점안 1시간 째 가장 높은 NO농도 증가를 보였으며, 안지오제닌 단편이 두번째로 높은 초기 NO농도 증가를 보였다. 이후 점안 3시간 후부터는 latanoprost 점안 군이 가장 높은 NO농도 증가 양상을 보였다. 주간 실험 군에 비하여 야간 실험 군에서 높은 NO 농도 증가 정도가 확인되었다

< 실시예 4> 장, 단기 latanoprost 점안 후 인체 눈물 내 안지오제닌 농도변화 분석

Latanoprost 0.0005% (Xalatan^®; Pfizer Inc., New York, NY, USA) 장, 단기간 점안에 의한 눈물 내 안지오제닌 농도를 ELISA kit(Custom Cytokine Human Antibody Array, RayBiotech)를 이용하여 분석하였다. 단기간 눈물 성분변화 분석은 12명 24안을 대상으로 하여 Latanoprost 0.0005%를 점안하고 점안 전과 점안 6시간 후 눈물 내 안지오제닌 농도를 정성적으로 분석하였다. 또한 장기간 눈물 성분변화분석을 위하여 녹내장으로 새로이 진단된 10명 20안을 대상으로 하여 Latanoprost 0.0005% 점안을 2달 간 하루 1회 지속시킨 후 점안 전과 후의 눈물 내 안지오제닌 농도를 분석하였다. 눈물은 직경 10 μL의 유리모세관(Marienfeld, Lauda-Konigshofen, Germany)을 이용하여 환자의 하측 결막낭에서 자극을 최소한으로 줄인 후 30 μL 이상을 채취하였고, 마이크로튜브에 모아 -70˚C에 보관한 후 분석하였다. 안지오제닌 농도 분석은 안지오제닌 항체가 이중으로 membrane에 점상배치된 ELISA array kit에 제조사에서 제공한 완충액을 이용하여 membrane을 처리한 후 인체 눈물을 배치한 후 biotin이 부착된 이차항체와 실온에서 1시간 반응시킨 뒤 세척 후 다시 HRP(horseradish peroxidase)가 부착된 streptavidine과 1시간 실온에서 반응시켰다. 세척 후 제조사에서 제공한 검출완충액에서 2분간 반응시킨 후 막을 X선 필름에 40초간 노출시켰으며 Quantity one software(Bio-Rad Lab., Hercules, CA, USA)를 이용하여 영상을 획득하고 화학발광을 분석하여 정성화하였다.

Latanoprost 점안 후 단기간 눈물 내 안지오제닌 농도변화 양상을 도 11에 나타내었다. 단기간 실험 결과를 A에 나타내었고, 장기간 실험 결과를 도 B에 나타내었다. 도 11을 참조하면, 점안 전과 비교하여 점안 6시간 째 눈물 내 안지오제닌의 상대적 발현 정도는 42.2±9.1%에서 62.5±10.2%로 유의하게 증가하였다. Latanorprost의 2달 간 점안 후 장기간 눈물 내 안지오제닌 농도 역시 점안전 60.5±10.8%에서 81.2±11.5%로 유의한 증가를 보였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

1. 안지오제닌 또는 그의 단편을 유효성분으로 포함하며, 상기 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 안지오제닌 또는 그의 단편은 NO 생성 증가 및 쉴렘관의 확장과 세포간 간격 증가를 통한 방수유출 활성화를 통해 안압을 하강시키는 것인 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함하는 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 녹내장 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제형은 과립제, 산제, 피복정, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 녹내장의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
6. 안지오제닌 또는 그의 단편을 유효성분으로 포함하며, 상기 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 안구학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 녹내장의 예방 또는 치료용 점안제.
   
7. 삭제
8. 삭제
9. 제6항에 있어서,
   상기 안지오제닌 또는 그의 단편은 NO 생성 증가 및 쉴렘관의 확장과 세포간 간격 증가를 통한 방수유출 활성화를 통해 안압을 하강시키는 것인 녹내장의 예방 또는 치료용 점안제.
   
10. 후보 약물을 인간을 제외한 동물 모델에 투여하는 단계;
    상기 동물 모델의 생물학적 시료내 안지오제닌 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 안지오제닌 단백질 수준을 정상 동물의 안지오제닌 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 녹내장 치료 약물의 스크리닝 방법.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 눈물인 것인 녹내장 치료 약물의 스크리닝 방법.

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