CN1507925A - 脱细胞、脱钙骨作为组织工程材料的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种组织工程化移植物，它包括：(a)组织工程载体，所述的组织工程载体是脱细胞、脱钙的骨；(b)种子细胞。本发明还提供了该组织工程化移植物的制备方法和用途。

Description

脱细胞、脱钙骨作为组织工程材料的应用

技术领域

本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及组织工程化移植物及其制备方法和用途。

背景技术

组织工程生物材料是指用于构筑供细胞粘附生长并形成组织的三维支架所用的可在生物体内降解的生物材料。生物支架材料本质上是对组织结构中细胞外基质成分的仿生，组织工程生物材料要求不仅为细胞提供生长代谢的场所，而且能够调节细胞的各种生物学功能以利于组织的形成与再生，因此理想的组织工程生物材料应具有如下基本生物学特性：(1)良好的生物相容性：除满足生物材料的一般要求，如无毒、不致畸等之外，还要利于种子细胞粘附、增殖，降解产物对细胞无毒害作用，不引起炎症反应，甚至利于细胞的生长和分化；(2)良好的生物降解性：基质材料在完成支架作用后应能降解，降解率应与组织细胞生长率相适应，降解时间应能根据组织生长特性做调节；(3)对细胞作用的选择性：促进种子细胞粘附生长并发挥生物学功能，同时抑制某些非种子细胞的混杂与生长；(4)促进组织形成与再生，最大程度地促进细胞吸收营养物质、生长因子与各类药理性试剂等；(5)引导性组织反应；(6)调节生物学反应。

应用于组织工程的生物材料在具体的制备过程中会应该考虑以下几点重要特征：(1)制备简单，可大量商品化提供；(2)可进一步加工为三维支架；(3)降解产物无局部或全身系统性毒性作用；(4)具备控制缓释功能，能够粘附及缓慢释放生物活性因子。

人工合成材料因其物理化学性能的可控性和无疾病传播的危险等，是未来组织工程理想的支架材料来源。目前，已有多种材料被用于组织工程研究，但均不同程度地存在着细胞相容性、组织相容性、理化性能的稳定性和安全性等多方面的问题，短期内难以解决。

羟基磷灰石具有良好的生物相容性，具有与正常骨组织相似的多孔结构，其诱导成骨能力已被证实，一直以来作为骨替代材料应用于临床，但因其塑型困难，脆性大，降解较慢，限制了其作为组织工程中的种子细胞载体的应用。

珊瑚作为骨替代材料的优点在于：具有良好的生物相容性和骨传导作用，且可降解特性。最大的缺点就是降解速度过快，4-8周降解作用明显，12周已完全降解。因此，支架的降解与骨的形成无法协调，这就极大地限制了其应用。

藻酸盐凝胶是一种天然聚合物，虽然本身不具备骨诱导性，但作为种子细胞的载体能容纳大量种子细胞，不仅能维持成骨细胞的表型，而且降解速率与骨形成速率相匹配。其最大的优点是可注射性，但只可用于无应力分布或应力较小的骨缺损。

聚乳酸(Polylactic Acid，简称PLA)、聚羟基乙酸(Polyglycolic Acid，简称PGA)以及二者的共聚物(PLA/PGA)是目前应用较广的几种生物可降解性材料。PLA具有一定机械强度和良好加工性能。PGA支架诱导促进成骨细胞的粘附增殖和分化，但其降解过快，降解产物积聚会造成局部PH值下降，导致细胞中毒及致死亡。尽管这些聚合物在实验研究中显示了良好的生物相容性和可降解性，但是由于在降解过程中，PLA所产生的酸性降解产物对细胞产生一定的毒副作用，甚至引起细胞的死亡。

天然材料的最大优点为细胞相容性好，具有较高的组织生物诱导特性，保留了天然细胞外基质支架的三维结构，复合组织构建必需的基底膜结构也能够保留完整，在一定时期内仍然是不可替代的组织工程用生物支架材料，同时可作为创伤修复的理性填充材料并发挥生物诱导促组织形成的再生功能。

各种天然的生物材料(如各种脱细胞基质)具有与人体极为相似的组织结构和力学性能，在经过脱细胞等一系列处理后，其抗原性大大降低，特别是以动物为来源的天然生物材料，来源广泛、成本低廉，是一种极有前途的生物材料。目前，美国已经商品化的皮肤产品，均是以天然生物材料为基础研制而成。组织工程生物材料另一重要研究方向是天然生物材料的研发与应用，包括皮肤脱细胞基质、骨脱细胞基质、角膜脱细胞基质、肌腱脱细胞基质等等。

应用组织工程方法构建骨组织，除具有足够数量的种子细胞外，还需要具有一定三维空间结构的生物可降解支架。这种材料在新生骨组织完全形成之前为种子细胞提供足够的生长空间和机械强度，而且更重要的是作为细胞外基质成分或其替代成分，介导细胞间信号传导和相互作用，诱导新骨的形成。这种材料不仅应符合组织工程一般材料的要求，还必需具备以下的特点：维持骨种子细胞的形态和表型，并促进细胞的粘附和增殖，诱导骨组织形成；材料的降解速率必须与植入的种子细胞再生骨的速率相匹配；支架可制备成至少达90％孔性结构并具一定的坚韧性，能在一定应力下维持原有的三维立体结构等。

因此，本领域迫切需要开发新的安全性高、相容性好、可塑性强、机械强度高的的组织工程载体。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的安全性高、相容性好、可塑性强、机械强度高的的组织工程载体及其制法。

本发明的另一目的就是提供用所述组织工程化载体构建的移植物。

在本发明的第一方面，提供了一种组织工程化移植物，它包括：

(a)组织工程载体，所述的组织工程载体是脱细胞、脱钙的骨；

(b)种子细胞。

在一优选例中，所述的种子细胞选自下组：软骨细胞、骨髓基质干细胞。

在另一优选例中，所述的种子细胞的含量为1×10⁵个细胞/ml-1×10⁸个细胞/ml。

在另一优选例中，所述的组织工程载体是完全脱钙的。

在另一优选例中，所述的组织工程载体是部分脱钙的。

在另一优选例中，所述骨衍生自猪、牛、羊、狗。

在本发明的第二方面，提供了一种制备组织工程化移植物的方法，包括步骤：

(a)提供一组织工程载体，所述的组织工程载体是脱细胞、脱钙的骨；

(b)将种子细胞接种于所述的组织工程载体，其中种子细胞的含量为1×10⁵个细胞/ml-1×10⁸个细胞/ml。

在一优选例中，所述的脱细胞、脱钙的骨是通过步骤制备的：

(a)取骨组织，去除软组织及软骨、骨髓，洗净，并修切成型；

(b)全脱钙或部分脱钙处理；

(c)洗涤处理；

(d)脱脂处理；

(e)洗涤处理；

(f)冻干处理；

(g)消毒处理；

(h)保存备用。

在另一优选例中，所述的种子细胞选自下组：软骨细胞、骨髓基质干细胞。

在本发明的第三方面，提供了一种脱钙骨的用途，它被用于制备组织工程化移植物。较佳地，所述的移植物是骨移植物。

附图说明

图1.脱细胞、脱钙骨的大体照片。

图2.脱蛋白脱钙松质骨的扫描电镜(×50)。

图3.细胞接种后14天，细胞在材料上生长良好。

图4.组织学检测证实细胞与材料复合良好。

图5.箭头所指为细胞材料复合物；另一侧为单纯材料。

图6.裸鼠皮下植入后14周。

图7.细胞材料复合物植入8周后可见在骨小梁表面有规则的细胞排列，血管较丰富(4×10)。

图8.细胞材料复合物植入12周可见成骨细胞和破骨细胞活跃，新骨形成。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现脱细胞、脱钙的骨十分适合作为组织工程载体构建各种移植物，尤其是骨移植物。在此基础上完成了本发明。

术语

术语“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、蛋白质或多肽，例如纯化的细胞因子或分离的细胞因子。

术语“异种移植”指将所需生物材料(如骨细胞)从某一物种中取出并再施用于另一物种对象的方法。

术语“自体移植”指将所需生物材料(如骨细胞)从某病人中取出并再施用于同一病人的方法。

术语“异体移植”指将所需生物材料(如骨细胞)从某个体中取出并再施用于另一不同病人的方法。

术语“脱钙骨基质”指完全脱细胞的、完全或部分脱钙的骨。

可用于本发明组织工程载体的骨组织来源没有特别限制，可以是来源于人的同种异体骨组织，也可以是来源于动物(如猪、牛、羊、狗等)的异种骨组织。优选的是来源于猪、牛的异种骨组织。

本发明的组织工程载体是完全脱细胞的。此外，按脱钙程度分为完全脱钙(脱钙率大于90％，较佳地大于99％，甚至为100％)和部分脱钙(脱钙率为40-90％)两种类型。在同样处理条件下，完全脱钙骨的力学强度较差，但抗原性较低；部分脱钙骨力学强度较好，适用于具有一定力学强度要求的修复环境，但由于抗原成分去除不完全，抗原性较完全脱钙骨高。

完全脱细胞、脱钙骨的制备过程基本上包括步骤：(a)取骨组织，去除软组织及软骨、骨髓，洗净，并修切成型；(b)全脱钙处理；(c)洗涤处理；(d)脱脂处理；(e)洗涤处理；(f)冻干处理；(g)消毒处理；(h)保存备用。使用前可再次消毒。

一种具体的制备全脱钙骨的方案如下：

(a)取新鲜骨组织，去除其上的软组织及软骨、骨髓，自来水冲洗1-6小时，并修切成型(如片状)。该步骤中，也可以先修切成型再作洗净处理。

(b)于10-20倍骨组织体积的脱钙液中脱钙至完全(时间通常为6-24小时，较佳地为8-12小时)，其中脱钙液成分为：浓盐酸5ml，氯化钠15g，加蒸馏水至100ml。

(c)自来水冲洗1-6小时，蒸馏水洗涤3次，并沥干水分。

(d)于氯仿：甲醇为1∶1(v/v)溶液中脱脂24小时，然后蒸馏水漂洗3-5次。

(e)30％双氧水浸泡0.5-1小时，蒸馏水洗涤5次。

(f)在-40℃，10^-5Pa条件下冷冻干燥24～72小时。

(g)25KGYγ射线消毒。

(h)-4℃冰箱中密封保存。使用前再次用25KGYγ射线消毒。

完全脱细胞、部分脱钙骨的制备过程与完全脱细胞、部分脱钙骨的制备基本上相同，不同点仅在于脱钙程度不同而已。制备过程同样包括步骤：(a)取骨组织，去除软组织及软骨、骨髓，洗净，并修切成型；(b)部分脱钙处理；(c)洗涤处理；(d)脱脂处理；(e)洗涤处理；(f)冻干处理；(g)消毒处理；(h)保存备用。使用前可再次消毒。

一种具体的制备部分脱钙骨的方案如下：

(a)取新鲜骨组织，去除其上的软组织及软骨、骨髓，自来水冲洗1-6小时，并修切成型(如片状)。该步骤中，也可以先修切成型再作洗净处理。

(b)于10-20倍骨组织体积的脱钙液中脱钙至完全(时间通常为1-6小时，较佳地为2-5小时)，其中脱钙液成分为：浓盐酸5ml，氯化钠15g，加蒸馏水至100ml。

(c)自来水冲洗1-6小时，蒸馏水洗涤3次，并沥干水分。

(d)于氯仿：甲醇为1∶1(v/v)溶液中脱脂24小时，然后蒸馏水漂洗3-5次。

(e)30％双氧水浸泡0.5-1小时，蒸馏水洗涤5次。

(f)在-40℃，10^-5Pa条件下冷冻干燥24～72小时。

(g)25KGYγ射线消毒。

(h)-4℃冰箱中密封保存。使用前再次用25KGYγ射线消毒。

制得的脱钙骨基质可直接用作组织工程载体。此外，本发明的该种脱细胞、脱钙骨组织还可以复合各种无机材料，例如如羟基磷灰石、生物陶瓷玻璃、磷酸三钙等或其复合物；各种合成有机材料如聚乳酸、聚羟基乙酸、聚环氧乙烷与聚环氧丙烷的共聚物等或其复合物；各种天然提取有机材料如藻酸盐、胶原、透明质酸、壳聚糖等或其复合物。

此外，本发明的组织工程载体还可添加、复合各种非成骨性细胞、生长因子、各种转基因成分，以保持成骨细胞表型、促进细胞生长或基质合成能力等。

本发明的组织工程载体中，还可添加、复合各种非成骨性细胞生长因子、各种转基因成分促进组织生长、血管、神经长入等。

用本发明组织工程化载体可构建各种移植物，尤其是骨移植物。用本发明的组织工程化载体构建各种移植物的制备方法很简便，将一定数量的种子细胞直接接种于本发明的组织工程载体即可。

对于骨移植物而已，合适的种子细胞是各种具有成骨能力的细胞，如来源于骨膜的成骨细胞、骨髓基质干细胞诱导的成骨细胞、胚胎成骨细胞、胚胎干细胞诱导的具成骨能力的细胞等。特别优选的种子细胞是骨髓基质干细胞。

分离和培养各种种子细胞的技术是本领域中已知的。以骨髓基质干细胞为例，可用于本发明的骨髓基质干细胞的来源没有特别限制，可以是任何来源的骨髓基质干细胞。通常，本发明的骨髓基质干细胞的是同种同体或同种异体。一种优选的来源是来自自体的骨髓。

分离获得骨髓基质干细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是全麻下骨髓穿刺抽取自体骨髓，以密度梯度离心法分离出其中的有核细胞，加入适合的培养液(如含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C50ug/ml，青、链霉素各100U/ml，地塞米松5nM(Sigma)的DMEM(Gibco，Gland Island，NY，USA)条件培养液)，制成细胞悬液，以约1×10⁵/cm²的密度接种于培养皿，于37℃、5％CO₂、100％饱和湿度的条件下培养。48小时后首次换液，加入条件培养液继续培养隔日换液。待细胞生长近汇合后，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，以1×10⁴/cm²的密度接种进行细胞传代。优选第2～15代细胞用于制备人工软骨。

一类优选的骨髓基质干细胞是体外培养的第二代～第十五代骨髓基质干细胞。此时的干细胞用免疫组织化学染色证明II型胶原表达，RT-PCR及原位杂交检测证明II型胶原mRNA及聚集蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA的表达。

本发明的移植物中的种子细胞浓度通常约为1×10⁵/ml至1×10⁸/ml或更高，较佳地为2×10⁵/ml至5×10⁷/ml。通常，以培养液调整种子细胞浓度，然后与本发明的组织工程载体混合，其中混合时培养液与固体性材料的比例没有特别限制，但是以本发明载体能够吸附的培养液最大量为准。

在本发明的移植物中，还可添加或复合其他各种细胞、生长因子、各种转基因成分，从而保持细胞表型、促进细胞生长或基质合成能力等，或者促进组织生长、血管、神经长入等。

形成的骨移植物，可直接植入体内骨缺损处等各部位，修复骨组织缺损或骨组织填充。

本发明的组织工程载体(即生物支架材料)除可应用于骨组织构建外，可用于其他组织构建的生物支架材料，如皮肤。其主要优点在于：

(a)具有天然密集的微孔和孔隙结构，能够为基质细胞增殖、分化与成骨提供自然的三维空间；

(b)脱细胞-脱钙松质骨的吸收与新骨的形成基本同步，可以在破骨细胞的作用下降解，既为新骨生成提供支架，又不影响新骨的塑形；

(c)与细胞生物相容性好，有利于细胞的贴附、迁移与增殖；

(d)具有较好的可塑性及一定的机械强度，容易加工成所需的形状并有支撑作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

完全脱钙骨基质的制备

取新鲜猪骨组织，切成片状，去除其上的软组织及软骨、骨髓，自来水冲洗1-6小时；蒸馏水冲洗干净，于-80℃冰箱中冷冻12小时；蒸馏水解冻后，于10-20倍骨组织体积的脱钙液(浓盐酸5ml，氯化钠15g，加蒸馏水至100ml)中脱钙6-24小时，从而完全脱钙；自来水冲洗1-6小时，蒸馏水洗涤3次，沥干水分后，于氯仿：甲醇为1∶1溶液中脱脂24小时；蒸馏水漂洗3-5次，2mol/l叠氮化钠溶液浸泡12小时；蒸馏漂洗5次，30％双氧水浸泡0.5-1小时；蒸馏水洗涤5次，在-40℃，10^-5Pa条件下冷冻干燥24～72小时；25KGYγ射线消毒，-4℃冰箱中密封保存；使用前再次用25KGYγ射线消毒。

脱细胞、脱钙骨的大体照片和脱蛋白脱钙松质骨的扫描电镜(×50)照片见图1和图2。

实施例2

部分脱钙骨基质的制备

取新鲜猪骨组织，切成长方体形，去除其上的软组织及软骨、骨髓，自来水冲洗1-6小时；蒸馏水冲洗干净，于-80℃冰箱中冷冻12小时；蒸馏水解冻后，于10-20倍骨组织体积的脱钙液(浓盐酸5ml，氯化钠15g，加蒸馏水至100ml)中脱钙1-6小时，从而部分脱钙；自来水冲洗1-6小时，蒸馏水洗涤3次，沥干水分后，于氯仿：甲醇为1∶1溶液中脱脂24小时；蒸馏水漂洗3-5次，2mol/l叠氮化钠溶液浸泡12小时；蒸馏漂洗5次，30％双氧水浸泡0.5-1小时；蒸馏水洗涤5次，在-40℃，10^-5Pa条件下冷冻干燥24～72小时；25KGYγ射线消毒，-4℃冰箱中密封保存；使用前再次用25KGYγ射线消毒。

实施例3

骨髓基质干细胞(BMSCs)的获取和培养

实验动物为幼年家猪5头，体重约10kg，成年裸鼠10只，均由川沙养殖厂提供。

(1)取材

动物以氯氨酮10～20mg/kg、阿托品0.5～1mg肌注麻醉诱导及抑制腺体分泌，耳缘静脉缓慢静推水合氯醛(10％)1ml/kg或戊巴比妥钠(2.5％)1ml/kg麻醉，常规消毒铺巾，16号穿刺针于股骨近端穿刺，抽取骨髓6～8ml，置于肝素化的离心管中。

(2)分离有核细胞(密度梯度离心法)

将抽取的骨髓先后用5ml和1ml空针反复抽吸数次，转移至另一离心管内，加入少量的无血清DMEM培养液，混匀，3000rpm离心10分钟，轻轻吸除脂肪及大部分上清液，注意不要搅动下方的沉淀物，重新振荡混匀，在另一15ml离心管内加入新鲜配制的Percoll分离液(Pharmacia公司)，分离液表面轻轻加入上述的骨髓细胞悬液(体积为分离液的一半)，900g离心30分钟，此时离心管内液体分为四层：第一层主要是血清和少量的培养液，第二层为有核细胞层，第三层为Percoll分离液，第四层主要是沉淀下来的红细胞。轻轻吸取第二层的有核细胞转移至另一离心管内，加入适量的无血清DMEM培养液洗涤离心二次。

(3)接种

弃上清，细胞以含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C50ug/ml，青、链霉素各100U/ml，地塞米松5nM(Sigma)的DMEM(Gibco，Gland Island，NY，USA)条件培养液制成细胞悬液，取少量细胞悬液用4％乙酸等体积稀释破坏残存的红细胞，常规计数有核细胞数，以2.5×10⁵/cm²的密度接种于培养皿，常用的100mm塑料培养皿接种有核细胞1.5×10⁷左右，加入细胞悬液9～10ml既可。

(4)培养与传代

将接种好的培养皿置于37℃、5％CO₂、100％饱和湿度的条件下，培养48小时后首次换液，此时在低倍镜下可清楚地见到多个克隆形成，吸除旧培养液，PBS洗涤2～3次，加入新鲜条件培养液，继续在相同的条件下培养，隔日更换三分之二量的培养液，一般4～5天后可达到融合状态，可继续传代培养。传代时吸除培养液，以少量PBS洗涤一次，加入1.5-2.0ml的消化液(含0.02％EDTA及0.25％胰蛋白酶的PBS)，镜下见大部分细胞胞质回缩、形态变圆后，轻轻吸除消化液，加入适量的含血清的DMEM条件培养液中止消化，收集细胞悬液、计数，以1.5×10⁴/cm²细胞密度接种于新的培养皿内，继续在相同的条件下培养。隔日更换三分之二量的培养液，一般4～5天后又可达到融合状态，可继续传代培养。第2～15代细胞均可用于实验。

倒置显微镜下观察，经地塞米松诱导的BMSCs近圆形或多角形，传代后可形成单层，无明显的方向性，胞浆内基质分泌颗粒较未经诱导的BMSCs旺盛。

实施例4

骨移植物的制备

取实施例3中制备的，第四代以前骨髓基质干细胞细胞消化收集后，分别以5×10⁶/ml、10×10⁶/ml的细胞浓度，接种于实施例1和2制备的材料上。在条件培养基中，37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱培养3-5天。倒置光学显微镜与扫描电镜观察(图3、图4)。然后用于体内植入。

实施例5

动物移植试验

将实施例4制备的骨移植物(即细胞-生物材料复合物)在体外培养3-5天，待细胞在支架材料上完全贴附生长后，植入裸鼠。方法如下：裸鼠乙醚吸入麻醉，常规消毒铺巾，在超净台内将裸鼠背部正中切开长度为2cm的切口，向左右两侧将皮肤与皮下组织作钝性分离，把直径0.5cm厚0.3cm的实施例4制备的细胞-材料复合物植入裸鼠背部皮下，同时植入同等大小的空白材料做为对照，缝合切口。分别在4周，8周，12周取材。

分别将4周，8周，12周取材的组织块，在4℃条件下，中性福尔马林固定过夜，脱钙液脱钙48-72小时，作组织学切片，HE染色。

结果

(1)大体观察

4周时，空白组体积变化不大，裸鼠背部实验组部位较光滑；8周时，空白组材料略缩小，实验组材料体积变化不明显，并与背部皮肤有部分粘连，尚可以钝性分离；12周时，实验组材料与背部皮肤粘连紧密，无法分离，空白组材料基本降解(图5、6)。

(2)HE染色结果

空白对照组无新骨形成，降解吸收明显，有纤维包裹。4周实验组内见镜下见多数骨小梁表面有细胞被复。细胞呈扁平状，部分区域可见细胞与骨小梁间有浅伊红色物质沉着，有较多小血管形成。8周、12周实验组有新的骨小梁形成，在其周围可见到有明显成骨细胞和破骨细胞并存，血管多见(图7，图8)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种组织工程化移植物，其特征在于，它包括：

(a)组织工程载体，所述的组织工程载体是脱细胞、脱钙的骨；

(b)种子细胞。

2.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的种子细胞选自下组：软骨细胞、骨髓基质干细胞。

3.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的种子细胞的含量为1×10⁵个细胞/ml-1×10⁸个细胞/ml。

4.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的组织工程载体是完全脱钙的。

5.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的组织工程载体是部分脱钙的。

6.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述骨衍生自猪、牛、羊、狗。

7.一种制备组织工程化移植物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一组织工程载体，所述的组织工程载体是脱细胞、脱钙的骨；

(b)将种子细胞接种于所述的组织工程载体，其中种子细胞的含量为1×10⁵个细胞/ml-1×10⁸个细胞/ml。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的脱细胞、脱钙的骨是通过步骤制备的：

(a)取骨组织，去除软组织及软骨、骨髓，洗净，并修切成型；

(b)全脱钙或部分脱钙处理；

(c)洗涤处理；

(d)脱脂处理；

(e)洗涤处理；

(f)冻干处理；

(g)消毒处理；

(h)保存备用。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的种子细胞选自下组：软骨细胞、骨髓基质干细胞。

10.一种脱细胞、脱钙的骨的用途，其特征在于，它被用于制备组织工程化移植物。

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