CN110639061A - 一种双重仿生骨腱界面书页支架 - Google Patents

一种双重仿生骨腱界面书页支架 Download PDF

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Abstract

本发明属于骨腱界面损伤修复技术领域，具体涉及一种双重仿生骨腱界面书页支架。具体步骤如下：步骤一、正常骨腱界面组织样本获取；步骤二、双重仿生骨腱界面书页支架：(1)骨腱界面组织脱钙；(2)“书页”多层组织薄片技术制备支架；(3)骨腱界面支架去细胞处理。这种双重仿生支架不但能保留组织的结构和基质成分，还可一定程度避免胞外基质成分丢失，特别是生物活性成分的丢失；而且还能保障去细胞支架具有优良的牵拉力学性能，实现骨与腱快速而牢靠地锚定。可以有效地加速组织的去细胞过程，减少去细胞时间，很好地保留组织的形态结构、基质成分。

Description

一种双重仿生骨腱界面书页支架
技术领域
本发明属于骨腱界面损伤修复技术领域，具体涉及一种双重仿生骨腱界面书页支架。
背景技术
随着全民体育健身运动的蓬勃开展，国民身体素质和健康意识得以稳步提升，但不可避免的是，各类运动损伤的发病人数也随之增加。其中，骨腱界面损伤(如交叉韧带损伤、肩袖损伤)是最为常见的一类运动损伤。据统计，仅在美国每年就有约25万例肩袖损伤和10万例前交叉韧带损伤需手术治疗。我国目前虽然缺乏相关流行病学资料，但类比美国的数据资料，骨腱界面损伤已成我国运动医学领域亟待解决的挑战，其治疗给社会和家庭带来了沉重的经济负担。
典型的骨腱界面由骨、纤维软骨及肌腱三层结构构成。临床上，骨腱界面损伤的治疗，往往将肌腱/韧带直接固定到骨上，从而实现骨与肌腱/韧带的再连接，为其修复提供条件。研究显示，骨腱界面修复常常被纤维瘢痕组织填充，特征性的骨-纤维软骨-肌腱结构再生困难，因而不能有效地分散应力，恢复运动后容易再次撕裂。数据显示，肩袖损伤修复术后的再撕裂率为25-75％，前交叉韧带重建术后再撕裂率也达10％-25％。近年来，随着手术及康复治疗不断改进，骨腱界面损伤修复质量取得了一定的提升，但仍无法快速再生特征性的骨-纤维软骨-肌腱结构，导致患者运动功能恢复不佳，存在较高的再撕裂风险。
当今多领域的交叉融合发展为骨腱界面损伤后层次结构再生提供了新的策略。以材料科学、分子生物学及细胞生物学相结合的组织工程学成为了当今整合医学的重点研究领域。传统上，尽管单一相的生物支架或单一的种子细胞移植可以修复骨腱界面损伤，但这些方法均无法实现正常骨腱界面层次结构的优质再生。后来，多相地模拟组织的天然形态结构并结合种子细胞一起靶向修复损伤组织/器官，这为骨腱界面损伤后层次结构再生提供了新的希望。然而这些多相支架难以同时模拟生物体骨腱界面形态结构与力学性能的双重仿生，使得患者不能尽早地恢复运动，难以实现快速而优质的愈合。
因此，本发明吸纳“书页”状组织薄片切割方法及去细胞技术优势，取材正常的骨腱界面组织，平行于应力方向由骨向腱切割，设计了一种形态结构与力学性能双重仿生的骨腱界面支架；为临床骨腱界面重建提供一种形态天然、力学可靠、活性优良的新型组织工程移植物，从而实现骨腱界面损伤后快速而优质的愈合。
发明内容
为了解决上述问题，提供了一种双重仿生骨腱界面书页支架。
具体技术方案为：一种双重仿生骨腱界面书页支架，具体步骤如下：
步骤一、正常骨腱界面组织样本获取
从动物尸体上，获取骨腱界面组织，利用冰冻切片机，修正切割为长方体；
步骤二、双重仿生骨腱界面书页支架
(1)骨腱界面组织脱钙；
(2)“书页”多层组织薄片技术制备支架：将完全脱钙的骨腱界面组织，用PBS漂洗3次，每次5min；设置冰冻温度-22℃，将组织块切割成规整的长方体，将组织块平放在冰冻切片机组织支承器上，滴加少量OCT冰冻切片包埋剂，并将组织块压平，滴加OCT包埋剂将组织块完全包埋，迅速将样本置入冰冻切片机冰冻固定；将组织支承器固定在切片机持承器上，调整样本位置，使刀片沿着组织原来的力学牵拉方向由肌腱向骨方向进行切割，保持样本长轴延长线与刀片垂直；根据肌腱束平均直径将切片厚度设置为200-800μm，微调将标本调整到接近刀片的位置，缓慢顺时针方向旋转手动旋钮，刀片沿着肌腱向骨方向切割，切割至骨腱界面组织块骨端，停止并退出；逆时针方向旋转手动旋钮1/2圈，保持固定的切片厚度，再次顺时针方向旋转手动旋钮至刀片行进到骨端，停止并退出；逆时针方向旋转手动旋钮1/2圈，保持固定切片厚度，如此反复进行，获得一端切开，一端带柄的“书页”状骨腱界面组织支架；支架每页厚度为200-800μm，3-10页；将切好的书页状支架置于PBS中漂洗3次，每次5min，去除OCT包埋剂；
(3)骨腱界面支架去细胞处理：样本以4℃PBS冲洗3次，每次10min，滤纸吸除样本表面水分；将样本用纱布包裹，置入液氮冰冻15min，取出后立即行37℃水浴，15min，反复交替5个循环；冻融循环后的书页支架置于含0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中，置于摇床上，振荡24h，4℃；样本取出后PBS振荡漂洗，24h，4℃；将样本置于核酸酶液(含DNA酶deoxyribonuclease I，500U/mL，RNA酶ribonuclease A，1mg/mL)，24h，37℃；样本取出后PBS漂洗24h，4℃；所有试剂均添加过量双抗。
优选的，所述步骤二中(1)骨腱界面组织脱钙具体为：正常骨腱界面组织置于广口瓶中，10％EDTA脱钙液完全浸泡样本，4℃，每周取出样本，更换新脱钙液，直至完成脱钙。
有益效果：本发明顺应正常骨腱界面组织的力学牵拉方向，由肌腱向骨方向切割正常的骨腱界面组织块，经去细胞处理后，制备一种形态结构与力学性能双重仿生的新型组织工程支架，包括支架的骨固定包页部，支架的另一端横向切设有多片延伸的书页片；各书页片由包页端至书页片延伸端依次按照骨、软骨及肌腱的实际分布区域分为骨区、纤维软骨区及肌腱区三个区域，即支架-骨区域、支架-纤维软骨区域及支架-肌腱区域。这种双重仿生支架不但能保留组织的结构和基质成分，还可一定程度避免胞外基质成分丢失，特别是生物活性成分的丢失；而且还能保障去细胞支架具有优良的牵拉力学性能，实现骨与腱快速而牢靠地锚定。可以有效地加速组织的去细胞过程，减少去细胞时间，很好地保留组织的形态结构、基质成分。
附图说明
图1为本申请支架的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
参考图1，一种双重仿生骨腱界面书页支架，具体步骤如下：
步骤一、正常骨腱界面组织样本获取
从动物尸体上，获取骨腱界面组织，利用冰冻切片机，修正切割为长方体；
步骤二、双重仿生骨腱界面书页支架
(1)骨腱界面组织脱钙：正常骨腱界面组织置于广口瓶中，10％EDTA脱钙液完全浸泡样本，4℃，每周取出样本，更换新脱钙液，直至完成脱钙。用物理检测方法判定是否脱钙完全，当骨腱界面组织中骨区域外观趋于透明，易弯曲，用1mL注射器针头可轻松插入样本，表明组织脱钙已完全；
(2)“书页”多层组织薄片技术制备支架：将完全脱钙的骨腱界面组织，用PBS漂洗3次，每次5min；设置冰冻温度-22℃，将组织块切割成规整的长方体，将组织块平放在冰冻切片机组织支承器上，滴加少量OCT冰冻切片包埋剂，并将组织块压平，滴加OCT包埋剂将组织块完全包埋，迅速将样本置入冰冻切片机冰冻固定；将组织支承器固定在切片机持承器上，调整样本位置，使刀片沿着组织原来的力学牵拉方向由肌腱向骨方向进行切割，保持样本长轴延长线与刀片垂直；根据肌腱束平均直径将切片厚度设置为200-800μm，微调将标本调整到接近刀片的位置，缓慢顺时针方向旋转手动旋钮，刀片沿着肌腱向骨方向切割，切割至骨腱界面组织块骨端，停止并退出；逆时针方向旋转手动旋钮1/2圈，保持固定的切片厚度，再次顺时针方向旋转手动旋钮至刀片行进到骨端，停止并退出；逆时针方向旋转手动旋钮1/2圈，保持固定切片厚度，如此反复进行，获得一端切开，一端带柄的“书页”状骨腱界面组织支架；支架每页厚度为200-800μm，3-10页；将切好的书页状支架置于PBS中漂洗3次，每次5min，去除OCT包埋剂；
(3)骨腱界面支架去细胞处理：样本以4℃PBS冲洗3次，每次10min，滤纸吸除样本表面水分；将样本用纱布包裹，置入液氮冰冻15min，取出后立即行37℃水浴，15min，反复交替5个循环；冻融循环后的书页支架置于含0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中，置于摇床上，振荡24h，4℃；样本取出后PBS振荡漂洗，24h，4℃；将样本置于核酸酶液(含DNA酶deoxyribonuclease I，500U/mL，RNA酶ribonuclease A，1mg/mL)，24h，37℃；样本取出后PBS漂洗24h，4℃；所有试剂均添加过量双抗。
使用时：根据肩袖损伤/撕裂大小，修剪该双重仿生骨腱界面书页支架，使其与损伤/撕裂匹配，利用关节镜技术或者开放手术的方式，将该双重仿生支架缝合修补肩袖，从而促进肩袖撕裂/损伤的快速优质愈合。
实施例2
将本申请的一种双重仿生骨腱界面书页支架以及现有技术的支架分别用于相同程度的骨腱界面损伤者，发现本申请的支架相对于现有技术的支架，骨腱界面损伤者恢复快，且愈合优质。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种双重仿生骨腱界面书页支架，其特征在于，具体步骤如下：
步骤一、正常骨腱界面组织样本获取
从动物尸体上，获取骨腱界面组织，利用冰冻切片机，修正切割为长方体；
步骤二、双重仿生骨腱界面书页支架
(1)骨腱界面组织脱钙；
(2)“书页”多层组织薄片技术制备支架：将完全脱钙的骨腱界面组织，用PBS漂洗3次，每次5min；设置冰冻温度-22℃，将组织块切割成规整的长方体，将组织块平放在冰冻切片机组织支承器上，滴加OCT冰冻切片包埋剂，并将组织块压平，滴加OCT包埋剂将组织块完全包埋，迅速将样本置入冰冻切片机冰冻固定；将组织支承器固定在切片机持承器上，调整样本位置，使刀片沿着组织原来的力学牵拉方向由肌腱向骨方向进行切割，保持样本长轴延长线与刀片垂直；根据肌腱束平均直径将切片厚度设置为200-800μm，微调将标本调整到接近刀片的位置，缓慢顺时针方向旋转手动旋钮，刀片沿着肌腱向骨方向切割，切割至骨腱界面组织块骨端，停止并退出；逆时针方向旋转手动旋钮1/2圈，保持固定的切片厚度，再次顺时针方向旋转手动旋钮至刀片行进到骨端，停止并退出；逆时针方向旋转手动旋钮1/2圈，保持固定切片厚度，如此反复进行，获得一端切开，一端带柄的“书页”状骨腱界面组织支架；支架每页厚度为200-800μm，3-10页；将切好的书页状支架置于PBS中漂洗3次，每次5min，去除OCT包埋剂；
(3)骨腱界面支架去细胞处理：样本以4℃PBS冲洗3次，每次10min，滤纸吸除样本表面水分；将样本用纱布包裹，置入液氮冰冻15min，取出后立即行37℃水浴，15min，反复交替5个循环；冻融循环后的书页支架置于含0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中，置于摇床上，振荡24h，4℃；样本取出后PBS振荡漂洗，24h，4℃；将样本置于核酸酶液(含DNA酶deoxyribonucleaseI，500U/mL，RNA酶ribonuclease A，1mg/mL)，24h，37℃；样本取出后PBS漂洗24h，4℃；所有试剂均添加过量双抗。
2.根据权利要求1所述的一种双重仿生骨腱界面书页支架，其特征在于，所述步骤二中(1)骨腱界面组织脱钙具体为：正常骨腱界面组织置于广口瓶中，10％EDTA脱钙液完全浸泡样本，4℃，每周取出样本，更换新脱钙液，直至完成脱钙。
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