CN111228571A - 一种注射用丰唇填充物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及自体脂肪细胞填充物的制备领域，尤其是涉及一种注射用丰唇填充物的制备方法，其主要包括脂肪干细胞的分离提取及培养、脂肪颗粒的提取及填充物的配比，本发明所采用的一种注射用丰唇填充物的制备方法所制备的丰唇用移植填充物能够有效提高脂肪细胞移植的成活率，能够长期稳定维持女性唇部的移植后的形态，极大的提高了使用人员的使用满意度，降低了二次注射丰唇的情况发生。

Description

一种注射用丰唇填充物的制备方法
技术领域
本发明涉及自体脂肪细胞填充物的制备领域，尤其是涉及一种注射用丰唇填充物的制备方法。
背景技术
随着人们审美的改变，薄薄的嘴唇和樱桃小嘴已经渐渐过时，随之而来的丰满而富有张力的“嘟嘟唇”正成为潮流的新宠。人们通常所指的唇型是指暴露部分的红唇而言的，红唇正面观的形态是由两侧口角开始红唇由薄变厚，到唇峰处即为红唇最厚处。红唇厚度一般上唇为7-8mm ，下唇则为10-11 mm 。上唇红唇有4个自然弧形，下唇则无上唇那种特定的弧度而基本是圆弧形。一般将红唇厚度在4mm 以下定为口唇过薄。手术丰唇有假体丰唇， 有利用上睑成形术时切取眼轮匝肌移植丰唇等方式，然而，手术丰唇其费用较高， 且要具备一定条件，一部分患者惧怕手术，所以受到一定限制，很多爱美人士选择玻尿酸来打造一双丰盈的嘟嘟唇，因为玻尿酸丰唇是当下十分流行的一种微创丰唇方法。众所周知，玻尿酸原本就是皮肤天然组织成分之一，与人体无排斥，在真皮层注射不会带来任何毒副作用，无痛无疤，效果可控，自然柔软，而且立刻就能见效。但是玻尿酸填充是有时限的，需要定期进行填充，不然就会出现塌陷等问题。自体脂肪丰唇是现在新兴的丰唇方式，自体脂肪丰唇是指从脂肪多余处将脂肪吸出，经过处理，将优质脂肪颗粒分层均匀注入唇部，让双唇性感、迷人。自体脂肪之所以能够达到丰唇的目的，主要是因为自体脂肪丰唇是从受术人自身提取脂肪，因此没有任何的风险存在，但是自体脂肪丰唇的脂肪成活率低一直是制约手术效果的关键因素。
I型胶原蛋白由I型原胶原蛋白经蛋白酶剪切形成，I型原胶原蛋白比I型胶原蛋白在结构上多2个末端前肽(propeptide)结构(C-前肽与N-前肽)。I型原胶原蛋白具有胶原蛋白家族中所有原胶原蛋白的典型特征：首先含有一段具有(Gly-X-Y)n重复序列的三聚体结构，在N端与C端的2个前肽形成非螺旋的结构域(NC结构域)，位于(Gly-X-Y)n重复序列两侧，NC结构域再进一步形成球状结构。折叠好的I型原胶原蛋白是异源三聚体的结构，即由2条αl链与1条α2链交互缠绕所形成。I型原胶原蛋白分泌到胞外基质中后，经过蛋白酶的剪切除去C-前肽与N-前肽，就形成了成熟的胶原蛋白。胶原蛋白为生物体提供了一种机械支撑作用，维护器官与组织的完整性，保障其正常功能的行使，这对于实质性器官而言非常重要。胶原蛋白是实质性器官——基底膜的主要成分，除此之外，胶原在形成特定的细胞外微环境中也起到主要作用，而这些微环境对于维持细胞的完整性及传递细胞外信号非常关键,如作为确立细胞形状及行为的信号分子、在细胞分化与发育中起重要作用等。I型胶原蛋白分子还可以通过整合素、盘蛋白(discoidin)结构域受体、糖蛋白等跨膜受体向细胞内传递不断变化的外源刺激信号，从而起到信号分子的作用，与此同时，胶原蛋白还具有信号“中转站”的功能，它能够截留、贮存、运输生长因子，从而在器官发育、伤口愈合和组织修复等过程中充当重要角色。胶原蛋白还可以作为矫形手术材料。因为胶原蛋白在具有上述生物学功能外，还有具有低免疫原性，以及大规模生产的可行性等优点，正成为医药、食品和化妆品工业中的新宠。目前的研究认为，脂肪来源干细胞（ASCs）不仅可以分化为脂肪细胞，还可以分化为中胚层来源的多种细胞，具有多向分化潜能。它存在于脂肪细胞之间、血管壁、细胞外基质中，但大部分聚集在血管周围。其在缺氧条件下可释放血管形成因子，并可分化为血管内皮细胞，表现为成血管特性，因此，ASCs 被认为是一种脂肪细胞和血管细胞的双重祖细胞。在脂肪移植中，ASCs 既可以分化成脂肪细胞并促进脂肪再生，又可以分化成血管内皮细胞和壁细胞，促进血管化作用，为脂肪细胞提供营养。可以说，ASCs是维持脂肪移植成活的关键因素。脂肪细胞是前脂肪细胞分化的终产物。而ASCs对脂肪移植成活率有着积极的影响。I型胶原支架材料与脂肪干细胞具有良好的体外生物相容性，而且具有对细胞、组织等无毒性；不影响生物体的生长、增殖等功能。有实验表明用体外生物I型胶原支架材料与脂肪干细胞进行体外混合培养，证明了脂肪干细胞能在I型胶原支架材料上良好的附着、生长、增殖并在三维支架材料内保持均匀分布。故I型胶原支架可作为构建脂肪组织工程的细胞载体。I型胶原作为体外细胞培养支架时.有促进细胞粘附和诱导生长分化的作用，是良好的培养粘附剂。其降解产物可被细胞利用合成新的基质。不产生毒性代谢产物，不影响内环境pH 值，不影响细胞的生长增殖，胶原蛋白及相关制品已广泛应用于临床医学中。
发明内容
针对现有利用自体脂肪进行人体丰唇作业时所存在的脂肪细胞的存活率低的问题，本发明提供一种注射用丰唇填充物的制备方法，其主要包括脂肪干细胞的分离提取及培养、脂肪颗粒的提取及填充物的配比，所述脂肪干细胞的分离提取及培养的过程为：麻醉后取适供区脂肪组织，使用PBS进行冲洗后将脂肪剪碎，加入胶原蛋白酶溶液，上述溶液的基质为PBS，待消化好以后在离心机中进行离心作业，然后，使用吸管轻轻吸弃上层液体，将下层提取物用PBS再洗1次，重复上述操作，最后将其重悬于低糖DMEM为基础的完全培养基中，接种于培养瓶中培养，接种一段时间后观察细胞状态，半换液，待细胞生长状况较好的时候，正常换液传代，传代2次后，即可得到进行移植的脂肪干细胞；
所述脂肪颗粒的提取过程为：取合适供区脂肪组织，将其洗净后剪碎成颗粒状，将其移入DMEM/F12中并进行离心作业后弃上清再度混悬即得到脂肪细胞颗粒；
所述填充物的配比过程为：所述脂肪干细胞与脂肪细胞颗粒混合后（每毫升脂肪颗粒中含有约4X106脂肪干细胞），加入I型胶原蛋白其质量分数为0.03g/mL，混合后即可得到移植用填充物。
进一步的，所述的PBS为Phosphate Buffered Saline的简称，其具体的组配为磷酸二氢钾(KH2PO4)，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)及吐温-20的混合物加水后混合而成；
进一步的，所述在脂肪干细胞的分离提取及培养的过程中，其实验操作均需要在高标准的无菌洁净室中完成；
进一步的，所述的在脂肪干细胞的分离提取及培养的过程中的麻醉具体规格可选为，0.9％生理盐水500ml、2％盐酸利多卡因40mL及肾上腺素1mL来进行麻醉；
进一步的，所述的在脂肪干细胞的分离提取及培养的过程中的低糖DMEM为基础的完全培养基为含有体积分数12%胎牛血清及1%的双抗；
进一步的，所述的脂肪干细胞的分离提取及培养的过程为：实验操作均需要在高标准的无菌洁净室中完成，常规麻醉后取就医者合适供区脂肪组织50mL，使用1L的pH为7.4的PBS进行冲洗后将脂肪剪碎成1.0-2.0 mm的大小放入试管中，而后，加入0.075%的Ⅰ型胶原蛋白酶溶液，上述溶液的基质为PBS，待消化好以后在离心机中以600 r/min的离心转速离心 15 min，而后，通过吸管轻轻吸弃上层液体，将下层提取物用PBS再洗1次，重复上述操作，最后将其重悬于低糖DMEM为基础的完全培养基中，接种于培养瓶中培养，在37℃、体积分数5%CO2的培养环境中，接种24 h后观察细胞状态，半换液，待细胞生长状况较好的时候，正常换液传代，传代2次后，即可得到进行移植用的脂肪干细胞；
进一步的，上述1L的pH为7.4的PBS的制备方法为取磷酸二氢钾(KH2PO4):0.24g，磷酸氢二钠(Na2HPO4):1.44g，氯化钠(NaCl):8g，氯化钾(KCl):0.2g混合后加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L即可得到；
进一步的，在所述的脂肪颗粒的提取的过程中，取合适供区脂肪组织50mL，将其洗净后剪碎至大小为0.5-1.0 mm的颗粒状，而后，将其移入DMEM/F12中以1000 r/min离心5 min，弃上清再度混悬即得到脂肪细胞颗粒；
本发明的有益效果为：本发明所采用的一种注射用丰唇填充物的制备方法所制备的丰唇用移植填充物能够有效提高脂肪细胞移植的成活率，能够长期稳定维持女性唇部的移植后的形态，而且，本发明操作过程比较简单方便，极大的提高了使用人员的使用满意度，降低了二次注射丰唇的情况发生，进一步降低了使用者的后期养护成本。
附图说明
图1是本发明中实验者满意度打分图表；
图2是本发明中实验者满意度得分对比图表；
图3本发明中实验者满意度对比图表。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是：本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“1.5～2.5”表示本文中已经全部列出了“1.5～2.5”之间的全部实数，“1.5～2.5”只是这些数值组合的缩略表示。本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
具体实施例1：针对现有利用自体脂肪进行人体丰唇作业时所存在的脂肪细胞的存活率低的问题，本发明提供一种注射用丰唇填充物的制备方法，其主要包括脂肪干细胞的分离提取及培养、脂肪颗粒的提取及填充物的配比，所述脂肪干细胞的分离提取及培养的过程为：实验操作均需要在高标准的无菌洁净室中完成，常规麻醉后取就医者合适供区脂肪组织50mL，使用1L的pH为7.4（1L的pH为7.4的PBS的制备方法为取磷酸二氢钾(KH2PO4):0.24g，磷酸氢二钠(Na2HPO4):1.44g，氯化钠(NaCl):8g，氯化钾(KCl):0.2g混合后加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L即可得到）的PBS进行冲洗后将脂肪剪碎成1.0-2.0 mm的大小放入试管中，而后，加入0.075%的Ⅰ型胶原蛋白酶溶液，上述溶液的基质为PBS，待消化好以后在离心机中以600 r/min的离心转速离心 15 min，而后，通过吸管轻轻吸弃上层液体，将下层提取物用PBS再洗1次，重复上述操作，最后将其重悬于低糖DMEM为基础的完全培养基中，接种于培养瓶中培养，在37℃、体积分数5%CO2的培养环境中，接种24 h后观察细胞状态，半换液，待细胞生长状况较好的时候，正常换液传代，传代2次后，即可得到进行移植用的脂肪干细胞；所述的脂肪颗粒的提取的过程中，取合适供区脂肪组织50mL，将其洗净后剪碎至大小为0.5-1.0 mm的颗粒状，而后，将其移入DMEM/F12中以1 000 r/min离心5 min，弃上清再度混悬即得到脂肪细胞颗粒；所述填充物的配比过程为：所述脂肪干细胞与脂肪细胞颗粒混合后（每毫升脂肪颗粒中含有约4X106脂肪干细胞），加入质量分数为0.03g/mL的I型胶原蛋白，混合后即可得到移植用填充物。为了验证本发明所提供的一种注射用丰唇填充物的制备方法是否真实有效，本发明提供以下实验进行验证：
术前检查及评估：术前常规检查有无手术禁忌证，并与患者充分沟通确认上下唇厚度及要求的厚度，注射范围。通过术前l天生理盐水注射，估计所需的脂肪量。
术前定位：上下唇微张，美蓝标记出上下唇红唇凹陷菲薄部位及脂肪供区范围，常规消毒，铺无菌巾。
脂肪颗粒的填充：于口唇角进针，分别于上下红唇区用0.5%利多卡因局部浸润麻醉，用16 号针头刺一小孔，用针径1 mm的特制脂肪注射针头进行脂肪注射，按照前一天术前的注射量，分别于左右口角上下红唇区各注射纯化脂肪颗粒，上唇总量约2-2.5mL， 下唇总量约2.5-3mL ，进行局麻按摩塑性，因注入的脂肪后期会有部分液化吸收，故在不影响正常生活工作的情况下，过渡矫正30% 左右，术后常规消毒，针眼纱布压迫5-10min，次日常规碘酒消毒。
术后护理：
颗粒脂肪移植注射后，受区48h 内可间断冷敷或冰敷，24h 内可进行局部按摩塑形，禁忌持续暴力按摩，以免脂肪液化，患者可从事正常的工作及生活，但应避免过度疲劳。
患者分组情况：对进行注射丰唇患者无人为因素影响下随机分为3组每组20人，合计60人，实验组：使用本发明方法获得的混合填充物
对照组1：填充物仅使用自身脂肪颗粒
对照组2：填充物仅使用I型胶原蛋白（0.01M磷酸氢二钠溶液中加入pH=6的MES溶液，直至溶液pH=7，用去离子水稀释20倍后作为溶剂，确保其中I型胶原蛋白浓度为0.03g/mL）。
效果评估：
（1）评估标准分为以下几个方面，在术后两个月后定期回访，使用唇纹图像分析仪以及cornerometer水分测试仪进行测试。评价术前术后的效果，根据评分标准分别计算两组患者术前、术后的分值，比较两组间在治疗效果上有无区别。观察指标及判定标准：比较两组治疗前及治疗后3个月的唇部评分。 嘴唇丰满度：丰满3分，较丰满2分，一般1分，无改善0分
嘴唇舒适度：很舒适3分，较舒适2分，一般1分，不舒适0分
嘴唇柔软度：很柔软3分，较柔软2分，一般1分，不柔软0分
唇纹情况：无明显唇纹3分，少量唇纹2分，一般1分，较多唇纹0分
计算每组患者评分的得分，分数越高，综合结果越好。在此过程中应避免术后患者自行保养唇部，患者身体状况以及外部人为因素对于测试结果的影响；
（2）患者满意情况：术后6个月患者复诊时，使用Likert量表评估患者的满意度，其评分包括非常不满意、不满意、一般、满意和非常满意。
效果验证：
手术进行后，除对照组一例患者有轻度肿胀且于1周内恢复外，其余患者均未出现术后并发症，实验组，对照组1，对照组2的嘴唇丰满度，舒适度，柔软度以及唇纹情况的得分如说明书附图1所示，实验组的得分远高于对照组1及对照组2的得分；
说明书附图3是各组总得分情况，实验组的得分远远高于其余两组对照组，说明采用的I型胶原蛋白与ASCs联用辅助脂肪细胞移植的填充物，综合效果更好；
说明书附图3为就医者6个月后回访的满意度调查，术后6个月患者复诊时，使用Likert量表评估患者的满意度，其评分包括非常不满意、不满意、一般、满意和非常满意。每组的20人中，实验组非常满意人数为19人，对照组1和对照组2中的非常满意人数为13和12人，可以看到实验组的数据远高于其余两组；
由以上数据可以看出，本发明所采用的I型胶原蛋白与ASCs联用辅助脂肪细胞移植填充物能够有效提高脂肪细胞移植的成活率，而且能够长期稳定维持整形后唇部形态。极大的提高就医者的满意度，而且避免了多次重复注射的困扰。

Claims (8)

1.一种注射用丰唇填充物的制备方法，其特征在于，主要包括脂肪干细胞的分离提取及培养、脂肪颗粒的提取及填充物的配比，所述脂肪干细胞的分离提取及培养的过程为：麻醉后取适供区脂肪组织，使用PBS进行冲洗后将脂肪剪碎，加入胶原蛋白酶溶液，上述溶液的基质为PBS，待消化好以后在离心机中进行离心作业，然后，使用吸管轻轻吸弃上层液体，将下层提取物用PBS再洗1次，重复上述操作，最后将其重悬于低糖DMEM为基础的完全培养基中，接种于培养瓶中培养，接种一段时间后观察细胞状态，半换液，待细胞生长状况较好的时候，正常换液传代，传代2次后，即可得到进行移植的脂肪干细胞；
所述脂肪颗粒的提取过程为：取合适供区脂肪组织，将其洗净后剪碎成颗粒状，将其移入DMEM/F12中并进行离心作业后弃上清再度混悬即得到脂肪细胞颗粒；
所述填充物的配比过程为：所述脂肪干细胞与脂肪细胞颗粒混合后（每毫升脂肪颗粒中含有约4X106脂肪干细胞），加入I型胶原蛋白其质量分数为0.03g/mL，混合后即可得到移植用填充物。
2.根据权利要求1所述的一种注射用丰唇填充物的制备方法，其特征在于，进一步的，所述的PBS为Phosphate Buffered Saline的简称，其具体的组配为磷酸二氢钾(KH2PO4)，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)及吐温-20 的混合物加水后混合而成。
3.根据权利要求1所述的一种注射用丰唇填充物的制备方法，其特征在于，进一步的，所述在脂肪干细胞的分离提取及培养的过程中，其实验操作均需要在高标准的无菌洁净室中完成。
4.根据权利要求1所述的一种注射用丰唇填充物的制备方法，其特征在于，进一步的，所述的在脂肪干细胞的分离提取及培养的过程中的麻醉具体规格可选为，0.9％生理盐水500ml、2％盐酸利多卡因40mL及肾上腺素1mL来进行麻醉。
5.根据权利要求1所述的一种注射用丰唇填充物的制备方法，其特征在于，进一步的，所述的在脂肪干细胞的分离提取及培养的过程中的低糖DMEM为基础的完全培养基为含有体积分数12%胎牛血清及1%的双抗。
6.根据权利要求1所述的一种注射用丰唇填充物的制备方法，其特征在于，进一步的，所述的脂肪干细胞的分离提取及培养的过程为：实验操作均需要在高标准的无菌洁净室中完成，常规麻醉后取就医者合适供区脂肪组织50mL，使用1L的pH为7.4的PBS进行冲洗后将脂肪剪碎成1.0-2.0 mm的大小放入试管中，而后，加入0.075%的Ⅰ型胶原蛋白酶溶液，上述溶液的基质为PBS，待消化好以后在离心机中以600 r/min的离心转速离心 15 min，而后，通过吸管轻轻吸弃上层液体，将下层提取物用PBS再洗1次，重复上述操作，最后将其重悬于低糖DMEM为基础的完全培养基中，接种于培养瓶中培养，在37℃、体积分数5%CO2的培养环境中，接种24 h后观察细胞状态，半换液，待细胞生长状况较好的时候，正常换液传代，传代2次后，即可得到进行移植用的脂肪干细胞。
7.根据权利要求6所述的一种注射用丰唇填充物的制备方法，其特征在于，进一步的，所述1L的pH为7.4的PBS的制备方法为取磷酸二氢钾(KH2PO4):0.24g，磷酸氢二钠(Na2HPO4):1.44g，氯化钠(NaCl):8g，氯化钾(KCl):0.2g混合后加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L即可得到。
8.根据权利要求6所述的一种注射用丰唇填充物的制备方法，其特征在于，进一步的，在所述的脂肪颗粒的提取的过程中，取合适供区脂肪组织50mL，将其洗净后剪碎至大小为0.5-1.0 mm的颗粒状，而后，将其移入DMEM/F12中以1 000 r/min离心5 min，弃上清再度混悬即得到脂肪细胞颗粒。
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