CN101597593B - 自体组织成纤维细胞培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种自体组织成纤维细胞培养方法，其特征在于依次进行皮肤标本处理步骤和成纤维细胞培养步骤，所述成纤维细胞培养步骤包括原代成纤维细胞培养步骤，还可根据实际需要设置成纤维细胞传代步骤、成纤维细胞冻存步骤和成纤维细胞解冻复苏步骤。本发明通过自体的成纤维前体细胞的体外培养、扩增方法大量培养自体组织成纤维细胞，用于回输治疗皮肤胶原缺损性疾病或变性疾病，简单方便、安全性好，使用时不会出现排异反应，效果显著。

Description

自体组织成纤维细胞培养方法 

技术领域：

本发明涉及一种将功能细胞在体外构建成具有生命的组织材料，用以植入生物体内，修复或替代病损组织，恢复组织器官的形态、机构与功能；或在生物体内植入某些生物活性物质如透明质酸酶、胶原蛋白、组织干细胞等诱导自体组织再生，达到修复组织、器官功能的自体组织成纤维细胞培养方法。 

背景技术：

随着我国社会和经济的发展，医学美容市场的日益增长，美容整形已经成为我国目前发展最快的学科之一，伴随医学生物科技的高速发展，细胞生物学、分子生物学产品不断地出现于美容整形领域。组织工程学是在分子生物学、移植免疫学、细胞生物学、新型材料学等学科以及基因工程技术、分子克隆技术、体外组织构建技术等高科技迅速发展之后，出现的新兴分支学科。其最终目的是将功能细胞在体外构建成具有生命的组织材料，用以植入生物体内，修复或替代病损组织，恢复组织器官的形态、机构与功能；或在生物体内植入某些生物活性物质如透明质酸酶、胶原蛋白、组织干细胞等诱导自体组织再生，达到修复组织、器官功能的目的【1】。这是继20世纪科学家们解读人类基因密码后，具有重大科学意义的又一事件，对人类健康起到了十分重要的作用，因此，被认为是“一场意义深远的医学革命”，广泛地应用于医学的各个领域【2】。目前的美容除皱方法虽有一定疗效但有一定的时间限制【21】，但由于都不是自体组织，有时会出现排异反应及局部不平整现象。 

社会的进步与生活水平的提高，使人们越来越注重于社会生活质量，面部创伤的修复美容治疗成为人们越来越关心的话题，美容整形也取得快速发展，各种组织工程生物材料不断应用于面部美容与创伤治疗的修复【3】。对抗衰老是全人类共同关注的话题，研究表明对人体肌肤起支撑作用的物质大部分存在于真皮层，由胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸构成的一个纤维网络对皮肤起着支撑作用，其含量的多少决定了皮肤的质地。这三种物质都从真皮层中的成纤维细胞分泌而来，成纤维细胞由成纤维前体细胞演化生成。她不断分泌胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸，保持肌肤的光泽度和质感。25岁以后，成纤维前体细胞以每年1％到2％的速度减少，导致了成纤维细胞的减少，随之而来的就是胶原蛋白、弹性纤维和透明质酸的数量均下降，衰老的迹象就体现出来由此可见成纤维细胞才是导致肌肤衰老的真正原因。成纤维前体细胞(transit amplifying fibroblast，TAF)是间充质干细胞向成纤维细胞分化过程中的过渡细胞，具有持久增殖分化为成纤维细胞的能力，是近年 成功应用于我国美容整形领域的产品之一，具有作用持久、副作用少等优点。当前的美容医学发展趋势朝着简单、微创、安全的方向发展，面部老化的治疗也从过去的手术治疗向生物医学制剂注射治疗转化，当前主要的生物注射制剂有胶原蛋白、透明质酸酶、胚胎干细胞和肉毒素等【4】。在以上生物注射制剂中除肉毒毒素是作用于面部动态皱纹外，均是用于治疗皮肤老化所致的细小皱纹，其中胶原蛋白和透明质酸酶是真皮组织细胞外基质的主要成分，在皮肤中主要起生物替代作用，使老化皮肤逐渐减少的真皮厚度与细胞外基质得到补充，具有除皱效果明显，起效快的特点；但这些成分多数是异体或异种成分，存在免疫排斥和过敏反应的可能，且生物代谢作用使之很快降解，效果持续时间短暂是这类产品的主要缺点【5】。胚胎干细胞也是近年开发的生物美容产品，具有持续的生物美容效果和免疫原性的特点，但胚胎干细胞的来源有限，提纯与保存困难，不能完全排除免疫反应是其缺点【6】。胚胎干细胞的高分化特性使其组织分化方向诱导成为注射后值得关注的一个问题【7】。TAF作为成纤维细胞的来源细胞具有细胞分化活性和分化方向恒定的优点，且为自体组织，排除了免疫与过敏反应的顾虑，在临床上有广泛的应用前景【8】。 

自体细胞除皱的适应症比较广泛，不但对于所有的颜面部皱纹和凹陷性疤痕都有效，还包括颈部皱纹、手部皱纹、额头纹、眉间纹、鱼尾纹、口周和面部皱纹、妊娠纹以及痤疮、青春痘、天花、水痘、外伤等在面部留下的凹陷性疤痕都有明显的效果。由于细胞取自自体，较以往的除皱手段有着截然相反的医学思路，它不是靠破坏或刺激肌肤病理性改变来除皱，也不是异物物理性填充，它是通过直接增强皮肤功能来达到治疗目的，因而属于生理性除皱。自体细胞非手术除皱技术除了可以令患者保持更久的青春外，更重要的是它无与伦比的安全性。 

皮肤主要是由表皮、真皮、皮下组织三部分组成，真皮组织构成了皮肤的支架结构，是影响皮肤弹性与韧性的主要成分。真皮主要由胶原蛋白构成，胶原蛋白成分的多少直接影响着皮肤组织的厚度与弹性。随着皮肤的衰老，真皮组织中成纤维细胞与其所分泌的胶原蛋白的减少，是皮肤出现各种皱纹的主要原因，为皮肤提供足够数量的成纤维细胞是应用TAF进行生物除皱的主要机制【9】。然而，成熟的成纤维细胞增殖与分泌活力有限，研究发现成纤维细胞是由TAF成熟演化而来【10】。在通常情况下，人体皮肤的弹性与光泽就是由真皮组织中TAF的含有量决定，随着年龄的增长皮肤组织内TAF逐渐减少。在皮肤组织中补充TAF可以持续地增加成纤维细胞的含量，促进胶原蛋白的增生，使真皮的厚度增加，恢复皮肤的弹性，从而消除皮肤的皱纹或使凹陷的瘢痕得到填充【11】。 

TAF的采集与培养在这项组织工程技术的应用中具有关键作用。首先需要解决的是TAF的纯化与鉴定，研究发现，有增殖活性的TAF较成熟的成纤维细胞幼稚、饱满，缺乏成熟 细胞的特征性细胞胞质的突起。在组织学鉴定上，采用常规的细胞免疫学方法【12】。培养液的配制对细胞的生长有重要影响，美国Hyclone公司针对TAF的生长特性，设计生产了这一产品【13】。TAF技术在面部美容修复中主要应用于生物美容除皱和凹陷性瘢痕的治疗【14】。美国Isolagen研究机构于1995年开始应用组织工程技术培养自体成纤维前体细胞，并用于面部皱纹和瘢痕的治疗，此后法国、英国、澳大利亚等都开展了这一研究[12][20][16]，取得了丰富的经验，基本形成了产业化生产规模。Keller【15】等应用此技术为20例年龄为37～61岁的中老年人进行了面部除皱治疗，产生了明显的疗效。Watson等运用摄像及硅胶模型技术，选择10例年龄在24～29岁之间的人，同时在耳后注射相同细胞进行病理实验，经3～6个月随访，用注射前后的硅胶模型比较局部皮肤表面的改善情况，对耳后注射部位的样本标本进行了组织学分析。结果表明：10例中有9人在治疗后感觉有60％～100％的改善，临床医师也给出了同样的观察结果；对每例的硅胶模型检查证实，美容者面部的皱纹和瘢痕有10％～85％的减少；经显微镜观察，真皮层胶原蛋白的厚度和密度均有所增加[16]。Boss等【17】对94例中的老年人进行除皱治疗，经36～48个月的随访，美容者的皱纹自主满意率为92％，长期疗效达70％。通过大量的临床实验可以看出，TAF是一种面部美容修复安全有效的方法。国内学者【18】在对82例接受手术的美容者分析中，观察随访时间为6个月，结果自我感觉对皱纹、瘢痕明显消失满意，皮肤苍白状况明显改善者为70例，其满意率为85.4％。在采用硅胶皱纹模型方法观察的10例中，有9例达到60％～100％的改善程度，每例有10％～85％皱纹和瘢痕的减少，在所有观察者中，经过治疗前后血、尿、便常规检查以及肝肾功能和心电图检查，未出现异常反应和全身的不良反应，极少数人在术后24h内注射部位有轻度肿胀、麻木等感觉，未经处理均自然消失。1例在注射部位出现红斑，于3d后自行消失。有医疗机构^]对135例美容者行自体成纤维细胞回植除皱术，术后经6个月至1年的随访，改善者100％、医患均满意者91％。且不同年龄的患者其除皱效果及对术后的满意度是不同的，年轻患者的皱纹浅而少，自体细胞活性强，增殖分化多，除皱效果好；年长患者与之相比则较差。年轻患者一般只需回植注射1次即达到除皱效果；年长患者则需2、3次的补充回植注射方可达到除皱效果【19】。 

[1]杨志明，主编.组织工程.北京：化学工业出版社，2002.15-30. 

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[21]高景恒，冯薇，张晶。注射性软组织填充材料的发展。[J].实用美容整形外科杂志，2003，14(2)：110-112. 

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供一种自体组织成纤维细胞培养方法，采用美容者的自体皮肤细胞，运用当今世界先进的“组织工程技术”，进行细胞分离、纯化、培养，并扩增成足量的成纤维细胞注射液，再回输到受术者的皱纹、凹陷性疤痕等皮肤缺损部位的真皮层内。会输的成纤维细胞在真皮层内继续生长，逐步替换和补充自身已经衰亡的细胞，源源不断地产生属于自己的胶原蛋白、透明质酸和弹性纤维，使皮肤真皮层的厚度和密度增加，直接修复治疗部位的皱纹和凹陷性疤痕等皮肤缺损疾病，恢复皮肤弹性，抚平皱纹，祛除凹陷性疤痕，达到预防、延缓衰老的目的。 

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是： 

该自体组织成纤维细胞培养方法，其特征在于依次进行皮肤标本处理步骤和成纤维细胞培养步骤，所述皮肤标本处理步骤包括： 

无菌条件下切取的皮肤标本，立即放入装有基础培养液的离心管中封存并运输至实验室，置于4℃冰箱中，24小时内处理皮肤标本，所述基础培养液采用DMEM低糖培养液，含重量百分比为20％的胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素； 

所述成纤维细胞培养步骤包括原代成纤维细胞培养步骤，所述原代成纤维细胞培养步骤包括： 

在超净工作台无菌条件下将皮肤标本移入3.5cm培养皿中，用基础培养液冲洗，修剪皮肤标本并去除皮下组织、脂肪，剪切皮肤标本成1mm³小块，小块皮肤标本真皮层紧贴培养瓶底部置于50ml培养瓶中并使其均匀分布，翻转培养瓶使得瓶底朝上，加入基础培养液2ml并保持基础培养液与小块皮肤标本不接触，拧紧瓶塞，将培养瓶倒置于37℃，5％C0₂培养箱中，1小时后缓慢将培养瓶翻转让基础培养液慢慢覆盖附于瓶底上的小块皮肤标本，再倒置培养，2小时后正放培养瓶，使基础培养液与小块皮肤标本接触，每3～5天更换基础培养液一次，每次2ml，使得成纤维细胞大量繁殖。 

本发明所述成纤维细胞培养步骤在原代成纤维细胞培养步骤后还可设置成纤维细胞传代步骤，所述成纤维细胞传代步骤包括： 

吸弃旧培养液，加入2ml的PBS溶液，轻轻清洗细胞后吸弃PBS溶液，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA溶液1ml，将培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱中消化5分钟； 

以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，立即加入5ml基础培养液终止消化； 

吸取培养瓶内的培养液，反复吹打，使已经消化的细胞脱离瓶底壁； 

收集带有细胞的含酶溶液于离心管，离心以1000转/分钟的转速转6分钟，吸弃上清； 

用1ml基础培养液将细胞沉淀重新悬浮，轻轻吹打均匀后再加入5ml基础培养液吹打均匀，将细胞分装于3个新的50ml培养瓶内，每瓶2ml； 

将培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，使原代成纤维细胞分化为成纤维细胞并大量增殖。 

本发明所述成纤维细胞传代步骤可根据需要重复进行，使得成纤维细胞大量增殖。 

本发明所述成纤维细胞培养步骤在原代成纤维细胞培养步骤后或者成纤维细胞传代步骤后还设置有成纤维细胞冻存步骤，所述成纤维细胞冻存步骤包括： 

吸弃培养瓶内旧培养液，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA溶液2ml，于37℃，5％CO₂条件下消化3～5分钟； 

以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入基础培养液终止消化； 

吸取培养瓶内的基础培养液，反复吹打培养皿底壁，使已经消化的细胞脱离瓶底壁； 

收集带细胞培养液，离心以1000转/分钟的转速转6分钟，除去上清； 

加3～5ml基础培养液重悬细胞，离心以1000转/分钟的转速转6分钟，除去上清溶液； 

加1ml冻存液重悬并吹匀细胞，并将细胞转移至冻存管，盖紧密封后，将冻存管封包，所述冻存液包括重量百分比为50％的胎牛血清、10％的DMSO溶液、40％的基础培养液； 

将冻存管储存到4℃冰箱，2小时后转移到-20℃冰箱，再2小时后转移到-80℃冰箱冻存。 

本发明所述成纤维细胞培养步骤在成纤维细胞冻存步骤后还设置有成纤维细胞解冻复苏步骤，所述成纤维细胞解冻复苏步骤包括： 

将含成纤维细胞的冻存管从-80℃冰箱中取出，直接置于37℃水浴中解冻； 

解冻后将冻存管离心以1000转/分钟的转速转6分钟，除去上清； 

加基础培养液2ml重悬细胞，离心以1000转/分钟的转速转6分钟，除去上清； 

加基础培养液1ml重悬细胞并吹打均匀，再加基础培养液1ml并吹匀细胞，将细胞转入50ml培养瓶培养； 

在37℃，5％CO₂培养箱中培养，每3～5天更换基础培养液一次，每次2ml。 

本发明所述超净工作台超净空气的流速为24～30米/分钟。 

本发明通过自体的成纤维前体细胞的体外培养、扩增方法大量培养自体组织成纤维细胞，简单方便、安全性好，使用时不会出现排异反应，效果显著。 

附图说明：

图1为本发明实施例自体原代成纤维细胞示意图。 

具体实施方式：

本发明实施例自体组织成纤维细胞培养植方法操作步骤如下： 

1皮肤标本处理 

无菌条件下切取的皮肤标本，立即放入装有基础培养液(DMEM低糖培养液，含20％(本发明所述比例均指重量百分比，下同)胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素)的离心管中封存、运输至实验室，置于4℃冰箱中，24h内处理皮肤标本。 

2成纤维细胞培养 

设备和材料： 

超净工作台：是一种层流局部空气净化设备，采用可调风量风机系统，将空气通过由特制的微孔泡沫塑料片层叠合组成的“超级滤清器”后吹送出来，形成连续不断的无尘无菌的超净空气层流，即所谓“高效的特殊空气”，它除去了大于0.3μm的尘埃、真菌和细菌孢子等等。超净空气的流速为24～30m/min，已足够防止附近空气可能袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯或本生灯对器械等的灼烧消毒。工作人员就在这样的无菌条件下操作，保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。 

基础培养液：DMEM低糖培养液(含20％胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)；胎牛血清(四季青)；0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA溶液；DMSO(Dimethyl sulfoxide：二甲基砜)溶液；PBS溶液(磷酸盐缓冲溶液)；一次性吸管；眼科剪刀；眼科镊子；细玻棒；50ml培养瓶；3.5cm培养皿。 

2.1原代成纤维细胞培养(组织块贴壁法) 

2.1.1在超净工作台无菌条件下，将皮肤标本移入3.5cm培养皿中，用1ml基础培养液冲洗皮肤标本3次，用眼科剪刀修剪皮肤标本，去除皮下组织、脂肪，尽可能剪到皮肤真皮层。 

2.1.2用剪刀剪切皮肤标本成1mm³小块，小块皮肤标本的真皮层紧贴培养瓶底部置 于50ml培养瓶中(可用弯细玻棒移小块皮肤标本到培养瓶中)并使其均匀分布(小块皮肤标本之间的间距0.3～0.5cm间隔放置)。 

2.1.3轻轻翻转，瓶底朝上，加入基础培养液2ml并保持基础培养液与小块皮肤标本不接触，拧紧瓶塞，将培养瓶倒置于37℃，5％CO₂培养箱中。 

2.1.4 1h后缓慢将培养瓶翻转让基础培养液慢慢覆盖附于瓶底上的小块皮肤标本，再倒置培养。 

2.1.5 2h后正放培养瓶，使基础培养液与小块皮肤标本接触。 

2.1.6每3～5天更换基础培养液(2ml/次)一次。14天左右可以长出细胞，当成纤维细胞大量繁殖：单层成纤维细胞相互融合，出现密集的细胞集落或成纤维细胞基本上铺满瓶底(融合率达70-80％)时可以传代。从成纤维细胞长出到可以传代一般需要培养4～6个星期。 

2.2成纤维细胞传代： 

2.2.1吸弃旧培养液，加入2ml PBS溶液，轻轻清洗细胞后吸弃PBS溶液，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA溶液1ml，将培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱中消化5min； 

2.2.2以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，立即加入5ml基础培养液终止消化； 

2.2.3用一次性吸管吸取培养瓶内的培养液，反复吹打，使已经消化的细胞脱离瓶底壁； 

2.2.4收集带有细胞的含酶溶液于离心管，离心1000r/min转速转6min，吸弃上清； 

2.2.5用1ml基础培养液将细胞沉淀重新悬浮，轻轻吹打均匀后再加入5ml基础培养液吹打均匀，将细胞分装于3个新的50ml培养瓶内，每瓶2ml； 

2.2.6将培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，使原代成纤维细胞分化为成纤维细胞并大量增殖； 

2.2.7一般3天左右可以再次传代，即如果需要的话可重复2.2.1～2.2.6步骤，一瓶可传3瓶。 

2.3成纤维细胞冻存(2.3成纤维细胞冻存步骤和2.4成纤维细胞解冻步骤可以在2.1原代成纤维细胞培养步骤后也可以在2.2成纤维细胞传代步骤后进行)： 

当成纤维细胞大量繁殖：单层成纤维细胞相互融合，出现密集的细胞集落或成纤维细胞基本上铺满瓶底(融合率达70-80％)时可以冻存。 

配制冻存液：50％胎牛血清，10％DMSO溶液，40％基础培养液，三种成分按比例混匀后置于4℃冰箱冷藏。 

2.3.1吸弃培养瓶内旧培养液，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA溶液2ml，于37℃，5％CO₂条件下消化3～5min； 

2.3.2以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入加基础培养液终止消化； 

2.3.3用一次性吸管吸取培养瓶内的基础培养液，反复吹打培养皿底壁，使已经消化的细胞脱离瓶底壁； 

2.3.4收集带细胞培养液，离心1000r/min转速转6min，除去上清； 

2.3.5加3～5ml基础培养液重悬细胞，离心1000r/min转速转6min，除去上清溶液； 

2.3.6加1ml冻存液重悬并吹匀细胞，并将细胞转移至冻存管，盖紧密封后，用卫生纸将冻存管层层封包(约15层左右)； 

2.3.7将用卫生纸包裹的冻存管储存到4℃冰箱，2小时后转移到-20℃冰箱，再2小时后转移到-80℃冰箱冻存。 

2.4成纤维细胞解冻： 

2.4.1将含成纤维细胞的冻存管从-80℃冰箱中取出，直接置于37℃水浴中约20分钟解冻； 

2.4.2解冻后将冻存管离心1000r/min转速转6min，除去上清； 

2.4.3加基础培养液2ml重悬细胞，离心1000r/min转速转6min，除去上清； 

2.4.4加基础培养液1ml重悬细胞并吹打均匀，再加基础培养液1ml并吹匀细胞，将细胞转入50ml培养瓶培养； 

2.4.5 37℃，5％CO₂培养箱中培养，每3～5天更换基础培养液(2ml/次)一次； 

2.4.6如果需要的话可继续成纤维细胞传代，即转至2.2成纤维细胞传代步骤。 

本发明实施过程如下： 

首先进行皮肤取材： 

(1)局部麻醉 

常规PVP-I溶液消毒，铺巾后用2％利多卡因针1ml于耳后取皮部位局部皮下注射。 

(2)耳后取皮 

耳后切取约0.8×0.3cm大小梭形皮肤(包括表皮，真皮，以及少量皮下组织)。 

(3)封存、运输至实验室。 

将获取的皮肤组织至于无菌器皿运输至实验室，然后采用本发明实施例的方法进行自体组织成纤维细胞培养； 

最后进行注射： 

(1)皮试，(2)局部麻醉或全身麻醉，(3)使用专用注射器注射，选用4～10代的细胞进行移植。 

注射细胞的数量根据需注射的面积而定。每毫升含约1-2千万个自体成纤维细胞的悬浮液，2-5ml每次，真皮内注射，一个疗程注射3次，每次间隔2周。本发明实施范围：娇嫩肌肤、润唇、祛除凹陷性疤痕，治疗颈纹、妊娠纹、眉间纹、眼周纹、鼻唇沟、鼻背纹、口周纹、鱼尾纹等。 

试验表明，自体细胞注射后1、2、4、6月的组织填充效果分别约57％、79.6％、77.1％、81.6％。突出的特点是随着时间推移，组织填充效果增加，普通充填剂的填充效果随着时间推移递减。 

本发明实施例回植的成纤维前体细胞来源于自体，安全性非常高，不会出现排异反应。通过自体的成纤维前体细胞的体外培养、扩增，首先从数量上得到满足，而且回植后易于成活，能迅速分泌胶原蛋白，由于机体代谢功能的调节作用，并不会出现胶原蛋白过度增生的现象，因此除皱的效果十分自然。自体成纤维细胞美容术不仅可以治疗各个部位已经形成的皱纹、凹坑，对没有进入衰老的肌肤，也有很好的娇嫩肌肤作用。最重要的特点是完全不留痕迹，使用以后，细胞适应母体需要一个周期，之后逐渐显效，潜移默化地使肌肤质地得到改善。还可以建立“自体细胞库”，不论是为美容或者作为创伤治疗，冻存细胞都可以实现。该技术的几大特点在国内整形美容界具有唯一性，是目前市场上最有效祛除皱纹、疤痕的手段。并且在绝对安全的前提之下，把全面娇嫩肌肤、改善肤质的技术提高到一个新的境界。 

Claims (6)

1.一种自体组织成纤维细胞培养方法，其特征在于依次进行皮肤标本处理步骤和成纤维细胞培养步骤，所述皮肤标本处理步骤包括：

无菌条件下切取的皮肤标本，立即放入装有基础培养液的离心管中封存并运输至实验室，置于4℃冰箱中，24小时内处理皮肤标本，所述基础培养液采用DMEM低糖培养液，含重量百分比为20％的胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100单位/毫升链霉素；

所述成纤维细胞培养步骤包括原代成纤维细胞培养步骤，所述原代成纤维细胞培养步骤包括：

在超净工作台无菌条件下将皮肤标本移入3.5cm培养皿中，用基础培养液冲洗，修剪皮肤标本并去除皮下组织、脂肪，剪切皮肤标本成1mm³小块，置小块皮肤标本于50ml培养瓶并使真皮层紧贴培养瓶底部并均匀分布，翻转培养瓶使得瓶底朝上，加入基础培养液2ml并保持基础培养液与小块皮肤标本不接触，拧紧瓶塞，将培养瓶倒置于37℃，5％CO₂培养箱中，1小时后缓慢将培养瓶翻转让基础培养液慢慢覆盖附于瓶底上的小块皮肤标本，再倒置培养，2小时后正放培养瓶，使基础培养液与小块皮肤标本接触，每3～5天更换基础培养液一次，每次2ml，使得成纤维细胞大量繁殖。

2.根据权利要求1所述的自体组织成纤维细胞培养方法，其特征在于：所述成纤维细胞培养步骤在原代成纤维细胞培养步骤后还设有成纤维细胞传代步骤，所述成纤维细胞传代步骤包括：

吸弃旧培养液，加入2mlPBS溶液，轻轻清洗细胞后吸弃PBS溶液，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA溶液1ml，将培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱中消化5分钟；

以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，立即加入5ml基础培养液终止消化；

吸取培养瓶内的培养液，反复吹打，使已经消化的细胞脱离瓶底壁；

收集带有细胞的含胰蛋白酶溶液于离心管，离心以1000转/分钟的转速转6分钟，吸弃上清；

用1ml基础培养液将细胞沉淀重新悬浮，轻轻吹打均匀后再加入5ml基础培养液吹打均匀，将细胞分装于3个新的50ml培养瓶内，每瓶2ml；

将培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，使原代成纤维细胞分化为成纤维细胞并大量增殖。

3.根据权利要求2所述的自体组织成纤维细胞培养方法，其特征在于：所述成纤维细胞传代步骤重复进行，使得成纤维细胞大量增殖。 

4.根据权利要求1～3任一权利要求所述的自体组织成纤维细胞培养方法，其特征在于：所述成纤维细胞培养步骤在原代成纤维细胞培养步骤后或者成纤维细胞传代步骤后还设置有成纤维细胞冻存步骤，所述成纤维细胞冻存步骤包括：

吸弃培养瓶内旧培养液，加入0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA溶液2ml，于37℃，5％C0₂条件下消化3～5分钟；

以细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度，吸去消化液，立即加入基础培养液终止消化；

吸取培养瓶内的基础培养液，反复吹打培养皿底壁，使已经消化的细胞脱离瓶底壁；

收集带细胞培养液，离心以1000转/分钟的转速转6分钟，除去上清；

加3～5ml基础培养液重悬细胞，离心以1000转/分钟的转速转6分钟，除去上清溶液；

加1ml冻存液重悬并吹匀细胞，并将细胞转移至冻存管，盖紧密封后，将冻存管封包，所述冻存液包括重量百分比为50％的胎牛血清、10％的DMSO溶液、40％的基础培养液；

将冻存管储存到4℃冰箱，2小时后转移到-20℃冰箱，再2小时后转移到-80℃冰箱冻存。

5.根据权利要求4所述的自体组织成纤维细胞培养方法，其特征在于：所述成纤维细胞培养步骤在成纤维细胞冻存步骤后还设置有成纤维细胞解冻步骤，所述成纤维细胞解冻步骤包括：

将含成纤维细胞的冻存管从-80℃冰箱中取出，直接置于37℃水浴中解冻；

解冻后将冻存管离心以1000转/分钟的转速转6分钟，除去上清；

加基础培养液2ml重悬细胞，离心以1000转/分钟的转速转6分钟，除去上清；

加基础培养液1ml重悬细胞并吹打均匀，再加基础培养液1ml并吹匀细胞，将细胞转入50ml培养瓶培养；

在37℃，5％CO₂培养箱中培养，每3～5天更换基础培养液一次，每次2ml。

6.根据权利要求1～3任一权利要求所述的自体组织成纤维细胞培养方法，其特征在于：所述超净工作台超净空气的流速为24～30米/分钟。 

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