NO161413B - Dyrefor som foruten vanlige forstoffer inneholder vekstfremmende midler. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår dyrefor som foruten vanlige forstoffer inneholder vekstfremmende midler for administrasjon til husdyr, hvilket er kjennetegnet ved at det som vekstfremmende middel inneholder 0,01 til 100 deler pr. million deler av dyreforet av minst én av forbindelsene

Det vil forståes av fagfolk at ovenstående forbindelser har ett eller flere asymmetriske centra og kan foreligge som adskillbare optiske isomerer eller som like blandinger av optiske isomerer som vil være optisk inaktive racemiske blandinger. De foregående strukturer er angitt i planform, men alle mulige optiske isomerer som inneholdes deri, er

ment å være innbefattet.

En fagmann ville også være kjent med at separerte optiske isomerer ofte kan ha forskjellige aktiviteter.

Som et eksempel på dette vil det sees at forbindelse IV har to assymmetriske sentra; det første og det tredje carbonatom til høyre for pyridinringen har henholdsvis en hydroxy- og en methylsubstituent. Dette vil føre til fire mulige optiske isomerer når hydroxyl eller methyl er indi-viduelt enten over ((3)- eller under (a)-planet av molekylet. Spesielt isomeren hvor både hydroxyl og methyl er (3 (som

mer eksakt betegnes som a-R, lR-f orbindelsen), har vist seg å være betraktelig mer aktiv enn de mest aktive av de andre isomerer.

Det er behov i dyrestell for metoder for å forbedre utnyttelsen av for. Det er viktig ikke bare at veksten av dyrene fremmes, men at utnyttelsen av foret dirigeres på en bestemt måte, nemlig for å danne mindre fett og mer protein. Noen forbindelser har vært beskrevet som øker utnyttelsen av for og forandrer kroppssammensetningen i noen arter av buskap. Baker et al. har beskrevet (Fed. Proe. 42 nr. 4, s. 816, nr. 3 s. 668) at en forbindelse kalt clenbuterol virker på denne måte. Skjønt imidlertid dette kan være det beste av slike midler publisert i faglitteraturen, er clenbuterol ikke så aktivt som andre forbindelser i fjærkre, sauer eller svin, særlig sammenlignet med forbindelsene anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse.

Man har funnet at forbindelsene angitt i tabell A er meget aktive for å fremme utnyttelsen av for for.husdyr, beregnet på inntak for mennesker. De gir mer vekst og bedre utnyttelse av foret under dannelse av mer protein og mindre fett. Som det vil sees i tabell A skiller de involverte forbindelser seg vidt i kjemisk struktur. De skiller seg også drastisk fra clenbuterol. Mens noen av de aktive forbindelser angitt i tabell A er angitt å ha |3-adrenergisk aktivitet,

er mange forbindelser angitt å være p-adrenergiske agonister med meget liten eller ingen vekstfremmende aktivitet. Nøyak-tig forutsigelse av vekstfremmende aktivitet på basis av

kjemisk struktur eller f3-adrenergisk aktivitet er således ikke mulig.

Særlig foretrukne er de tre forbindelser angitt i tabell A som I, IV, V og IX. Alle disse har høy aktivitet i alle arter som er av betydning. Alle disse forbindelser i tabell A øker imidlertid forutnyttelsen i noen arter ved å fremme vekst og danne mer protein og mindre fett ved samme forinntak. Spesielt gjør det høye aktivitetsnivå av forbindelse V, bitolterol, forenet med dets meget lave toksisitetsnivå, den til et meget foretrukket vekstfremmende middel.

Eksempel 1

In vitro undersøkelse

Fettvevoppsamling og fremstilling

Fett ble oppsamlet fra nylig avlivede dyr som følger: epididymalt og perirenalt fett fra 150 til 200 g hanrotter; perirenalt fett fra 20 til 25 kg kastrerte lam, og perirenalt og omentalt fett fra 35 til 50 kg gylter. Straks etter oppsamling ble fettet anbragt i et silikonisert beger (alle glassvarer var silikonisert) inneholdende Krebs-Ringer-bi-carbonatoppløsning (KRB; PH 7,4) ved 37°C. Fettet ble over-ført til et rent beger og finhakket med sakser. Finhakket fett ble så anvendt som sådant (helt fettpreparat) eller behandlet med collagenase (isolerte fettpreparater).

Isolering av fettpreparater

Opphakket fett ble anbragt i en ryster inneholdende 70 ml celledispersjonsmedium (CDM; 5 mM glucose, 0,1% collagenase, 4% kveg-serumalbumin (BSA), i KRB) og inkubert ved 37 C i 1 time under forsiktig omrysting. Fett ble så filtrert for å fjerne klumper og vasket 4 ganger med vaskemedium (WM; 2,5 mM glucose, 1% BSA, i KRB) og 1 gang med endelig suspen-sjonsmedium (FSM; 2,5 mM glucose, 2% i det vesentlige fett-fri BSA, i KRB). Isolerte fettpreparater ble så resuspendert i den nødvendige mengde FSM (1 ml/kolbe, 3 kolber/behandling).

Bestemmelse av lipolytisk aktivitet i fettvev eller adi-

pocyter

Helt fettvev fra rotter (0,3 ml) eller isolerte adipocyter fra sauer eller svin (1 ml) ble anbragt i scintillasjons-rør av plast inneholdende FSM (henholdsvis 1,7 eller 1 ml)

og prøveforbindelser, og inkubert ved 37°C i 2 timer. Forbindelsene ble undersøkt ved konsentrasjoner på 0,01, 0,05,

0,25 og 1,25 uM. Isoproterenol, ved de samme konsentrasjoner,

ble anvendt som en positiv kontroll. Etter inkubering ble mediet fjernet og bestemt med hensyn til glycerol ved en fluorometrisk modifikasjon av metoden til Wieland (1974. Glycerol UV-metoden, s. 1404. I: Bergmeyer (Utg.) Methods

of Enzymatic Analysis. Verlag Chemie Weinham, Academic Press, New York).

Bestemmelse av anti- lipogen aktivitet i hepatocyter

Hepatocyter ble isolert fra kyllinglever under anvendelse av fremgangsmåten for adipocyter og inkubert i 2

timer ved 37 o C i nærvær av <14>C acetat og forsøksforbindelsene. Forbindelsene ble behandlet ved konsentrasjoner på 0,01, 0,05, 0,25 og 1,25 uM. Isoproterenol ved de samme konsentrasjoner ble anvendt som en positiv kontroll. Etter inkubering ble 8 ml Doles reagens (isopropanol:hexan:H2S04, 40:10:1) til-

satt og inkuberingsprøveglassene ble rystet ved værelsetem-peratur i 30 minutter. Prøveglassinnholdene ble helt i 50

ml rør med skruekork. Rørene ble så renset med 6 ml hexan som ble helt inn i et passende 50 ml rør. Rørene ble rystet for hånd, 10 ml H20 ble tilsatt, og rørene ble rystet igjen. Etter faseseparasjon ble 2 ml av den øvre (hexan) fase overført til scintillasjonsrør. Hexan ble fordampet med en forsiktig luftstrøm og de gjenværende væsker ble resuspendert

14

i 10 ml Scinti Verse II. C ble tellet i en Packard væske

14 scintillasjonsteller. Data er angitt som CPM av C-acetat inkorporert i totale lipider.

Resultater av in vitro testing

Alle ni forbindelser angitt i tabell A hadde betraktelig antilipogen aktivitet. De tre forbindelser identifisert som I, IV og IX viser seg å ha fem ganger den antilipogene aktivitet av isoproterenol og 125 ganger den antilipogene aktivitet av clenbuterol i kyllinghepatocyter. De ni forbindelser ble undersøkt med hensyn til lipolytisk aktivitet i isolerte svin- (tabell C) og ovin-(tabell D)-adipocyter. Alle ni forbindelser stimulerte lipolyse betraktelig i isolerte svin- eller ovin-adipocyter. Åtte av de ni forbindelser var betraktelig mer aktive enn clenbuterol til å stimulere lipolyse i isolerte adipocyter. Mangelen på aktivitet hos clenbuterol i svineadipocyter bør merkes spesielt.

Forbindelsene ble også undersøkt (tabell E) med hensyn til lipolytisk aktivitet under anvendelse av opphakket fettvev fra rotter, og alle ni forbindelser ble funnet å være aktive. Skjønt rotter ikke er en måltype for prod-uktet, er de en god modell for undersøkelse in vivo.

Eksempel 2

In vivo undersøkelse

80 intakte, Charles Rivers CD hanrotter, 75 - 90 g, ble innestengt og holdt på rottemat og vann ad libitum. Etter fire dagers akklimatisering ble ti rottegrupper av tilfeldig vekt underkastet behandling og isolering. Forbindelser som skulle prøves ble forblandet og tilsatt til vekstrotteforet under anvendelse av doser svarende til 20 ppm clenbuterol på en molekylær vektbasis. Det var tidligere blitt bestemt at 10 ppm clenbuterol var den minimale dose som var nødvendig for å gi maksimale forbedringer i vekt og foroverføring. Der-for skulle resultatene av en hvilken som helst forbindelse som ble undersøkt bevirke responser i likhet med clenbuterol hvis forbindelsen har halvparten eller mer av aktiviteten til clenbuterol. Resultatene er oppsummert i tabell F og viser at alle ni forbindelser angitt i tabell A er i stand til å forbedre hastigheten av vektøkning og foroverføring og overføring av kroppssammensetningen av voksende dyr fra fett til protein.

Eksempel 3

Forbindelse V (bitolterol) ble sammenlignet med clenbuterol for virkninger på vekst, foroverføring og kroppssammensetning av broilere oppdrettet i gulvbinger i 7 uker. Bitolterol i mengder på 0,5, 1,0 og 2,0 ppm i dietten forbedret vekstøkningen, foroverføringen og skrott-proteininnholdet på en doseavhengig måte. Bitolterol i den høyeste dose forbedret vektøkningen 2,6% (P 0,01), for-overføring 3,8% (P 0,05) og kroppsproteinet 4,9% (P 0,10). De sistnevnte responser var bedre enn dem som ble iakttatt med clenbuterol ved 0,5 ppm. Bitolterol i disse doser reduserte ikke kroppsfettet.

Clenbuterol ved 0,5 ppm i dietten ble administrert i

7 uker til en gruppe og bare i de siste 4 uker til en annen gruppe. Administrasjon av clenbuterol i 7 uker var litt mere effektiv for forbedring av fSroverføring og kropps-protein enn clenbuterol i 4 uker. Clenbuterol gitt i 7 uker forbedrer f6roverføringen 3,5% (P 0,05) og synes å forbedre (ikke betraktelig) økningshastigheten 0,4%, kropps-vekten 0,7% og kroppsproteinet 4,0% og å nedsette (ikke betraktelig) kroppsfettet 7,1%.

Anvendelse

F6rstoffet ifølge oppfinnelsen er beregnet på å øke hastigheten av kroppsvektøkningen og/eller foreffektiviteten og å nedsette kroppsfettet og øke kroppsproteinet hos husdyr som kveg, sauer, fjærkre, griser, etc.

Claims (2)

1. DyrefSr som foruten vanlige f6rstoffer inneholder vekstfremmende midler for administrasjon til husdyr, karakterisert ved at det som vekstfremmende middel inneholder 0,01 til 100 deler pr. million deler av dyreforet av minst én av forbindelsene

2. Dyrefor ifølge krav 1, karakterisert ved at det inneholder minst én av forbindelsene I, IV, V eller IX.