CN104910569A - 一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶及其制备方法，用胱胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯依次改性透明质酸，得甲基丙烯酰化透明质酸，再经光化学聚合得到透明质酸水凝胶；透明质酸水凝胶经冻干后浸渍单体Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸、交联剂N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂的混合溶液，二次光化学聚合后得到透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶。该双网络水凝胶具有相互贯穿的微观结构、机械强度高、可被生物还原等特点，其力学、溶胀、降解性等可灵活调控。该方法具有原料经济性好、工艺简单、反应时间短、所得凝胶结构稳定强度高等优点，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶及其制备方法。
背景技术
与体内三维环境中的细胞相比，利用传统培养板进行二维培养的肿瘤细胞，在细胞形态、生长增殖、基因表达、对外源信号应答等方面均有所变化，难以客观、真实的反映体内细胞的生长行为和功能。究其原因主要是，二维培养环境无法准确为细胞提供体内细胞所处的三维微环境，无法完全重现体内细胞/细胞间和细胞/基质间的相互作用，造成两种环境下培养细胞生长行为和功能的明显差异。因此，为更大程度地模拟肿瘤细胞体内环境，利用水凝胶和多孔支架材料实现肿瘤细胞的三维培养，在体外构建肿瘤三维模型，有望更准确地模仿体内肿瘤细胞生物学行为、揭示肿瘤发生发展机制以及评价肿瘤药物疗效等。目前，三维细胞培养正逐渐成为抗肿瘤治疗研究的主要技术手段。相对于刚性较大的聚酯类生物材料制备的泡孔状和纤维状结构支架，水凝胶在构建软组织肿瘤模型中更具优势，主要体现在能原位包埋细胞、模量调节范围大、孔径适合、透光性好、可无损害或最小损害方式注射至体内等，可始终维持细胞/细胞间和细胞/基质间良好的接触，是真正意义上的三维培养[Seliktar D.Designing cell-compatiblehydrogels for biomedical applications.Science,2012,336:1124-1128]。
透明质酸是人体细胞外基质的主要成分之一，由其形成的水凝胶具有优异的生物相容性、高吸水性、可生物降解性等性能，微观结构和理化性质与细胞外基质高度相似，可为细胞提供理想的三维生长环境，近年来在生物医用材料领域受到广泛关注。已有研究表明，透明质酸水凝胶能够支持细胞生长，维持细胞正常表型、活性、增殖、迁移和分化等行为，并且这些生长行为与水凝胶微观结构和力学性能密切相关[Lawyer T,Mcintosh K,Clavijo C,et a1.Formulation changes affect material properties and cell behavior in HA-based hydrogels.International Journal Cell Biology,2012,2012:Article ID737421,pp1-9]。水凝胶黏弹性行为反映其强度大小和内部结构稳定性好坏，决定水凝胶能否为细胞生长提供一个理想的微环境，并对细胞生长行为具有重要影响。然而，单纯的透明质酸水凝胶存在如下不足，如力学性能差、体内降解速度过快等，难以满足细胞三维培养的性能要求。因此，利用其他材料复合改性透明质酸水凝胶就成为研究的重点，如利用硫酸软骨素或壳聚糖改性透明质酸制备的复合水凝胶，可显著改善力学性能和降低降解速度等[Ni YL,Tang ZR,Cao WX,et al.Tough and elastic hydrogelof hyaluronic acid and chondroitin sulfate as potential cell scaffold materials.International Journal ofBiological Macromolecules,2015,74:367-375；Kaderli S,Boulocher C,Pillet E,et al.A novelbiocompatible hyaluronic acid-chitosan hybrid hydrogel for osteoarthrosis therapy.InternationalJournal of Pharmaceutics,2015,483:158-168]。赖氨酸是人体必需氨基酸之一，为碱性氨基酸，能够促进细胞的粘附和生长。近几年，以赖氨酸及其衍生物为原料合成的多肽材料和侧链为赖氨酸的聚合物材料，在生物医学领域受到关注[Johnson NR,Ambe T,Wang YD.Lysine-basedpolycation:heparin coacervate for controlled protein delivery.Acta Biomaterialia,2014,10:40-46；Lyu SRy,Kuo YC,Ku HF,et al.Cryopreserved chondrocytes in porous biomaterials with surfaceelastin and poly-l-lysine for cartilage regeneration.Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2013,103:304-309]。其中，制备含赖氨酸或其衍生物的水凝胶是一个比较有前景的发展方向，但这类水凝胶脆性大、易破碎。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶及其制备方法。该方法以甲基丙烯酰化透明质酸和Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸为基本原料，采用两步光化学聚合方法制备出透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶，制得的水凝胶具有可生物还原、强度高、生物相容性优异等特点，具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备：
配制透明质酸水溶液，再向其中依次加入用量为透明质酸重复单元摩尔数0.24～0.72倍的N-羟基琥珀酰亚胺、2～10倍的胱胺和0.2～0.6倍的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，然后将pH值调至5.0～5.5，在室温下搅拌反应24～60小时；反应结束后，反应体系依次经透析和冷冻干燥，得到胱胺改性的透明质酸；
配制胱胺改性的透明质酸水溶液，再向其中加入用量为透明质酸重复单元摩尔数0.1～0.4倍的甲基丙烯酸缩水甘油酯，然后将pH值调至8.0，在65℃～85℃下搅拌反应3～8小时，反应结束后，反应体系依次经透析和冷冻干燥，得到甲基丙烯酰化透明质酸；
2)透明质酸水凝胶的制备：
配制甲基丙烯酰化透明质酸水溶液，再向其中加入甲基丙烯酰化透明质酸质量0.2％～1％的水溶性光引发剂，混合均匀后实施光化学聚合，得到透明质酸水凝胶，经冷冻干燥后备用；
3)透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶制备：
按质量比为(100～200)：(5～20)：1配制Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂的混合溶液，用混合溶液浸渍步骤2)得到的冻干的透明质酸水凝胶，形成透明体系后实施光化学聚合，得到透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶。
所述步骤1)中配制的透明质酸水溶液的质量百分浓度为0.2％～2％，透明质酸的分子量为300～1000kDa；配制的胱胺改性的透明质酸水溶液的质量百分浓度为0.2％～2％；
所述步骤2)中配制的甲基丙烯酰化透明质酸水溶液的质量百分浓度为1％～3.5％。
所述步骤1)中用NaOH溶液和盐酸调节pH值；
所述步骤1)中的透析是用去离子水透析3天，透析用的透析袋的截留分子量为3.5kDa。
所述步骤1)和步骤2)中的冷冻干燥是先在零下40℃～零下5℃保持36～96小时，再在20℃保持4小时。
所述的水溶性光引发剂为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-氧化戊二酸或1-羟基环己基苯基丙酮。
所述步骤2)和步骤3)中的光化学聚合的时间为30s～10min，光化学聚合所用的光源的中心波长为365nm、光能量密度为1200mJ/cm2～1500mJ/cm2，光源与样品的距离为5～20cm。
所述步骤3)中浸渍用的混合溶液的体积等于冻干的透明质酸水凝胶的体积，混合溶液中Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸的浓度为0.2g/mL。
所述的Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸的合成方法如下：
a)将浓度为0.05g/mL～0.5g/mL的L-赖氨酸水溶液置于烧瓶中，向其中加入L-赖氨酸摩尔量0.55～0.75倍的碱式碳酸铜，煮沸2～5小时后热过滤，用NaOH溶液调节滤液的pH值至9.0；
b)对步骤a)得到的滤液进行冰浴冷却，然后向其中滴加L-赖氨酸摩尔量1.05～1.2倍的丙烯酰氯溶液，滴加过程中用NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持1～4小时，然后过滤收集蓝色固体，蓝色固体经水洗后再在45℃下真空干燥；
c)将步骤b)得到的干燥的蓝色固体悬浮于去离子水中，形成浓度为0.05g/mL～5g/mL的悬浮液，将蓝色固体摩尔量2.2～4.0倍的8-羟基喹啉溶于悬浮液体积0.5～1.5倍的氯仿中，得到氯仿溶液，将氯仿溶液加入悬浮液中室温搅拌24小时，过滤后水相用氯仿洗至无色后冻干，得到Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸。
所述的N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸的合成方法如下：
A)将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.05g/mL～0.5g/mL的L-胱氨酸溶液，其中NaOH与L-胱氨酸的摩尔比为2：1；
B)对L-胱氨酸溶液进行冰浴冷却，然后向其中滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，其中丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为(2.1～2.3)：1，滴加过程中用NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持1～4小时，再在零下20℃进行冷冻干燥；
C)将步骤B)冷冻干燥得到的物质溶于pH＝2的水中，得到质量百分浓度为5％～20％的溶液，然后用6～12倍体积量的丙酮沉淀，所得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。
制得的可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶具有微米级的多孔结构，其在10％～20％的应变范围内的压缩模量为46.3kPa，在24小时达到溶胀平衡，最大溶胀比为12。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供的可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的制备方法，以甲基丙烯酰化透明质酸和Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸为基本原料，采用两步光化学聚合方法制备出可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶。具体的，先用胱胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯依次改性透明质酸，得甲基丙烯酰化透明质酸，再经光化学聚合得到透明质酸水凝胶；透明质酸水凝胶经冷冻干燥后浸渍单体Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸、交联剂N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂的混合溶液，二次光化学聚合后得到透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶。该双网络水凝胶的形成机制为光化学聚合，具有原料经济性好、条件温和(室温进行)、反应速度快(数分钟内完成)、反应时间短、工艺简单等优点。并可通过调节透明质酸分子量、交联密度、双网络成分含量比例、反应浓度等参数，实现对双网络水凝胶的力学性能(如强度、模量)、降解速率和溶胀性能的调控。另外，该双网络水凝胶的制备原料为透明质酸和赖氨酸衍生物，具有原料易得、生物相容性优异的特点，尤其是阳离子型赖氨酸衍生物聚合物成分，可促进细胞粘附和生长。
本发明制得的可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶具有相互贯穿的微观结构及微米级的多孔结构，该双网络水凝胶由两种三维交联网络构成，兼具透明质酸三维网络的高弹性和高韧性与聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)三维网络的高强度和高模量，综合力学性能和结构稳定性优异。且双网络水凝胶的两种三维网络中的网链中均含有二硫键，可被生物还原性物质如谷胱甘肽还原而使网链断裂，实现整个水凝胶的快速解离，也可通过透明质酸酶等实现生物降解，降解产物无毒且可被人体吸收或排除体外。本发明制得的双网络水凝胶具有可生物还原、结构稳定、机械强度高、生物相容性优异等特点，其力学、溶胀、降解性等可灵活调控。其在10％～20％的应变范围内的压缩模量为46.3kPa，在24小时达到溶胀平衡，最大溶胀比为12，可在体外建立三维肿瘤模型、细胞递送、组织工程、体内注射和移植等方面得到广泛应用。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的透明质酸水凝胶和透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的流变学性能对比图。
图2为本发明实施例2制备的透明质酸水凝胶和透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的压缩应力-应变关系图。
图3为本发明实施例3制备的透明质酸水凝胶和透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的溶胀性能对比图。
图4中的A、B分别为本发明实施例4制备的透明质酸水凝胶和透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的扫描电子显微镜照片对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不限于此。
实施例1
一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的其制备方法，包括如下步骤：
1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备：
首先配制质量百分浓度为1％、分子量为1000kDa的透明质酸水溶液，接着依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、胱胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其用量分别为透明质酸重复单元摩尔数的0.7、4和0.6倍；然后，利用浓度为1mol/L的NaOH溶液和盐酸将pH值调至5.2，在室温下搅拌反应36小时；反应结束后，反应体系用去离子水透析(所用透析袋的截留分子量为3.5kDa，以下相同)3天，经冷冻干燥(先在零下20℃保持48小时、再在20℃保持4小时)得到胱胺改性的透明质酸；
接下来，配制质量百分浓度为1％的胱胺改性的透明质酸水溶液，随后加入透明质酸重复单元摩尔数0.2倍的甲基丙烯酸缩水甘油酯，用浓度为1mol/L的NaOH溶液将pH值调至8.0，在70℃下磁力搅拌反应6小时，再经去离子水透析3天；最后，对透析后的产物溶液进行冷冻干燥(先在零下5℃保持48小时、再在20℃保持4小时)，得到甲基丙烯酰化透明质酸。
2)透明质酸水凝胶的制备：
将步骤1)制备的甲基丙烯酰化透明质酸溶于去离子水，得到质量百分浓度为3.5％的溶液，加入甲基丙烯酰化透明质酸质量0.8％的水溶性光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，混合均匀后再实施光化学聚合5分钟，制得透明质酸水凝胶，经冷冻干燥(先在零下20℃保持60小时、再在20℃保持4小时)备用。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1200mJ/cm2，光源与样品的距离为15cm。
3)Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸合成方法如下：
将浓度为0.1g/mL的L-赖氨酸水溶液置于250ml烧瓶中，加入L-赖氨酸摩尔量0.55倍的碱式碳酸铜，煮沸3小时后热过滤，滤液pH值用浓度为1mol/L的NaOH溶液调至9.0。将得到的含滤液的烧瓶置于冰浴中1小时，接着滴加L-赖氨酸摩尔量1.1倍的丙烯酰氯溶液，整个过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持2小时，过滤收集蓝色固体，用蒸馏水洗2次后45℃真空干燥。将得到的干燥蓝色固体悬浮于去离子水中，形成浓度为1g/mL的悬浮液，将含2.2倍于蓝色固体物质的量的8-羟基喹啉溶于悬浮液0.5倍体积的氯仿中，得到氯仿溶液，接着将氯仿溶液加入悬浮液中室温搅拌24小时，过滤后水相用氯仿洗至无色后冻干(先在零下10℃保持48小时、再在20℃保持4小时)，得Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸。
4)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸合成方法如下：
将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.05g/mL的溶液，其中NaOH与L-胱氨酸的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.1：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后常温维持反应3小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为5％的溶液，用10倍体积量的丙酮沉淀，所得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。
5)透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶制备：
用Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的混合溶液浸渍步骤2)得到的冻干的透明质酸水凝胶，形成透明体系后实施光化学聚合，时间为4分钟，得到透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶。其中，混合液体积与冻干透明质酸水凝胶相同，混合溶液中Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂的质量比为100：10：1，Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸浓度为0.2g/mL，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1500mJ/cm2，光源与样品的距离为15cm。
图1为实施例1制备的透明质酸水凝胶(由步骤2)得到)和透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶(由步骤5)得到)的流变学性能对比图。由图1可以看出，这两种水凝胶的储能模量都大于损耗模量，说明它们都具有弹性，其中透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的弹性更好；透明质酸水凝胶和透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的损耗模量(G")在各个角频率处差异很小，而透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的储能模量(G')则是透明质酸水凝胶的3倍多，况且它们的模量值不随角频率改变而变化。这些结果说明，透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶比透明质酸水凝胶具有更高的模量和结构稳定性。
实施例2
一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的其制备方法，包括如下步骤：
1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备：
首先配制质量百分浓度为1％、分子量为500kDa的透明质酸水溶液，接着依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、胱胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其用量分别为透明质酸重复单元摩尔数的0.7、4和0.6倍；然后，利用浓度为1mol/L的NaOH溶液和盐酸将pH调至5.3，在室温下搅拌反应36小时；反应结束后，反应体系用去离子水透析(所用透析袋截留分子量为3.5kDa，以下相同)3天，经冷冻干燥(零下40℃保持96小时、20℃保持4小时)得到胱胺改性的透明质酸；
接下来，配制质量百分浓度为1％的胱胺改性的透明质酸水溶液，随后加入透明质酸重复单元摩尔数0.2倍的甲基丙烯酸缩水甘油酯，用浓度为1mol/L的NaOH溶液将pH调至8.0，在75℃下磁力搅拌反应6小时，再经去离子水透析3天；最后，对透析后的产物溶液进行冷冻干燥(零下40℃保持72小时、20℃保持4小时)，得到甲基丙烯酰化透明质酸。
2)透明质酸水凝胶的制备：将步骤1)制备的甲基丙烯酰化透明质酸溶于去离子水，得到质量百分浓度为2.5％的溶液，加入甲基丙烯酰化透明质酸质量1％的水溶性光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，混合均匀后在实施光化学聚合3分钟，制得透明质酸水凝胶，经冷冻干燥(零下40℃保持96小时、20℃保持4小时)备用。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1500mJ/cm2，光源与样品距离为15cm。
3)Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸合成方法如下：
将浓度为0.05g/ml的L-赖氨酸水溶液置于250ml烧瓶中，加入L-赖氨酸摩尔量0.75倍量的碱式碳酸铜，煮沸5小时后热过滤，滤液pH用浓度为1mol/L的NaOH溶液调至9.0。将得到的含滤液的烧瓶置于冰浴中1小时，接着滴加L-赖氨酸摩尔量1.05倍量的丙烯酰氯溶液，整个过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持3小时，过滤收集蓝色固体，用蒸馏水洗2次后45℃真空干燥。将得到的干燥蓝色固体悬浮于去离子水中，形成浓度为2g/ml的悬浮液，将含3.0倍于蓝色固体物质的量的8-羟基喹啉溶于悬浮液1倍体积的氯仿中，接着将氯仿溶液加入悬浮液中室温搅拌24小时，过滤后水相用氯仿洗至无色后冻干(零下5℃保持40小时、20℃保持4小时)，得Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸。
4)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸合成方法如下：
将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.05g/ml的溶液，其中NaOH与L-胱氨酸的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.2：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后常温维持反应2小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为5％的溶液，用12倍体积量的丙酮沉淀，所得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。
5)透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶制备：
用Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的混合溶液浸渍步骤2)得到的冻干的透明质酸水凝胶，混合液体积与冻干透明质酸水凝胶相同，混合溶液中各成分的质量比为100：10：1，Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸浓度为0.2g/ml，形成透明体系后实施光化学聚合，时间为10分钟，得到透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1200mJ/cm2，光源与样品距离为15cm。
图2为实施例2制备的透明质酸水凝胶(由步骤2)制得)和透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶(由步骤5)制得)的压缩应力-应变关系图。由图2中曲线可以看出，透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶具有更好的形状恢复能力；在相同应变时，透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的压缩应力远大于透明质酸水凝胶的压缩应力，在10％～20％应变范围内透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的压缩模量(46.3kPa)约是透明质酸水凝胶的(2.7kPa)15倍。这说明透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶具有更高的压缩模量。
实施例3
一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的其制备方法，包括如下步骤：
1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备：
首先配制质量百分浓度为1.5％、分子量为300kDa的透明质酸水溶液，接着依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、胱胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其用量分别为透明质酸重复单元摩尔数的0.5、5和0.2倍；然后，利用浓度为1mol/L的NaOH溶液和盐酸将pH调至5.1，在室温下搅拌反应24小时；反应结束后，反应体系用去离子水透析(所用透析袋截留分子量为3.5kDa，以下相同)3天，经冷冻干燥(零下20℃保持48小时、20℃保持4小时)得到胱胺改性的透明质酸；
接下来，配制质量百分浓度为1％的胱胺改性的透明质酸水溶液，随后加入透明质酸重复单元摩尔数0.2倍的甲基丙烯酸缩水甘油酯，用浓度为1mol/L的NaOH溶液将pH调至8.0，在80℃下磁力搅拌反应3小时，再经去离子水透析3天；最后，对透析后的产物溶液进行冷冻干燥(零下20℃保持72小时、20℃保持4小时)，得到甲基丙烯酰化透明质酸。
2)透明质酸水凝胶的制备：
将步骤1)制备的甲基丙烯酰化透明质酸溶于去离子水，得到质量百分浓度为1％的溶液，加入甲基丙烯酰化透明质酸质量1％的水溶性光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，混合均匀后在实施光化学聚合2分钟，制得透明质酸水凝胶，经冷冻干燥(零下40℃保持96小时、20℃保持4小时)备用。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1300mJ/cm2，光源与样品距离为15cm。
3)Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸合成方法如下：
将浓度为0.05g/ml的L-赖氨酸水溶液置于250ml烧瓶中，加入L-赖氨酸摩尔量0.55倍的碱式碳酸铜，煮沸2小时后热过滤，滤液pH用浓度为1mol/L的NaOH溶液调至9.0。将得到的含滤液的烧瓶置于冰浴中1小时，接着滴加L-赖氨酸摩尔量1.05倍量的丙烯酰氯溶液，整个过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持1小时，过滤收集蓝色固体，用蒸馏水洗2次后45℃真空干燥。将得到的干燥蓝色固体悬浮于去离子水中，形成浓度为0.05g/ml的悬浮液，将含2.2倍于蓝色固体物质的量的8-羟基喹啉溶于悬浮液0.5倍体积的氯仿中，接着将氯仿溶液加入悬浮液中室温搅拌24小时，过滤后水相用氯仿洗至无色后冻干(零下15℃保持36小时、20℃保持4小时)，得Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸。
4)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸合成方法如下：
将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.25g/ml的溶液，其中NaOH与L-胱氨酸的摩尔比为2：1。将中L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.3：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后常温维持反应4小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为5％的溶液，用12倍体积量的丙酮沉淀，所得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。
5)透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶制备：
用Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的混合溶液浸渍步骤2)得到的冻干的透明质酸水凝胶，混合液体积与冻干透明质酸水凝胶相同，混合溶液中各成分的质量比为100：12：1，Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸浓度为0.2g/ml，形成透明体系后实施光化学聚合，时间为5分钟，得到透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1200mJ/cm2，光源与样品距离为15cm。
图3为实施例3制备的透明质酸水凝胶(由步骤2)制得)和透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶(由步骤5)制得)的溶胀性能对比图。由图3可以看出，在溶胀时间相同时，透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的溶胀比远小于透明质酸水凝胶的溶胀，其中透明质酸水凝胶在144小时达到溶胀平衡，最大溶胀比为126，透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶24小时基本达到溶胀平衡，最大溶胀比为12。这说明透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶胶具有比透明质酸水凝胶更高的交联密度，溶胀性能小于透明质酸水凝胶。
实施例4
一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的其制备方法，包括如下步骤：
1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备：
首先配制质量百分浓度为0.8％、分子量为800kDa的透明质酸水溶液，接着依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、胱胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其用量分别为透明质酸重复单元摩尔数的0.7、4和0.6倍；然后，利用浓度为1mol/L的NaOH溶液和盐酸将pH调至5.25，在室温下搅拌反应36小时；反应结束后，反应体系用去离子水透析(所用透析袋截留分子量为3.5kDa，以下相同)3天，经冷冻干燥(零下20℃保持50小时、20℃保持4小时)得到胱胺改性的透明质酸；
接下来，配制质量百分浓度为2％的胱胺改性的透明质酸水溶液，随后加入透明质酸重复单元摩尔数0.2倍的甲基丙烯酸缩水甘油酯，用浓度为1mol/L的NaOH溶液将pH调至8.0，在70℃下磁力搅拌反应6小时，再经去离子水透析3天；最后，对透析后的产物溶液进行冷冻干燥(零下20℃保持60小时、20℃保持4小时)，得到甲基丙烯酰化透明质酸。
2)透明质酸水凝胶的制备：将步骤1)制备的甲基丙烯酰化透明质酸溶于去离子水，得到质量百分浓度为3.5％的溶液，加入甲基丙烯酰化透明质酸质量1％的水溶性光引发剂2-氧化戊二酸，混合均匀后在实施光化学聚合5分钟，制得透明质酸水凝胶，经冷冻干燥(零下20℃保持55小时、20℃保持4小时)备用。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1200mJ/cm2，光源与样品距离为15cm。
3)Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸合成方法如下：
将浓度为0.5g/ml的L-赖氨酸水溶液置于250ml烧瓶中，加入L-赖氨酸摩尔量0.7倍量的碱式碳酸铜，煮沸5小时后热过滤，滤液pH用浓度为1mol/L的NaOH溶液调至9.0。将得到的含滤液的烧瓶置于冰浴中1小时，接着滴加L-赖氨酸摩尔量1.2倍量的丙烯酰氯溶液，整个过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持4小时，过滤收集蓝色固体，用蒸馏水洗2次后45℃真空干燥。将得到的干燥蓝色固体悬浮于去离子水中，形成浓度为0.05g/ml的悬浮液，将含3倍于蓝色固体物质的量的8-羟基喹啉溶于悬浮液1.1倍体积的氯仿中，接着将氯仿溶液加入悬浮液中室温搅拌24小时，过滤后水相用氯仿洗至无色后冻干(零下40℃保持80小时、20℃保持4小时)，得Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸。
4)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸合成方法如下：
将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.05g/ml的溶液，其中NaOH与L-胱氨酸的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.2：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后常温维持反应3小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为15％的溶液，用8倍体积量的丙酮沉淀，所得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。
5)透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶制备：
用Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂2-氧化戊二酸的混合溶液浸渍步骤2)得到的冻干的透明质酸水凝胶，混合液体积与冻干透明质酸水凝胶相同，混合溶液中各成分的质量比为100：5：1，Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸浓度为0.2g/ml，形成透明体系后实施光化学聚合，时间为5分钟，得到透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1400mJ/cm2，光源与样品距离为15cm。
图4中的A、B分别为实施例4制备的透明质酸水凝胶(由步骤2)制得)和透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶(由步骤5)制得)的扫描电子显微镜照片对比图。由图4可以看出，这两种水凝胶均具有多孔结构，孔径分布范围为几十微米至几百微米，其中透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的孔壁厚度大于透明质酸水凝胶的孔壁厚度。这样透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的孔径大小适合细胞培养，更厚的孔壁利于强度的提高。
实施例5
一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的其制备方法，包括如下步骤：
1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备：
首先配制质量百分浓度为1％分子量为1000kDa的透明质酸水溶液，接着依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、胱胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其用量分别为透明质酸重复单元摩尔数的0.3、2和0.3倍；然后，利用浓度为1mol/L的NaOH溶液和盐酸将pH调至5.0，在室温下搅拌反应55小时；反应结束后，反应体系用去离子水透析(所用透析袋截留分子量为3.5kDa，以下相同)3天，经冷冻干燥(零下10℃保持50小时、20℃保持4小时)得到胱胺改性的透明质酸；
接下来，配制质量百分浓度为0.6％的胱胺改性的透明质酸水溶液，随后加入透明质酸重复单元摩尔数0.15倍的甲基丙烯酸缩水甘油酯，用浓度为1mol/L的NaOH溶液将pH调至8.0，在70℃下磁力搅拌反应5小时，再经去离子水透析3天；最后，对透析后的产物溶液进行冷冻干燥(零下30℃保持86小时、20℃保持4小时)，得到甲基丙烯酰化透明质酸。
2)透明质酸水凝胶的制备：
将步骤1)制备的甲基丙烯酰化透明质酸溶于去离子水，得到质量百分浓度为2.5％的溶液，加入甲基丙烯酰化透明质酸质量0.7％的水溶性光引发剂1-羟基环己基苯基丙酮，混合均匀后在实施光化学聚合5分钟，制得透明质酸水凝胶，经冷冻干燥(零下5℃保持44小时、20℃保持4小时)备用。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1300mJ/cm2，光源与样品距离为15cm。
3)Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸合成方法如下：
将浓度为0.05g/ml的L-赖氨酸水溶液置于250ml烧瓶中，加入L-赖氨酸摩尔量0.75倍量的碱式碳酸铜，煮沸5小时后热过滤，滤液pH用浓度为1mol/L的NaOH溶液调至9.0。将得到的含滤液的烧瓶置于冰浴中1小时，接着滴加L-赖氨酸摩尔量1.2倍量的丙烯酰氯溶液，整个过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持4小时，过滤收集蓝色固体，用蒸馏水洗2次后45℃真空干燥。将得到的干燥蓝色固体悬浮于去离子水中，形成浓度为0.1g/ml的悬浮液，将含2.6倍于蓝色固体物质的量的8-羟基喹啉溶于悬浮液0.5倍体积的氯仿中，接着将氯仿溶液加入悬浮液中室温搅拌24小时，过滤后水相用氯仿洗至无色后冻干(零下40℃保持96小时、20℃保持4小时)，得Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸。
4)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸合成方法如下：
将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.1g/ml的溶液，其中NaOH与L-胱氨酸的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.1：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后常温维持反应2小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为15％的溶液，用12倍体积量的丙酮沉淀，所得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。
5)透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶制备：
用Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂1-羟基环己基苯基丙酮的混合溶液浸渍步骤2)得到的冻干的透明质酸水凝胶，混合液体积与冻干透明质酸水凝胶相同，混合溶液中各成分的质量比为200：20：1，Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸浓度为0.2g/ml，形成透明体系后实施光化学聚合，时间为6分钟，得到透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1250mJ/cm2，光源与样品距离为15cm。
实施例6
一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的其制备方法，包括如下步骤：
1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备：
首先配制质量百分浓度为1.2％、分子量为500kDa的透明质酸水溶液，接着依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、胱胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其用量分别为透明质酸重复单元摩尔数的0.5、5和0.3倍；然后，利用浓度为1mol/L的NaOH溶液和盐酸将pH调至5.5，在室温下搅拌反应60小时；反应结束后，反应体系用去离子水透析(所用透析袋截留分子量为3.5kDa，以下相同)3天，经冷冻干燥(零下40℃保持96小时、20℃保持4小时)得到胱胺改性的透明质酸；
接下来，配制质量百分浓度为0.8％的胱胺改性的透明质酸水溶液，随后加入透明质酸重复单元摩尔数0.3倍的甲基丙烯酸缩水甘油酯，用浓度为1mol/L的NaOH溶液将pH调至8.0，在72℃下磁力搅拌反应7小时，再经去离子水透析3天；最后，对透析后的产物溶液进行冷冻干燥(零下10℃保持40小时、20℃保持4小时)，得到甲基丙烯酰化透明质酸。
2)透明质酸水凝胶的制备：
将步骤1)制备的甲基丙烯酰化透明质酸溶于去离子水，得到质量百分浓度为3.5％的溶液，加入甲基丙烯酰化透明质酸质量0.8％的水溶性光引发剂1-羟基环己基苯基丙酮，混合均匀后在实施光化学聚合3分钟，制得透明质酸水凝胶，经冷冻干燥(零下8℃保持45小时、20℃保持4小时)备用。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1450mJ/cm2，光源与样品距离为15cm。
3)Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸合成方法如下：
将浓度为0.09g/ml的L-赖氨酸水溶液置于250ml烧瓶中，加入L-赖氨酸摩尔量0.62倍量的碱式碳酸铜，煮沸4.5小时后热过滤，滤液pH用浓度为1mol/L的NaOH溶液调至9.0。将得到的含滤液的烧瓶置于冰浴中1小时，接着滴加L-赖氨酸摩尔量1.15倍量的丙烯酰氯溶液，整个过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持1.5小时，过滤收集蓝色固体，用蒸馏水洗2次后45℃真空干燥。将得到的干燥蓝色固体悬浮于去离子水中，形成浓度为0.25g/ml的悬浮液，将含3.1倍于蓝色固体物质的量的8-羟基喹啉溶于悬浮液0.8倍体积的氯仿中，接着将氯仿溶液加入悬浮液中室温搅拌24小时，过滤后水相用氯仿洗至无色后冻干(零下16℃保持72小时、20℃保持4小时)，得Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸。
4)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸合成方法如下：
将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.05g/ml的溶液，其中NaOH与L-胱氨酸的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.3：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后常温维持反应3.5小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为18％的溶液，用7倍体积量的丙酮沉淀，所得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。
5)透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶制备：
用Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂1-羟基环己基苯基丙酮的混合溶液浸渍步骤2)得到的冻干的透明质酸水凝胶，混合液体积与冻干透明质酸水凝胶相同，混合溶液中各成分的质量比为120：7：1，Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸浓度为0.2g/ml，形成透明体系后实施光化学聚合，时间为4.5分钟，得到透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1200mJ/cm2，光源与样品距离为15cm。
实施例7
一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的其制备方法，包括如下步骤：
1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备：
首先配制质量百分浓度为1.8％、分子量为600kDa的透明质酸水溶液，接着依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、胱胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其用量分别为透明质酸重复单元摩尔数的0.62、3.5和0.55倍；然后，利用浓度为1mol/L的NaOH溶液和盐酸将pH调至5.4，在室温下搅拌反应50小时；反应结束后，反应体系用去离子水透析(所用透析袋截留分子量为3.5kDa，以下相同)3天，经冷冻干燥(零下15℃保持80小时、20℃保持4小时)得到胱胺改性的透明质酸；
接下来，配制质量百分浓度为2％的胱胺改性的透明质酸水溶液，随后加入透明质酸重复单元摩尔数0.1倍的甲基丙烯酸缩水甘油酯，用浓度为1mol/L的NaOH溶液将pH调至8.0，在83℃下磁力搅拌反应3小时，再经去离子水透析3天；最后，对透析后的产物溶液进行冷冻干燥(零下20℃保持50小时、20℃保持4小时)，得到甲基丙烯酰化透明质酸。
2)透明质酸水凝胶的制备：
将步骤1)制备的甲基丙烯酰化透明质酸溶于去离子水，得到质量百分浓度为1.5％的溶液，加入甲基丙烯酰化透明质酸质量1％的水溶性光引发剂2-氧化戊二酸，混合均匀后在实施光化学聚合8分钟，制得透明质酸水凝胶，经冷冻干燥(零下10℃保持45小时、20℃保持4小时)备用。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1500mJ/cm2，光源与样品距离为10cm。
3)Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸合成方法如下：
将浓度为0.35g/ml的L-赖氨酸水溶液置于250ml烧瓶中，加入L-赖氨酸摩尔量0.60倍量的碱式碳酸铜，煮沸5小时后热过滤，滤液pH用浓度为1mol/L的NaOH溶液调至9.0。将得到的含滤液的烧瓶置于冰浴中1小时，接着滴加L-赖氨酸摩尔量1.05倍量的丙烯酰氯溶液，整个过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持3.5小时，过滤收集蓝色固体，用蒸馏水洗2次后45℃真空干燥。将得到的干燥蓝色固体悬浮于去离子水中，形成浓度为3g/ml的悬浮液，将含3.2倍于蓝色固体物质的量的8-羟基喹啉溶于悬浮液1倍体积的氯仿中，接着将氯仿溶液加入悬浮液中室温搅拌24小时，过滤后水相用氯仿洗至无色后冻干(零下10℃保持60小时、20℃保持4小时)，得Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸。
4)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸合成方法如下：
将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.15g/ml的溶液，其中NaOH与L-胱氨酸的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.3：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后常温维持反应2小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为16％的溶液，用9倍体积量的丙酮沉淀，所得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。
5)透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶制备：
用Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂2-氧化戊二酸的混合溶液浸渍步骤2)得到的冻干的透明质酸水凝胶，混合液体积与冻干透明质酸水凝胶相同，混合溶液中各成分的质量比为120：15：1，Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸浓度为0.2g/ml，形成透明体系后实施光化学聚合，时间为4.5分钟，得到透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1450mJ/cm2，光源与样品距离为10cm。
实施例8
一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的其制备方法，包括如下步骤：
1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备：
首先配制质量百分浓度为0.2％、分子量为400kDa的透明质酸水溶液，接着依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、胱胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其用量分别为透明质酸重复单元摩尔数的0.24、8和0.4倍；然后，利用浓度为1mol/L的NaOH溶液和盐酸将pH调至5.15，在室温下搅拌反应42小时；反应结束后，反应体系用去离子水透析(所用透析袋截留分子量为3.5kDa，以下相同)3天，经冷冻干燥(零下5℃保持72小时、20℃保持4小时)得到胱胺改性的透明质酸；
接下来，配制质量百分浓度为0.2％的胱胺改性的透明质酸水溶液，随后加入透明质酸重复单元摩尔数0.4倍的甲基丙烯酸缩水甘油酯，用浓度为1mol/L的NaOH溶液将pH调至8.0，在65℃下磁力搅拌反应8小时，再经去离子水透析3天；最后，对透析后的产物溶液进行冷冻干燥(零下15℃保持96小时、20℃保持4小时)，得到甲基丙烯酰化透明质酸。
2)透明质酸水凝胶的制备：
将步骤1)制备的甲基丙烯酰化透明质酸溶于去离子水，得到质量百分浓度为2％的溶液，加入甲基丙烯酰化透明质酸质量0.2％的水溶性光引发剂1-羟基环己基苯基丙酮，混合均匀后在实施光化学聚合10分钟，制得透明质酸水凝胶，经冷冻干燥(零下30℃保持36小时、20℃保持4小时)备用。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1400mJ/cm2，光源与样品距离为5cm。
3)Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸合成方法如下：
将浓度为0.2g/ml的L-赖氨酸水溶液置于250ml烧瓶中，加入L-赖氨酸摩尔量0.65倍量的碱式碳酸铜，煮沸2.5小时后热过滤，滤液pH用浓度为1mol/L的NaOH溶液调至9.0。将得到的含滤液的烧瓶置于冰浴中1小时，接着滴加L-赖氨酸摩尔量1.08倍量的丙烯酰氯溶液，整个过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持2.5小时，过滤收集蓝色固体，用蒸馏水洗2次后45℃真空干燥。将得到的干燥蓝色固体悬浮于去离子水中，形成浓度为5g/ml的悬浮液，将含4倍于蓝色固体物质的量的8-羟基喹啉溶于悬浮液1.5倍体积的氯仿中，接着将氯仿溶液加入悬浮液中室温搅拌24小时，过滤后水相用氯仿洗至无色后冻干(零下20℃保持86小时、20℃保持4小时)，得Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸。
4)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸合成方法如下：
将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.5g/ml的溶液，其中NaOH与L-胱氨酸的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.15：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后常温维持反应1.5小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为20％的溶液，用6倍体积量的丙酮沉淀，所得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。
5)透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶制备：
用Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂1-羟基环己基苯基丙酮的混合溶液浸渍步骤2)得到的冻干的透明质酸水凝胶，混合液体积与冻干透明质酸水凝胶相同，混合溶液中各成分的质量比为150：18：1，Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸浓度为0.2g/ml，形成透明体系后实施光化学聚合，时间为30s，得到透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1300mJ/cm2，光源与样品距离为5cm。
实施例9
一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的其制备方法，包括如下步骤：
1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备：
首先配制质量百分浓度为2％、分子量为700kDa的透明质酸水溶液，接着依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、胱胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，其用量分别为透明质酸重复单元摩尔数的0.72、10和0.5倍；然后，利用浓度为1mol/L的NaOH溶液和盐酸将pH调至5.35，在室温下搅拌反应30小时；反应结束后，反应体系用去离子水透析(所用透析袋截留分子量为3.5kDa，以下相同)3天，经冷冻干燥(零下30℃保持36小时、20℃保持4小时)得到胱胺改性的透明质酸；
接下来，配制质量百分浓度为1.5％的胱胺改性的透明质酸水溶液，随后加入透明质酸重复单元摩尔数0.25倍的甲基丙烯酸缩水甘油酯，用浓度为1mol/L的NaOH溶液将pH调至8.0，在85℃下磁力搅拌反应4小时，再经去离子水透析3天；最后，对透析后的产物溶液进行冷冻干燥(零下25℃保持36小时、20℃保持4小时)，得到甲基丙烯酰化透明质酸。
2)透明质酸水凝胶的制备：
将步骤1)制备的甲基丙烯酰化透明质酸溶于去离子水，得到质量百分浓度为3％的溶液，加入甲基丙烯酰化透明质酸质量0.5％的水溶性光引发剂2-氧化戊二酸，混合均匀后在实施光化学聚合30s，制得透明质酸水凝胶，经冷冻干燥(零下15℃保持80小时、20℃保持4小时)备用。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1350mJ/cm2，光源与样品距离为20cm。
3)Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸合成方法如下：
将浓度为0.4g/ml的L-赖氨酸水溶液置于250ml烧瓶中，加入L-赖氨酸摩尔量0.58倍量的碱式碳酸铜，煮沸3.5小时后热过滤，滤液pH用浓度为1mol/L的NaOH溶液调至9.0。将得到的含滤液的烧瓶置于冰浴中1小时，接着滴加L-赖氨酸摩尔量1.12倍量的丙烯酰氯溶液，整个过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持1.8小时，过滤收集蓝色固体，用蒸馏水洗2次后45℃真空干燥。将得到的干燥蓝色固体悬浮于去离子水中，形成浓度为0.5g/ml的悬浮液，将含3.6倍于蓝色固体物质的量的8-羟基喹啉溶于悬浮液1.3倍体积的氯仿中，接着将氯仿溶液加入悬浮液中室温搅拌24小时，过滤后水相用氯仿洗至无色后冻干(零下30℃保持50小时、20℃保持4小时)，得Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸。
4)N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸合成方法如下：
将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.35g/ml的溶液，其中NaOH与L-胱氨酸的摩尔比为2：1。将L-胱氨酸溶液在冰浴下冷却1小时后滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为2.25：1，滴加过程中用浓度为1mol/L的NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后常温维持反应2.5小时，接着将反应体系在零下20℃进行冷冻干燥。将冷冻干燥得到的物质溶于pH＝2的水中，获得质量百分浓度为10％的溶液，用11倍体积量的丙酮沉淀，所得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。
5)透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶制备：
用Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂2-氧化戊二酸的混合溶液浸渍步骤2)得到的冻干的透明质酸水凝胶，混合液体积与冻干透明质酸水凝胶相同，混合溶液中各成分的质量比为180：6：1，Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸浓度为0.2g/ml，形成透明体系后实施光化学聚合，时间为10分钟，得到透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶。其中，光化学聚合所用光源的中心波长为365nm、光能量密度为1350mJ/cm2，光源与样品距离为20cm。
Claims (10)
1.一种可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)甲基丙烯酰化透明质酸的制备：
配制透明质酸水溶液，再向其中依次加入用量为透明质酸重复单元摩尔数0.24～0.72倍的N-羟基琥珀酰亚胺、2～10倍的胱胺和0.2～0.6倍的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，然后将pH值调至5.0～5.5，在室温下搅拌反应24～60小时；反应结束后，反应体系依次经透析和冷冻干燥，得到胱胺改性的透明质酸；
配制胱胺改性的透明质酸水溶液，再向其中加入用量为透明质酸重复单元摩尔数0.1～0.4倍的甲基丙烯酸缩水甘油酯，然后将pH值调至8.0，在65℃～85℃下搅拌反应3～8小时，反应结束后，反应体系依次经透析和冷冻干燥，得到甲基丙烯酰化透明质酸；
2)透明质酸水凝胶的制备：
配制甲基丙烯酰化透明质酸水溶液，再向其中加入甲基丙烯酰化透明质酸质量0.2％～1％的水溶性光引发剂，混合均匀后实施光化学聚合，得到透明质酸水凝胶，经冷冻干燥后备用；
3)透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶制备：
按质量比为(100～200)：(5～20)：1配制Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸、N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引发剂的混合溶液，用混合溶液浸渍步骤2)得到的冻干的透明质酸水凝胶，形成透明体系后实施光化学聚合，得到透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶。
2.根据权利要求1所述的可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中配制的透明质酸水溶液的质量百分浓度为0.2％～2％，透明质酸的分子量为300～1000kDa；配制的胱胺改性的透明质酸水溶液的质量百分浓度为0.2％～2％；
所述步骤2)中配制的甲基丙烯酰化透明质酸水溶液的质量百分浓度为1％～3.5％。
3.根据权利要求1所述的可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中用NaOH溶液和盐酸调节pH值；
所述步骤1)中的透析是用去离子水透析3天，透析用的透析袋的截留分子量为3.5kDa。
4.根据权利要求1所述的可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤2)中的冷冻干燥是先在零下40℃～零下5℃保持36～96小时，再在20℃保持4小时。
5.根据权利要求1所述的可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的水溶性光引发剂为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-氧化戊二酸或1-羟基环己基苯基丙酮。
6.根据权利要求1所述的可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤2)和步骤3)中的光化学聚合的时间为30s～10min，光化学聚合所用的光源的中心波长为365nm、光能量密度为1200mJ/cm2～1500mJ/cm2，光源与样品的距离为5～20cm。
7.根据权利要求1所述的可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中浸渍用的混合溶液的体积等于冻干的透明质酸水凝胶的体积，混合溶液中Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸的浓度为0.2g/mL。
8.根据权利要求1所述的可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸的合成方法如下：
a)将浓度为0.05g/mL～0.5g/mL的L-赖氨酸水溶液置于烧瓶中，向其中加入L-赖氨酸摩尔量0.55～0.75倍的碱式碳酸铜，煮沸2～5小时后热过滤，用NaOH溶液调节滤液的pH值至9.0；
b)对步骤a)得到的滤液进行冰浴冷却，然后向其中滴加L-赖氨酸摩尔量1.05～1.2倍的丙烯酰氯溶液，滴加过程中用NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持1～4小时，然后过滤收集蓝色固体，蓝色固体经水洗后再在45℃下真空干燥；
c)将步骤b)得到的干燥的蓝色固体悬浮于去离子水中，形成浓度为0.05g/mL～5g/mL的悬浮液，将蓝色固体摩尔量2.2～4.0倍的8-羟基喹啉溶于悬浮液体积0.5～1.5倍的氯仿中，得到氯仿溶液，将氯仿溶液加入悬浮液中室温搅拌24小时，过滤后水相用氯仿洗至无色后冻干，得到Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸。
9.根据权利要求1所述的可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的制备方法，其特征在于：所述的N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸的合成方法如下：
A)将L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成浓度为0.05g/mL～0.5g/mL的L-胱氨酸溶液，其中NaOH与L-胱氨酸的摩尔比为2：1；
B)对L-胱氨酸溶液进行冰浴冷却，然后向其中滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，其中丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩尔比为(2.1～2.3)：1，滴加过程中用NaOH溶液维持pH＝8.0，滴加完成后将温度升至室温并维持1～4小时，再在零下20℃进行冷冻干燥；
C)将步骤B)冷冻干燥得到的物质溶于pH＝2的水中，得到质量百分浓度为5％～20％的溶液，然后用6～12倍体积量的丙酮沉淀，所得固体经真空干燥即得到N,N'-双丙烯酰基-L-胱氨酸。
10.权利要求1-9中任意一项所述的可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶的制备方法制得的可生物还原的透明质酸/聚(Nε-丙烯酰基-L-赖氨酸)双网络水凝胶，其特征在于：该双网络水凝胶具有微米级的多孔结构，其在10％～20％的应变范围内的压缩模量为46.3kPa，在24小时达到溶胀平衡，最大溶胀比为12。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20170301 Termination date: 20190603 |