KR102644718B1 - 3d 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법 및 이를 이용하여 생성된 인공 두피 모델 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 복수의 노즐 어레이를 이용하여 진피 모사체를 생성하고, 모공 모사 구조를 생성한 뒤 모낭 스페로이드를 3D 프린팅하여 생성할 수 있는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법 및 이를 이용하여 제조되는 인공 두피 모델에 관한 것이다.
본 발명에 따른 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법 및 이를 이용하여 제조되는 인공 두피 모델은 건강한 두피의 모발을 모방하여 복수의 배열된 모낭 세포를 3D 프린팅으로 생성할 수 있고, 이를 활용하여 반흔성 탈모 치료 효과를 극대화할 수 있는 효과가 있다.
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Description
본 발명은 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법 및 이를 이용하여 생성된 인공 두피 모델에 관한 것이다.
모낭주머니 (hair follicles) 및 모발은 피부의 주 부속물로써, 인체의 중요한 조직인 신경과 혈관이 분포하고 있으며, 피부보호, 체온보호, 피지물 배출, 감각인지 등 외피계통의 다양하고 중요한 기능을 수행하고 있다.
탈모는 임상적으로 모낭이 파괴되어 모발의 재생이 이루어지지 않는 반흔성 탈모와 모낭이 유지되어 모발의 재생이 이루어지는 비반흔성 탈모로 구분될 수 있다.
이와 관련하여 종래에는 탈모방지 또는 발모 촉진용 조성물을 이용한 치료가 널리 활용되고 있었다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제10-2021-0131680 호가 개시되어 있다.
그러나, 외상, 화상, 종양, 및 감염 등의 원인으로 모낭이 파괴되어 피부조직이 섬유화(fibrosis) 되어 영구적 탈모 상태가 되는 반흔성 탈모는 수술적 모발이식 방법 외에 확실한 치료법이 존재하지 않고 있으며, 반흔성 탈모와 같은영구적 모낭주머니 손실 환자의 재생 및 치료를 위해 조직공학적 접근법이 요구되고 있다.
본 발명은 종래의 반흔성 탈모의 치료시 수술적 모발이식을 위한 모낭을 대량으로 생산할 수 있는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법 및 이를 이용하여 생성된 인공 두피 모델을 제공하는 것에 그 목적이 있다.
상기 과제의 해결 수단으로서, 진피섬유아세포(dermal fibroblast)를 포함하는 제1 바이오 잉크를 생성하는 단계, 제1 바이오 잉크를 이용하여 소정 볼륨을 갖는 진피 모사체를 생성하는 단계, 모낭세포를 포함하는 제2 바이오 잉크를 생성하는 단계, 제2 바이오 잉크를 프린팅하기 위한 적어도 하나의 노즐을 진피 모사체에 삽입하는 단계, 적어도 하나의 노즐이 진피 모사체에 삽입된 상태에서 진피 모사체를 경화시키는 단계, 적어도 하나의 노즐을 이용하여 제2 바이오 잉크를 압출하여 적어도 하나의 스페로이드를 생성하는 단계 및 경화된 진피 모사체 중 노즐이 배치되었던 공간이 모공 모사 구조로 기능할 수 있도록 노즐을 후퇴시켜 노즐을 제거하는 단계를 포함하는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법이 제공될 수 있다.
한편, 스페로이드를 생성하는 단계 전 스페로이드의 프린팅 공간을 확보할 수 있도록 적어도 하나의 노즐을 소정거리로 후퇴시키는 노즐 후퇴 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 진피 모사체를 경화시키는 단계는 적어도 하나의 노즐이 진피 모사체에서 제거된 이후에도 모공 모사 구조가 유지될 수 있다.
한편, 스페로이드를 생성하는 단계는, 노즐의 직경보다 큰 직경으로 스페로이드를 진피 모사체 내에 3D 프린팅하여 수행될 수 있다.
한편, 적어도 하나의 노즐을 진피 모사체 내로 진입시키는 단계는 복수의 노즐이 배열(array)된 헤드를 노즐의 연장방향을 따라 이동시켜 수행될 수 있다.
한편, 스페로이드를 생성하는 단계는 진피 모사체 내에 적어도 일부가 삽입된 복수의 노즐 어레이에서 동시에 제2 바이오 잉크를 압출하여 수행될 수 있다.
한편, 노즐을 제거하는 단계는 노즐의 연장방향을 따라 노즐을 후퇴시켜 수행될 수 있다.
한편, 제1 바이오 잉크는 광경화성 가교 특성을 갖는 성분을 포함할 수 있다.
한편, 진피 모사체를 경화시키는 단계는, 제1 바이오 잉크를 경화시킬 수 있도록 광을 조사하는 단계를 포함할 수 있다.
한편, 제1 바이오 잉크는 열경화성 가교 특징을 갖는 성분을 포함할 수 있다.
한편, 노즐은 150 내지 700 μm의 외경을 가질 수 있다.
추가로, 진피섬유아세포(dermal fibroblast)를 포함하는 제1 바이오 잉크를 생성하는 단계, 제1 바이오 잉크를 이용하여 소정 볼륨을 갖는 진피 모사체를 생성하는 단계, 모낭세포를 포함하는 제2 바이오 잉크를 생성하는 단계, 제2 바이오 잉크를 프린팅하기 위한 적어도 하나의 노즐을 진피 모사체에 삽입하는 단계, 적어도 하나의 노즐이 진피 모사체에 삽입된 상태에서 진피 모사체를 경화시키는 단계, 적어도 하나의 노즐을 이용하여 제2 바이오 잉크를 압출하여 적어도 하나의 스페로이드를 생성하는 단계 및 경화된 진피 모사체 중 노즐이 배치되었던 공간이 모공 모사 구조로 기능할 수 있도록 노즐을 후퇴시켜 노즐을 제거하는 단계를 수행하여 제조되는 인공 두피 모델이 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법 및 이를 이용하여 생성된 인공 두피 모델은 건강한 두피의 모발을 모방하여 복수의 배열된 모낭 세포를 3D 프린팅으로 생성할 수 있다. 따라서 이를 활용하여 반흔성 탈모 치료 효과를 극대화할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 다른 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법의 순서도이다.
도 2는 진피 모사체를 생성하는 과정을 나타낸 개념도이다.
도 3A, 3B, 3C, 3D, 3E 및 3F는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법의 순서에 따라 두피 모델이 생성되는 개념을 도시한 도면이다.
도 4는 도 3F에서 노즐의 제거에 따라 형성되는 두피 모델의 단면을 도시한 도면이다.
도 5는 제1 바이오 잉크의 Ruthenium/Sodium persulfate 농도에 따른 겔화 시험 결과를 도시한 도면이다.
도 6은 제1 바이오 잉크의 Ruthenium/Sodium persulfate 농도에 따른 세포 기능 평가 결과를 도시한 도면이다.
도 7은 제2 바이오 잉크를 프린팅하는 작동압력에 따른 스페로이드의 프린팅 결과를 비교하여 도시한 도면이다.
도 8은 노즐의 직경에 따라 형성된 모공 크기 및 스페로이드를 도시한 도면이다.
도 9는 모공의 유무에 따른 스페로이드의 배양 결과를 도시한 도면이다.
도 10는 모공의 유무에 따른 유전자 분석 및 면역 염색 결과를 도시한 도면이다.
도 2는 진피 모사체를 생성하는 과정을 나타낸 개념도이다.
도 3A, 3B, 3C, 3D, 3E 및 3F는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법의 순서에 따라 두피 모델이 생성되는 개념을 도시한 도면이다.
도 4는 도 3F에서 노즐의 제거에 따라 형성되는 두피 모델의 단면을 도시한 도면이다.
도 5는 제1 바이오 잉크의 Ruthenium/Sodium persulfate 농도에 따른 겔화 시험 결과를 도시한 도면이다.
도 6은 제1 바이오 잉크의 Ruthenium/Sodium persulfate 농도에 따른 세포 기능 평가 결과를 도시한 도면이다.
도 7은 제2 바이오 잉크를 프린팅하는 작동압력에 따른 스페로이드의 프린팅 결과를 비교하여 도시한 도면이다.
도 8은 노즐의 직경에 따라 형성된 모공 크기 및 스페로이드를 도시한 도면이다.
도 9는 모공의 유무에 따른 스페로이드의 배양 결과를 도시한 도면이다.
도 10는 모공의 유무에 따른 유전자 분석 및 면역 염색 결과를 도시한 도면이다.
이하, 본 발명의 실시 예에 따른 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법 및 이를 이용하여 생성된 인공 두피 모델에 대하여, 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그리고 이하의 실시예의 설명에서 각각의 구성요소의 명칭은 당업계에서 다른 명칭으로 호칭될 수 있다. 그러나 이들의 기능적 유사성 및 동일성이 있다면 변형된 실시예를 채용하더라도 균등한 구성으로 볼 수 있다. 또한 각각의 구성요소에 부가된 부호는 설명의 편의를 위하여 기재된다. 그러나 이들 부호가 기재된 도면상의 도시 내용이 각각의 구성요소를 도면내의 범위로 한정하지 않는다. 마찬가지로 도면상의 구성을 일부 변형한 실시예가 채용되더라도 기능적 유사성 및 동일성이 있다면 균등한 구성으로 볼 수 있다. 또한 당해 기술 분야의 일반적인 기술자 수준에 비추어 보아, 당연히 포함되어야 할 구성요소로 인정되는 경우, 이에 대하여는 설명을 생략한다.
이하에서 모낭을 모사하여 회전타원체의 형상으로 프린팅된 덩어리를 '스페로이드'라 칭하고 설명하도록 한다.
인간의 두피의 모낭 수는 단위면적(cm^2) 당 약 80 내지 100개로 알려져 있다. 모낭의 구조는 듬성듬성한 단일세포의 집합체가 아닌 수백개의 모낭세포(dermal papilla cell)가 서로 밀접하게 응집하여 주머니 형태(follicle)를 이루고 있다.
한편, 바이오 잉크를 이용하여 인간의 조직을 모사하는 기술은 현재에도 다양한 방식으로 개발되고 있다. 그러나 단순히 세포를 바이오 잉크에 봉입하여 단일 노즐을 통해 토출하는 기존의 바이오 프린팅 기술은 모낭과 같은 세포가 밀집된 주머니의 형태의 조직학적 구조에 적용하기에 제작시간 및 재현성이 제한적이다.
본 발명은 전술한 모낭 조직을 한번에 복수개로 동시에 프린팅할 수 있는 조직 수준(tissue level)의 두피 모델을 제작할 수 있다.
이하에서는 도 1을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법에 대하여 설명하도록 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법의 순서도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법은 진피섬유아세포를 포함하는 제1 바이오 잉크를 생성하는 단계(S100), 제1 바이오 잉크를 이용하여 소정 볼륨을 갖는 진피 모사체를 생성하는 단계(S200), 모낭세포를 포함하는 제2 바이오 잉크를 생성하는 단계(S300), 적어도 하나의 노즐을 진피 모사체 내로 진입시키는 단계(S400), 진피 모사체를 경화시키는 단계(S500), 적어도 하나의 노즐을 소정거리 후퇴시키는 단계(S600), 진피 모사체 내에 진입한 적어도 하나의 노즐에서 제2 바이오 잉크를 압출하여 스페로이드를 생성하는 단계(S700)및 노즐을 제거하는 단계(S800)를 포함할 수 있다.
진피섬유아세포를 포함하는 제1 바이오 잉크를 생성하는 단계(S100)는 두피를 모사하여 프린팅할 수 있는 바이오 잉크를 생성하는 단계에 해당한다. 본 단계(S100)에서 제1 바이오 잉크는 진피섬유아세포(dermal fibroblast)와 소정 조건에서 가교 특성을 갖는 재료를 포함할 수 있다. 일 예로서 제1 바이오 잉크는 광 경화성 및/또는 열 경화성 재료를 포함할 수 있다.
제1 바이오 잉크에 포함되는 광 경화성(Photocurable) 재료는 예를 들어 상용되고 있는 Igacure, LAB, Ru/SPS(Ruthenium/Sodium persulfate) 일 수 있다. 또한 제1 바이오 잉크는 광 개시제(photoinitiator)를 이용하여 경화하는 재료를 포함할 수 있다.
한편, 열 경화성 재료는 일 예로서 콜라젠 기반의 ECM(extracellular matrix)일 수 있다. 이때 ECM은 포유류의 피부 또는 두피 조직으로부터 세포의 DNA 등을 제거하는 탈세포화 과정을 통해 마련될 수 있다.
제1 바이오 잉크는 일 예로서, 가시광선에 의해 경화되는 Ru (Ruthenium), SPS(Sodium persulfate)가 포함된 경우, Ru/SPS 의 농도는 0.25/2.5 mM 일 수 있다. 이 경우 제1 바이오 잉크는 진피섬유아세포를 포함한 상태에서 가시광선이 조사되어 겔화될 수 있다. 이때 광 경화성 재료는 가교에 의해 겔화 특성을 유지함과 동시에 진피섬유아세포의 생존성을 확보할 수 있다. 이와 같은 제1 바이오 잉크의 광 경화성 소재의 농도 및 세포의 생존성에 대하여는 차후 도 6 및 도 7을 참조하여 설명하도록 한다.
제1 바이오 잉크를 이용하여 소정 볼륨을 갖는 진피 모사체를 생성하는 단계(S200)는 소정 두께와 면적을 갖는 진피 모사체(bath suspension)를 생성하는 단계이다. 본 단계(S200)에서 진피 모사체는 모낭세포를 프린팅하기에 적절한 두께로 형성될 수 있다. 일 예로서 진피 모사체는 1 내지 300 mm 로 형성될 수 있다. 한편, 진피 모사체는 후술할 3D 프린터의 노즐 배열에 따라 면적이 결정될 수 있다. 즉 복수의 노즐 어레이가 배치되는 평면상의 면적보다 진피 모사체의 면적이 크게 결정될 수 있다. 따라서 진피 모사체는 3D 프린터 헤드에 구비된 복수의 노즐 어레이가 진피 모사체에 모두 삽입된 상태에서 동시에 압출되어 생성되는 스페로이드를 수용할 수 있다.
모낭세포를 포함하는 제2 바이오 잉크를 생성하는 단계(S300)는 모낭세포 응집체를 모사하기 위한 재료를 생성하는 단계에 해당한다. 생성된 제2 바이오 잉크는 실제 모낭세포가 주머니 형태로 응집되어 있는 것과 유사하게 고농도(1x10^8 cells/mL 이상)의 모낭세포를 포함할 수 있다.
적어도 하나의 노즐을 진피 모사체 내로 진입시키는 단계(S400)는 앞서 생성된 진피 모사체에 3D 프린터 헤드에 구비된 적어도 하나의 노즐을 동시에 진피 모사체 내로 삽입하는 단계 해당한다. 이때 적어도 하나의 노즐은 단부에서 전술한 제2 바이오 잉크를 압출하여 3D 프린팅할 수 있는 팁을 뜻한다. 본 단계에서는 노즐이 진피 모사체에 진입할 때 노즐에 의해 모공의 구조가 형성될 수 있다. 일 예로서 진피 구조체가 형성된 방향과 수직한 방향, 즉 진피 모사체의 두께 방향으로 3D 프린터의 헤드가 이동하여 노즐이 진피 모사체 내로 삽입될 수 있다. 이때 3D 프린터 헤드의 이동거리는 노즐의 단부가 진피 모사체 내에 위치할 정도로 결정될 수 있다.
진피 모사체를 경화시키는 단계(S500)는 빛, 예를 들어 자외선 또는 가시광선을 조사하여 진피 모사체를 경화시키는 단계에 해당한다. 이때 진피 모사체에는 적어도 하나의 노즐이 삽입된 상태에서 경화가 이루어질 수 있다. 이때 자외선 또는 가시광선의 노출 시기는 광경화성 소재의 농도에 따라 달라질 수 있다. 일 예로써 제1 바이오 잉크에 SPS의 10 % 농도의 Ru 가 첨가될 때 진피 모사체는 가시광선의 조사에 의해 3분 이내에 겔화될 수 있다. 따라서 노즐이 위치한 공간은 차후 노즐을 제거하면 빈 공간으로 유지될 수 있으며, 이러한 공간은 모공의 구조를 모사할 수 있게 된다. 한편, 도시되지는 않았으나, 제1 바이오 잉크가 열 경화성 소재를 포함하는 경우 본 단계에서 진피 모사체의 경화는 열을 가함으로서 수행될 수 있다.
적어도 하나의 노즐을 소정거리 후퇴시키는 단계(S600)는 모낭 세포 응집체를 모사하여 3D 프린팅하기 위한 공간을 확보하기 위하여 적어도 하나의 노즐을 소정거리로 후퇴시키는 단계에 해당한다. 본 단계는 3D 프린터 헤드를 노즐의 삽입방향과 반대로 이동시켜 수행되며, 적어도 하나의 노즐이 동시에 후퇴될 수 있다. 일 예로써 후퇴 거리는 모낭세포 응집체의 크기를 근거로하여 이루어질 수 있으며, 이때 3D 프린터의 헤드를 200 내지 1000 ㅅm 후퇴시킬 수 있다.
진피 모사체 내에 진입한 적어도 하나의 노즐에서 제2 바이오 잉크를 압출하여 스페로이드를 생성하는 단계(S700)는 제2 바이오 잉크의 압출 압력과 압출 시간을 조절하여 적어도 하나의 스페로이드를 생성하는 단계에 해당한다. 노즐이 복수로 구비된 경우 복수의 스페로이드가 동일한 크기로 동시에 3D 프린팅될 수 있다. 한편, 이때 압출 시간과 압출 압력은 노즐의 외경과 연관되어 결정될 수 있다. 이때 압출시간은 100 내지 800 ms 으로 빠르게 분사될 수 있다.
노즐을 제거하는 단계(S800)는 3D 프린터를 후퇴시켜 노즐을 진피 모사체로부터 제거하는 단계에 해당한다. 본 단계의 수행이 완료되면 진피 모사체에는 모공 구조가 형성되며, 또한 각 모공 구조의 가장 깊은 지점에는 모낭세포 응집체를 모사한 스페로이드가 형성될 수 있다. 이때 노즐이 복수의 어레이로 3D 프린터의 헤드에 구비되는 경우 복수의 어레이로 모공 및 스페로이드를 동시에 생성할 수 있게 된다.
전술한 본 발명의 일 실시예에 따른 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법은 모발이 자랄 수 있는 150 내지 700μm 의 모공(pore)이 포함된 진피층 및 진피층에서 수십개의 모낭세포 응집체를 한번에 프린팅할 수 있다. 나아가 복수의 모낭 스페로이드를 생성할 때 멀티 노즐을 이용하여 동시에 생성하는 것이 가능하므로 각각의 스페로이드는 실질적으로 동일한 크기로 프린팅될 수 있다.
이하에서는 도 2 내지 도 5를 참조하여 전술한 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법의 수행시 각 단계를 수행함에 따라 인공 두피 모델이 생성되는 과정에 대하여 설명하도록 한다.
도 2는 진피 모사체(10)를 생성하는 과정을 나타낸 개념도이다. 도시된 바와 같이 진피 모사체(10)는 제1 바이오 잉크를 일정한 틀(100)에 프린팅하여 생성될 수 있다. 제1 바이오 잉크는 생성하고자 하는 인공 두피 모델의 크기에 따라 생성하며, 그 두께 또한 결정하여 생성할 수 있다.
도 3A, 3B, 3C, 3D, 3E 및 3F 는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐(210)을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법의 순서에 따라 두피 모델이 생성되는 개념을 도시한 도면이다.
도 3A를 참조하면, 도 2에서와 같이 진피 모사체(10)를 생성시킨 이후 진피 모사체를 3D 프린터의 하부에 배치시킬 수 있다. 이때 3D 프린터에는 제2 바이오 잉크가 탑재(loading)된 상태일 수 있다. 3D 프린터 헤드(200)에는 복수의 노들이 수평방향으로 배열되어 있다.
도 3B를 참조하면, 3D 프린터의 노즐(210)을 진피 모사체(10) 내부로 삽입시키며, 노즐(210)의 단부가 진피 모사체(10) 내에 배치되도록 3D 프린터의 헤드(200)의 하강 위치를 조절할 수 있다. 이때 복수로 구성된 노즐(210) 어레이는 동시에 동일한 깊이로 진피 모사체(10) 내에 배치될 수 있다.
도 3C를 참조하면, 3D 프린터 헤드(200)가 진피 모사체(10) 내에 삽입된 상태에서 진피 모사체(10)를 경화시킬 수 있다. 이때 광, 예를 들어 광 조사부(300)에서 자외선 또는 가시광선을 조사하여 진피 모사체(10)가 경화될 수 있다.
이후 도 3D를 참조하면, 3D 프린터 헤드(200)를 소정거리 상승시켜 스페로이드의 프린팅 공간을 마련할 수 있다.
도 3E를 참조하면, 3D 프린터는 소정 압력과 소정 시간으로 각각의 노즐(210)에서 제2 바이오 잉크를 분사할 수 있다. 분사된 제2 바이오 잉크는 노즐(210)의 단부 측 공간에서 스페로이드를 구성하게 된다. 이때 복수의 스페로이드는 동시에 복수의 노즐(210) 어레이로부터 압출되어 동시에 생성될 수 있다.
도 3F를 참조하면, 3D 프린팅이 완료된 이후 노즐(210)을 동시에 제거할 수 있다. 이때 3D 프린터의 헤드(200)를 상승시켜 노즐(210)을 제거하며, 제거 과정에서 진피 모사체(10)의 변형을 최소화 할 수 있게 된다.
도 4는 도 3E에서 노즐(210)의 제거에 따라 형성되는 두피 모델의 단면을 도시한 도면이다.
도 4(a)를 참조하면, 복수의 노즐(210)은 경화된 진 모사체 내에 스페로이드를 각각 생성한 뒤 후퇴하여 제거될 수 있다. 한편, 이때 스페로이드의 직경과 무관하게 구성될 수 있다. 즉 생성된 스페로이드의 직경은 노즐(210)의 직경보다 크거나, 또는 노즐(210)의 직경보다 작을 수 있다. 이때 노즐(210)을 후퇴하더라도 경화되어 있는 진피 모사체(10)에는 노즐이 위치했었던 공간(30)이 유지될 수 있다.
도 4(b)를 참조하면, 노즐(210)이 제거된 상태에서 진피 모사체(10)에는 노즐(210)이 배치되었었던 공간이 유지되며, 이러한 공간이 모공 모사 구조(30)로서 기능할 수 있다.
결국 진피 모사체(10)에 복수의 배열로 모공 구조가 형성되며, 각각의 모공 구조에 동시에 모낭 스페로이드(20)가 프린팅되어 인공 두피 모델이 생성될 수 있다. 본 실시예를 따라 생성된 인공 두피 모델은 동시에 많은 모공 및 모낭 구조를 3D 프린팅하여 생성할 수 있게 된다.
이하에서는 도 5 내지 도 10을 참조하여, 본 발명에 따라 생성된 인공 두피 모델의 특성에 대하여 설명하도록 한다.
도 5는 제1 바이오 잉크의 Ruthenium/Sodium persulfate 농도에 따른 겔화 시험 결과를 도시한 도면이다.
도 5를 참조하면, 진피 모사체를 생성할 때 프린팅되기 적절한 농도, 그리고 경화 특성을 갖는 농도를 확인할 수 있다. 광 경화를 위해 제1 바이오 잉크(11)에 포함된 Ru/SPS 의 비율이 0.25/2.5 mM, 0.5/5 mM, 1/10 mM 일 때 각각 가시광선 조사 후 3분 이내에 경화되는 것을 확인할 수 있다. 따라서 진피 모사체의 경도와 관련된 관점으로 Ru/SPS 의 농도는 바람직하게는 10%로 결정될 수 있다.
도 6은 제1 바이오 잉크의 Ruthenium/Sodium persulfate 농도에 따른 세포 기능 평가 결과를 도시한 도면이다. 도 6을 참조하면, Ru/SPS 농도별로 진피섬유아세포를 봉입한 뒤 세포의 생존능과 증식능을 평가하여 최적의 농도를 결정할 수 있다.
도 6(a)를 참조하면, 봉입된 진피섬유아세포의 확인을 위해 Live/dead 염색 시험 결과 Ru/SPS 의 농도가 0.5/ 5mM 이상일 때, 사멸한 세포의 수가 많이 관찰되었다.
도 6(b)를 참조하면, CCK-8 assay를 이용한 증식 평가에서 5/0.5 mM 및 1/10 mM 의 실험그룹은 7일간의 체외 배양에서 증식이 거의 진행되지 않았음을 확인할 수 있다.
도 6(c)를 참조하면, F-actin 염색 결과, control과 유사하게 0.25/2.5 mM의 실험 그룹에서는 7일 후 세포가 하이드로젤 내에서 잘 생착(stretch)되어 뻗어있는 것이 관찰된 반면 다른 농도를 갖는 실험 군에서는 세포가 하이드로젤 내에서 뻗어있지 못하고 여전히 봉입했을 때의 둥근 형태(phenotype)를 유지하고 있었다
도 6(d)를 참조하면, 정량적 평가를 위해 F-actin의 형광 세기를 평가하여 0.25/2.5 mM 이 다른 그룹에 비하여 탁월한 세포 적합성(biocompatiblity)를 갖는 것을 확인할 수 있다.
결국 전술한 도 5 및 도 6을 참조하여 설명한 바와 같이, 제1 바이오 잉크의 농도는 Ru/SPS 농도를 0.25/2.5 mM 로 결정하는 경우 광 경화에 의한 적절한 강도를 확보할 수 있으며, 봉입된 진피섬유아세포의 생존 및 증식을 확보할 수 있게 된다.
도 7은 제2 바이오 잉크를 프린팅하는 작동압력에 따른 스페로이드의 프린팅 결과를 비교하여 도시한 도면이다.
도 7을 참조하면, 최적화된 3D 프린터의 노즐의 직경 및 압출 압력과 시간을 확인할 수 있다. 이때 전술한 바와 같이 진피 모사체는 Ru/SPS 의 농도가 0.25/2.5 mM 로 결정된 상태에서 실험되어 노즐의 직경과 압출 조건을 최적화 할 수 있다.
도 7(a)와 같이, 노즐(210) 어레이는 9x9 로 총 81개가 3D 프린터의 헤드(200)에 구비될 수 있으며, 각각의 노즐(210)에서 제2 바이오 잉크를 압출하는 압력을 변화시킬 수 있다. 도 7(b)를 참조하면, 압출되는 압력은 6kPa, 8kPa, 10kPa을 선정하여 수행하였으며, 노즐 어레이 상에서 노즐의 위치와 무관하게 압출 압력에 따라 일정하게 스페로이크의 크기가 결정되는 것을 확인할 수 있다.
도 8은 노즐의 직경에 따라 형성된 모공 크기 및 스페로이드를 도시한 도면이다.
도 8(a) 및 8(b)를 참조하면, 3D 프린터의 헤드(200)에 구비된 노즐(210)의 크기에 따라 모공(pore)의 형성이 달라질 수 있는데, 서로 다른 외경(32, 26, 23 gauge)으로 구성된 노즐(210) 어레이를 구성하여 진피 모사체(10)에 삽입하여 경화시킨 후 형성된 모공 모사 구조(30)를 평가할 수 있다. 도 6을 참조하여 설명한 0.25/2.5 mM 의 Ru/SPS를 포함하는 진피 모사체에 서로 다른 외경을 갖는 니들 어레이를 삽입한 후 3분동안 가시광선에 노출시켜 광경화를 수행하였다. 그 결과 노즐의 크기에 따라 일정한 모공이 생성되는 것을 확인할 수 있다(도 8(c)). 일 예로서, 32 게이지의 노즐(외경이 235 μm)을 이용하여 스페로이드를 프린팅할 때 이 노즐을 사용하였을 때 진피 모사체에 생성되는 모공의 크기는 약 230 μm 정도될 수 있다.
도 8(d)를 참조하면, 진피 모사체에 서로 다른 내경으로 형성된 모공 모사 구조 내에 복수의 노즐에서 스페로이드를 압출하여 프린팅하였으며, 최종적으로 스페로이드는 모공 모사 구조의 내경에 의존하여 크기가 결정됨을 확인하였다.
도 9는 모공의 유무에 따른 스페로이드의 배양 결과를 도시한 도면이다.
도 9의 상측 열의 이미지를 참조하면, 모공이 없이 진피층 내에 모낭 스페로이드가 생성되었을 때, 이를 배양하면 3일 후부터 스페로이드(20)의 세포가 진피 모사체(10) 내부로 확산(spreading)되며 빠져나가는 것이 관찰되었다. 반면 도 9의 하측 열의 이미지를 참조하면, 모공 모사 구조(30)에 스페로이드(20)가 생성된 경우, 이를 배양하더라도 스페로이드(20)가 모공 모사 구조(30) 내에 구형을 유지하면서 진피 모사체(10)로 확산되는 현상이 발견되지 않았다. 결국 적절하게 모낭 세포를 배양하기 위해서는 모공(30)의 구조가 필수적으로 요구됨을 확인할 수 있다.
도 10는 모공의 유무에 따른 유전자 분석 및 면역 염색 결과를 도시한 도면이다.
세포 스페로이드가 그 형상을 유지하는 것은 세포의 분화 및 기능에 중요한 영향을 미치는 것은 익히 알려진 사실이다. 도 10(a)를 참조하면, 모공 모사 구조의 유무에 따라 모낭 세포가 모발을 형성할 때 분화하며 생성되는 대표적인 유전자 표지(marker)를 사용하여 rt-PCR을 통해 분석한 결과를 확인할 수 있다. 그 결과 모든 표지자는 모공이 있는 경우, 모공이 없는 경우보다 월등히 높은 유전자 발현 수치를 확인되었다. 또한 도 10(b)를 참조하면, 모발 형성의 초기 표지자 중 하나인 AE15 안티바디를 사용하여, 면역염색을 수행한 결과 모공이 있는 경우(도 10(b) 하측) 모낭 스페로이드에서 AE15가 발현되어 모발로서 분화된 것을 확인하였다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법 및 이를 이용하여 생성된 인공 두피 모델은 많은 수의 모공 및 모낭 스페로이드의 배열을 동시에 생성할 수 있다. 따라서 반흔성 탈모에 대한 치료 효과를 극대화할 수 있는 효과가 있다.
S100: 진피섬유아세포를 포함하는 제1 바이오 잉크를 생성하는 단계
S200: 제1 바이오 잉크를 이용하여 소정 볼륨을 갖는 진피 모사체를 생성하는 단계
S300: 모낭세포를 포함하는 제2 바이오 잉크를 생성하는 단계
S400: 적어도 하나의 노즐을 진피 모사체 내로 진입시키는 단계
S500: 진피 모사체를 경화시키는 단계
S600: 적어도 하나의 노즐을 소정거리 후퇴시키는 단계(S600),
S700: 진피 모사체 내에 진입한 적어도 하나의 노즐에서 제2 바이오 잉크를 압출하여 스페로이드를 생성하는 단계
S800: 노즐을 제거하는 단계
200: 헤드
210: 노즐
10: 진피 모사체
20: 스페로이드
30: 모공 모사 구조
S200: 제1 바이오 잉크를 이용하여 소정 볼륨을 갖는 진피 모사체를 생성하는 단계
S300: 모낭세포를 포함하는 제2 바이오 잉크를 생성하는 단계
S400: 적어도 하나의 노즐을 진피 모사체 내로 진입시키는 단계
S500: 진피 모사체를 경화시키는 단계
S600: 적어도 하나의 노즐을 소정거리 후퇴시키는 단계(S600),
S700: 진피 모사체 내에 진입한 적어도 하나의 노즐에서 제2 바이오 잉크를 압출하여 스페로이드를 생성하는 단계
S800: 노즐을 제거하는 단계
200: 헤드
210: 노즐
10: 진피 모사체
20: 스페로이드
30: 모공 모사 구조
Claims (12)
- 진피섬유아세포(dermal fibroblast)를 포함하는 제1 바이오 잉크를 생성하는 단계;
상기 제1 바이오 잉크를 이용하여 소정 볼륨을 갖는 진피 모사체를 생성하는 단계;
모낭세포를 포함하는 제2 바이오 잉크를 생성하는 단계;
상기 제2 바이오 잉크를 프린팅하기 위한 적어도 하나의 노즐을 상기 진피 모사체에 삽입하는 단계;
상기 적어도 하나의 노즐이 상기 진피 모사체에 삽입된 상태에서 상기 진피 모사체를 경화시키는 단계;
상기 적어도 하나의 노즐을 이용하여 상기 제2 바이오 잉크를 압출하여 적어도 하나의 스페로이드를 생성하는 단계; 및
상기 경화된 진피 모사체 중 상기 노즐이 배치되었던 공간이 모공 모사 구조로 기능할 수 있도록 상기 노즐을 후퇴시켜 상기 노즐을 제거하는 단계를 포함하는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법. - 제1 항에 있어서,
상기 스페로이드를 생성하는 단계 전,
상기 스페로이드의 프린팅 공간을 확보할 수 있도록 상기 적어도 하나의 노즐을 소정거리로 후퇴시키는 노즐 후퇴 단계를 더 포함하는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법. - 제2 항에 있어서,
상기 진피 모사체를 경화시키는 단계는,
상기 적어도 하나의 노즐이 상기 진피 모사체에서 제거된 이후에도 상기 모공 모사 구조가 유지되는 것을 특징으로 하는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법. - 제2 항에 있어서,
상기 스페로이드를 생성하는 단계는,
상기 모공 모사 구조의 하단에 상기 제2 바이오잉크를 압출하여 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법. - 제4 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 노즐을 상기 진피 모사체 내로 진입시키는 단계는 복수의 상기 노즐이 배열(array)된 헤드를 상기 노즐의 연장방향을 따라 이동시켜 수행되는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법. - 제5 항에 있어서,
상기 스페로이드를 생성하는 단계는,
상기 진피 모사체 내에 적어도 일부가 삽입된 상기 복수의 노즐 어레이에서 동시에 상기 제2 바이오 잉크를 압출하여 수행되는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법. - 제6 항에 있어서,
상기 노즐을 제거하는 단계는,
상기 노즐의 연장방향을 따라 상기 노즐을 후퇴시켜 수행되는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법. - 제2 항에 있어서,
상기 제1 바이오 잉크는 광경화성 가교 특성을 갖는 성분을 포함하는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법. - 제8 항에 있어서,
상기 진피 모사체를 경화시키는 단계는, 상기 제1 바이오 잉크를 경화시킬 수 있도록 광을 조사하는 단계를 포함하는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법. - 제2 항에 있어서,
상기 제1 바이오 잉크는 열경화성 가교 특징을 갖는 성분을 포함하는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법. - 제3 항에 있어서,
상기 노즐은 150 내지 700 μm의 외경을 갖는 3D 프린팅 기반 다점 멀티 노즐을 이용한 인공 두피 모델 제작 방법. - 진피섬유아세포(dermal fibroblast)를 포함하는 제1 바이오 잉크를 생성하는 단계;
상기 제1 바이오 잉크를 이용하여 소정 볼륨을 갖는 진피 모사체를 생성하는 단계;
모낭세포를 포함하는 제2 바이오 잉크를 생성하는 단계;
상기 제2 바이오 잉크를 프린팅하기 위한 적어도 하나의 노즐을 상기 진피 모사체에 삽입하는 단계;
상기 적어도 하나의 노즐이 상기 진피 모사체에 삽입된 상태에서 상기 진피 모사체를 경화시키는 단계;
상기 적어도 하나의 노즐을 이용하여 상기 제2 바이오 잉크를 압출하여 적어도 하나의 스페로이드를 생성하는 단계; 및
상기 경화된 진피 모사체 중 상기 노즐이 배치되었던 공간이 모공 모사 구조로 기능할 수 있도록 상기 노즐을 후퇴시켜 상기 노즐을 제거하는 단계를 수행하여 제조되는 인공 두피 모델.
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Patent Citations (1)
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