CN110475528A - 仿生植入物 - Google Patents

Abstract

描述了用于脊髓和周围神经损伤的可植入装置。所述植入物包括三维打印结构，所述三维打印结构具有设置在其中的干细胞。还公开了用所公开的植入物治疗神经元损伤的方法。

Description

仿生植入物

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年12月12日提交的美国临时申请No.62/433,142的权益，该美国临时申请的全部内容以引用方式并入本文。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明是在国立卫生研究院授予的批准号EB014986的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

技术领域

本文公开了用于治疗脊髓和周围神经损伤的含有干细胞的三维仿生植入物。

背景技术

用于对功能组织进行生物打印的方法已面临许多挑战，其中包括缺乏适当的生物制造技术来构建引导细胞生长和促进组织成熟所必需的复杂三维(3D)微架构。之前尚未成功完成中枢神经系统结构的三维打印。

发明概述

本文描述了用于组织修复的可植入装置或植入物。在一些实施方式中，组织可以是脊髓组织或周围神经组织。这些植入物可用于治疗这些类型组织中的任何一种的损伤。

植入物可包括没有分层的三维打印结构。在一些实施方式中，植入物可包括三维打印结构，所述三维打印结构包括第一端和第二端；一个或多个通道，所述一个或多个通道起始于所述第一端并终止于所述第二端；以及至少一种类型的干细胞，所述至少一种类型的干细胞包括在所述至少一个通道中。

在一些实施方式中，植入物是仿生的。植入物可以是脊髓仿生的，并且包括芯(代表脊髓灰质)和壳(代表脊髓白质)，其中所述壳含有通道。在另一些实施方式中，植入物可以是周围神经仿生的，并且包括堆积在一起的线性通道的蜂窝结构。在脊髓或周围神经的情况下，线性通道可以将再生轴突引导至病变的另一侧。

因此，本文公开了用于脊髓或周围神经损伤的仿生植入物，所述植入物包括：三维(3D)植入物，所述三维(3D)植入物包括第一端和第二端，并且包括芯和壳，并且模拟损伤部位的结构；至少一个通道，所述至少一个通道在所述壳中，起始于所述第一端并终止于所述第二端；以及至少一种类型的干细胞，所述至少一种类型的干细胞包括在所述至少一个通道中。

在一些实施方式中，所述植入物通过3D打印产生。

在一些实施方式中，所述至少一种类型的干细胞是神经干细胞。在一些实施方式中，所述神经干细胞是胚胎干细胞、iPSC来源的干细胞、直接分化的神经干细胞，或它们的组合。在一些实施方式中，所述至少一种类型的干细胞是间充质干细胞。在一些实施方式中，所述干细胞经工程化以表达BDNF、NT3、GDNF，或它们的组合。

在一些实施方式中，所述三维打印植入物包括聚乙二醇二丙烯酸酯，或甲基丙烯酰化明胶，或它们的组合。

在一些实施方式中，所述植入物是脊髓仿生的。在一些实施方式中，所述植入物是周围神经仿生的。

在一些实施方式中，所述通道是线性的。在一些实施方式中，所述通道彼此平行。在一些实施方式中，所述通道将再生轴突从所述第一端引导到所述第二端。在一些实施方式中，植入物包括两个或更多个通道，所述两个或更多个通道具有聚集为蜂窝结构的六边形横截面。

本文还公开了用于治疗有此需要的宿主的神经损伤的方法，所述方法包括：将本文公开的仿生植入物植入到需要治疗的位置；以及使损伤部位处的细胞再生。

在一些实施方式中，所述神经损伤是脊髓损伤、运动完全脊髓损伤、运动不完全脊髓损伤，或周围神经损伤。在一些实施方式中，所述神经损伤是脊髓损伤。在一些实施方式中，所述神经损伤是周围神经损伤。

在一些实施方式中，所述方法还包括向宿主提供物理疗法。

本文还公开了制造本文所公开的仿生植入物的方法，所述方法包括：扫描需要治疗的宿主中的脊髓或周围神经位置以确定损伤区域；以及三维地打印植入物以覆盖(encompass)损伤区域。

附图说明

图1A至图1E描绘了模拟脊髓结构的3D打印植入物。图1A描绘了3D打印机设置，所述3D打印机设置包括UV光源(365nm波长)、用于切片图像流生成和系统同步的计算机、用于光学图案生成的数字微镜装置(DMD)、一组投影光学器件、用于样品位置控制的平台，以及用于在线监测制造过程的CCD成像系统。图1B描绘了微尺度连续投影3D打印(μCPP)无分层3D打印，其创建没有在喷墨3D打印机中经常观察到的分立层的结构。图1C描绘了完整T3大鼠脊髓中轴突的重链神经丝(NF200)标记。头侧在图像左侧，尾侧在图像右侧。白质中的轴突(小图的顶部)高度组织成从头侧到尾侧的平行阵列，而灰质中的轴突(小图的底部)不是以线性阵列存在的。所公开的植入物模拟白质的线性组织。白线标定了白质与灰质之间的界面。图1D描绘了在T3大鼠脊髓的背外侧象限中不同轴突束(簇)的投影。示出了红核-红核脊髓束(Ru)、缝核-缝核脊髓束(Ra)、网状-网状脊髓束(Ret)、本体-本体脊髓束(Pr)、脊髓丘脑-脊髓丘脑束(ST)和CST-皮质脊髓束(C)。中央蝴蝶形部分是植入物的芯(类似于正常脊髓的“灰质”)，并且图示的剩余部分是植入物的壳(类似于正常脊髓的“白质”)。图1E描绘了在头-尾轴中实现引导，从而将再生轴突(线)引导至病变远侧上的其适当束。箭头指向植入物中再生轴突的进入和退出点，示出植入物在整个病变部位保持精确的3D坐标，从而与天然宿主架构相匹配。

图2描绘了使用动态力学分析(DMA)对植入物弹性模量进行的力学测量。

图3A至图3E描绘了本文所公开的示例性脊植入物。图3A示出了人临床完全(ASIAA)脊髓损伤的矢状中颈T1加权磁共振(MR)图像。在病变(箭头)的前方(右侧)看到一块保留的宿主白质。图3B示出了来自图3A的囊性病变腔的追踪轮廓。图3C示出了与精确病变形状对应的待3D打印的植入物的计算机辅助设计(CAD)3D模型。图3D示出了打印的植入物。图3E示出了图3D的打印的3D植入物在人体挫伤腔中的假想配合。

图4描绘了在植入物植入后四周时，植入到脊髓损伤部位中的3D打印植入物。图4示出了针对轴突(用神经丝NF200)标记的病变部位中植入物的横截面图像，其显示整个植入物结构在植入后四周时保持完整(横断切面)。比例尺为500μm。

图5A至图5C描绘了在植入后四周时，植入到脊髓损伤部位中的3D打印植入物。描绘了植入部位(T3完全横断部位)的Nissl染色，显示琼脂糖支架植入部位处的反应性细胞层(箭头)(图5A)，所述反应性细胞层在植入本文公开的3D打印聚乙二醇二丙烯酸酯/甲基丙烯酰化明胶(PEGDA/GelMa)植入物后实质上减弱(图5B)。比例尺为200μm。头侧在左侧，尾侧在右侧。中断线标定了宿主脊髓与植入物的界面。图5C描绘了对反应性细胞层(RCL)厚度的量化，±S.E.M.*p<0.05(学生t检验)。

图6A至图6D描绘了在植入后四周时，植入到脊髓损伤部位中的3D打印植入物。描述了仅具有病变(无植入物)(图6A)、在病变部位中具有琼脂糖支架(图6B)或在病变部位中具有3D打印植入物(图6C)的动物中，通过胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫反应显示的宿主胶质瘢痕(头侧在左侧，尾侧在右侧)。图6A和图6B的比例尺为250μm，并且图6C的比例尺为100μm。应注意，在3D打印的PEGDA/GelMa植入物周围不存在GFAP标记的屏障；相反，胶质纤维纵向布置到通道中，在所述通道中它们可以潜在地支撑延伸的轴突。图6D描绘了宿主脊髓周围的病变部位中的GFAP强度的量化，±S.E.M.*p<0.05(使用Tukey事后比较的ANOVA)。

图7A至图7B描绘了在植入后四周时，植入到脊髓损伤部位中的3D打印植入物。植入物是良好血管化的(针对血管的RECA-1免疫标记)(图7A)，并且甲苯胺蓝染色显示血管(星号)(图7B)。图7A的比例尺为25μm，并且图7B的比例尺为20μm。

图8A至图8B描绘了在植入后四周时，植入到脊髓损伤部位中的3D打印植入物。NF200标记的宿主轴突不能穿过琼脂糖支架周围存在的瘢痕(图8A)，但是很容易穿透3D打印植入物(图8B)。比例尺为100μm。虚线指示植入物从病变部位的头侧方向进入。

图9A至图9C描绘了在植入后四周时，植入到脊髓损伤部位中的3D打印植入物。图9A是通道内的电子显微照片图像，其显示了与邻近的包鞘施万细胞(Sc)缔合的轴突(星号)。比例尺为1μm。图9B描绘了放大的来自图9A的通道，其显示S100标记的施万细胞包鞘NF200标记的轴突(箭头)。比例尺为5μm。图9C是通道的电子显微照片，其显示具有施万细胞(SC)的植入物中的有髓鞘轴突。比例尺为0.5μm。

图10A至图10H描绘了植入到大鼠体内后四周时，本文公开的并且装载有神经干细胞的3D打印植入物。图10A描绘了填充有表达GFP的神经干细胞的通道(箭头)(水平切面)。比例尺为200μm。图10B描绘了NF200标记的宿主轴突穿透的通道的头侧入口；宿主细胞通过不存在GFP表达而与移植来源的轴突区分。比例尺为50μm。图10C描绘了植入的神经干细胞使通过植入物线性架构而线性化的表达GFP的轴突延伸。图10D描绘了5HT标记的宿主羟色胺能轴突从病变的头侧(左)方向进入干细胞填充的通道并在所述通道中线性地再生(箭头)。比例尺为100μm。图10E描绘羟色胺能轴突线性地再生成到没有干细胞的空植入物中，但是穿透轴突的数目减少。比例尺为100μm。图10F描绘5HT标记的宿主羟色胺能轴突再生到含有干细胞的植入物的尾侧端，遵循由植入物架构产生的线性边界。比例尺为50μm。图10G描绘了到达植入物的尾侧部分的5HT轴突的量化。*p<0.05(ANOVA，+S.E.M.)。图10H描绘5HT标记的运动轴突离开通道的尾侧方向，以再生到病变远端的宿主脊髓中(箭头)。线标定了从尾侧通道到达尾侧脊髓的出口。比例尺为50μm。

图11描绘了在超微结构水平，通道内存在不同直径的轴突，并且在植入图10的植入物后许多轴突为有髓鞘的。比例尺为500μm。

图12A至图12B描绘了在植入后四周时对植入部位的超微结构分析。图12A描绘了通道内存在不同直径的轴突(星号)并且许多轴突是有髓鞘的(M)，比例尺为500nm。图12B描绘了少突胶质细胞发送对轴突进行髓鞘化(myelinate)和包鞘(ensheath)的多个过程。比例尺为0.2μm。

图13描绘了植入后四周时，打印的植入物装载有神经干细胞。突触(箭头)在通道内的轴突与植入的神经干细胞的树突之间形成。比例尺为200μm。突触是不对称的，并且突触前的结含有圆化囊泡，表明这些突触是兴奋性的。

图14A至图14B描绘了植入后四周时装载有神经干细胞的打印植入物。图14A描绘了在植入后四周时，5HT宿主轴突再生到植入物通道内，形成与植入的神经干细胞(GFP)的树突(用Map2标记)的附着(appositional)接触(箭头)。比例尺为10μm。图14B描绘了对到达植入物尾侧端的5HT轴突的量化。*p<0.05(ANOVA P<0.01，Tukey事后P<0.01，将NSC植入物组与仅NSC移植组和空植入物组进行比较)。

图15A至图15G描绘了在长期体内研究中装载有神经干细胞的打印植入物：图15A至图15E描绘了植入后6个月时的解剖结构。图15A：通道保持结构完整，并填充有表达GFP的神经干细胞。水平切面，头侧在左侧。图15B：用RFP顺行标记的皮质脊髓轴突进入植入物并沿尾侧方向线性延伸，通过植入物架构对齐。水平切面。图15C：皮质脊髓轴突(CST)轴突会聚在通道内NeuN标记的神经元上，从而与胞体(soma)形成潜在的结样接触。图15D：GFP免疫反应性轴突从植入物延伸出进入病变尾侧的宿主白质和灰质。腹外侧白质，在病变尾侧2mm处。图15E：神经干细胞(NSC)来源的GFP标记的轴突在位于病变尾侧2mm处的灰质NeuN免疫反应性宿主神经元上形成潜在的结样结构。图15F至图15G描绘了行为研究。图15F：神经干细胞/植入物处理的动物在植入后五个月时在BBB运动量表上表现出显著的功能恢复，反映了两个后肢的三个关节中的每一个关节的一致运动(**p<0.05，*p<0.01)。图15G：植入后6个月时执行的电生理学研究的示意图。将经颅电刺激施加至脑中的运动皮质，并记录来自后肢的运动诱发电位(MEP)。

图16A至图16D描绘了在植入后6个月时装载有神经干细胞的3D打印植入物。具有3D打印的干细胞植入物的大鼠表现出MEP响应的部分恢复(图16A)。该恢复通过随后重新横断植入物上的脊髓来消除(图16B)。具有空植入物的动物显示为没有MEP恢复(图16C)。图16D描绘了植入了含有神经干细胞的植入物的动物中的平均MEP幅度显著更大(p<0.01)。

图17描绘了具有加载有干细胞的植入物的动物在BBB运动量表上表现出显著的功能改善，表明两条腿上的三个关节中的每一个关节的运动(*p<0.05，**p<0.01)。N＝8个NSC/植入物组，N＝6个空植入物组。

图18A至图18B描绘了(图18A)2mm和(图18B)4mm的不同长度打印植入物的纵向图像。比例尺为0.5mm。

图19A至图19D描述了琼脂糖(图19A)、PEGDA/GelMa(图19B)和透明质酸植入物(图19C)的Nissl染色，显示植入物架构在琼脂糖和PEGDA中持续4周，并且透明质酸支架降解。图19D描绘了在PEGDA-GelMa植入物中RCL的厚度显著减小(p<0.05，ANOVA；Tukey事后比较将PEGDA组与琼脂糖支架和HA支架进行比较)。平均值±s.e.m.。比例尺为250μm。

图20描绘了通过壁厚度减小测量的植入物降解。*p<0.0001，**p<0.001。(ANOVA；Tukey事后比较)。

图21A至图21D描绘了植入后4周时的神经元再生。图21A描绘了来自4种不同动物的GFP标记的植入物，显示通道完全且均匀地填充有啮齿动物神经干细胞，所述啮齿动物神经干细胞也占据植入物与宿主之间的界面(箭头)。比例尺为0.5mm。图21B至图21C描绘了除了GFP外，通道中的干细胞来源的细胞还表达神经元标记物Hu(图21B)或NeuN(图21C)。比例尺为5μm。图21D描绘它们还与GFP一起表达少突胶质细胞标记物Olig2，并且图21E示出与GFP一起的星形胶质细胞标记物GFAP。比例尺为5μm。

图22描绘了通道内的移植细胞中的干细胞分化标记物分布。

图23描绘了羟色胺能轴突(箭头)在注射到没有植入物的病变部位中的干细胞移植物中可见；轴突是竖直取向的，并且因此在病变部位的头侧至尾侧轴上是不对齐的。中断线标定了移植物-宿主界面。头侧在左侧，尾侧(病变部位)在右侧。比例尺为50μm。

图24A至图24B描绘了没有干细胞填充的通道(图24A)或没有植入物的干细胞移植物(图24B)，在植入物的尾侧方向处含有实质上较少的5HT标记的轴突。比例尺为50μm。

图25描绘了通道内5HT标记的宿主运动轴突的10μm z堆叠的3D渲染不与GFP共标记，表明在脊髓来源的神经干细胞移植物中不存在羟色胺能神经元细胞体。

图26描绘了5HT标记的运动轴突在(K1，比例尺为100μm)宿主灰质、(K2，比例尺为50μm)宿主白质，和(K3，比例尺为25μm)从白质过渡到灰质中的病变尾侧的宿主脊髓中可见。可以看到宿主轴突的NF200染色。

图27A至图27B描绘了装载有神经干细胞的3D打印植入物的单个通道，证明了血管形成。在装载有表达GFP的NSC的通道内的GAP43标记的轴突(图27A，比例尺为25μm)。宿主脊髓中GAP43标记的轴突在植入物的尾侧(图27B，比例尺为25μm)。

图28A至图28B描绘了甲苯胺蓝染色，箭头指向血管(图28A，比例尺为100μm)。在EM图像中，血管用星号标记(图28B，比例尺为1μm)。

图29描绘了周细胞的PDGFR标记显示它们围绕RECA-1标记的血管，表明BBB恢复。比例尺为15μm。

图30描绘了相对于空植入物处理的动物，植入了干细胞植入物的动物中MEP的延迟更短，并且接近于在完整动物中观察到的延迟(p<0.01)。

图31描绘了来自接受具有和不具有干细胞的植入物的动物的运动诱发电位记录。

图32A描绘了包括线性通道的植入物。图32B是图32A的放大版本。

图33A描绘了包括堆积在一起的线性通道的蜂窝结构的植入物。图33B是图33A的放大版本。

发明详述

本文公开了植入物和用于对再生促进性植入物进行快速三维(3D)微尺度打印的方法，所述植入物对脊髓或周围神经的复杂成束微尺度架构进行仿生。包含聚合物的植入物可以被快速打印，并且可以扩展成临床相关的脊髓或周围神经大小和病变几何形状。将受损的宿主轴突再生成3D仿生植入物，突触连接到植入到装置中的神经干细胞上，植入的神经干细胞继而将轴突从植入物延伸出并进入损伤下方的宿主脊髓或周围神经，以恢复突触传递并显著改善功能输出。在损伤部位上形成新的替代电生理学继电物(relay)，其支持显著的功能性运动改善。因此，复杂的3D仿生植入物通过精确医学而提供了增强中枢神经系统再生的手段。

本文描述了有助于恢复身体功能的医学植入物。该功能可在哺乳动物中恢复，所述哺乳动物可包括人、马、猪、奶牛、公牛、山羊、绵羊、海豚、狗、猫、骆驼等。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人。在本文的一些实施方式中，所述哺乳动物被称为宿主。

在一些实施方式中，这些医学植入物可用于促进脊髓或周围神经损伤后的轴突再生。

在一些实施方式中，所述医学植入物包含三维植入物和任选的干细胞。在一些实施方式中，植入物通过3D打印产生。这些植入物可经定制设计以适配特定患者的解剖结构。术语“支架”和“植入物”可互换使用，并且是指具有或不具有干细胞的3D打印结构。

虽然生物工程支架或植入物支持轴突再生到脊髓或周围神经、病变部位，但是这些技术受限于植入部位的异物反应、繁琐的生产要求、扩展到人类大小的损伤的限制，以及缺乏对天然脊髓或周围神经的仿生。使用本文所述植入物的植入物和方法包括对脊髓或周围神经的复杂成束架构进行仿生的结构。可打印的植入物可以简单且快速地生产，减少异物反应，和/或支持穿过病变部位进行线性、对齐的宿主轴突再生。此外，神经干细胞可以加载到植入物中。干细胞可以支持宿主轴突再生，因为其穿过病变部位并桥连出去，并促进体内的功能性再生。

将脊髓用作模板以设计脊髓植入物(图1A)。包括微通道以提供植入物通道与损伤上方和下方的宿主轴突束的对齐(图1D至图1E)。脊髓的内部“灰质”区域通常没有在损伤部位下方突出的轴突，因此植入物的该部分，即芯，被设计为增强植入物结构完整性的实心区域(图1D)。琼脂糖微通道化的植入物的使用表明，80％的进入病变部位的宿主轴突可以通过线性或平行的导管引导以到达病变的相对(尾侧)端。然而，琼脂糖引起由基于胶原的反应性细胞层组成的异物反应，其将轴突减弱和捕获在植入物内，从而阻止轴突生长到通道外。因此，本文公开了由可降解材料的混合物制成的植入物，其由于异物反应的减少而减少反应性细胞层，从而允许宿主轴突更好地穿透并甚至穿过病变。

用于形成植入物的材料包括生物学上可接受的聚合物。在一些实施方式中，聚合物可包括基于聚乙二醇的聚合物，诸如但不限于聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和聚(乙二醇)二丙烯酰胺。在一些实施方式中，聚合物可包括甲基丙烯酰化明胶(GelMA)水凝胶。在一些实施方式中，聚合物可包括聚乙二醇二丙烯酸酯、聚(乙二醇)二丙烯酰胺和甲基丙烯酰化明胶的组合。在一些实施方式中，聚合物可包括聚乙二醇二丙烯酸酯和甲基丙烯酰化明胶的组合。在一些实施方式中，聚合物可包括聚(乙二醇)二丙烯酰胺和甲基丙烯酰化明胶的组合。

在一些实施方式中，将生物相容性材料PEGDA用作植入物材料。PEGDA本身对细胞不具有粘合性，因此包含一种保留细胞结合配体和基质金属蛋白酶降解位点的可光聚合的变性胶原，即甲基丙烯酰化明胶(GelMa)，以支持细胞附着到植入物壁和长期细胞活力。测试各材料的多种浓度和打印植入物的交联密度，直到鉴定出模拟天然脊髓或周围神经组织的力学性质的组合，因为植入物与宿主之间的力学性质不匹配可能导致脊髓或周围神经界面处的压迫或撕裂，从而导致整合失败。

3D生物打印的一个优点是能够快速打印不同大小和不规则形状的植入物，以符合可在磁共振成像(MRI)上识别的个体患者病变部位。如图3A至图3E所示，打印由PEGDA/GelMa形成的植入物以符合根据MRI的人脊髓病变腔的精确形状。已经打印了符合甚至复杂的人体损伤腔的形态的植入物。

本文公开的植入物包括芯和壳。芯类似于正常脊髓或周围神经的“灰质”部分，并且壳类似于正常脊髓或周围神经的“白质”部分。

植入物可包括一个或多个通道。在一些实施方式中，通道在壳中。在一些实施方式中，一个或多个通道从第一表面延伸到第二表面。在一些实施方式中，第一表面是顶表面，并且第二表面是底表面。在一些实施方式中，第一表面是底表面，并且第二表面是顶表面。在一些实施方式中，第一表面是第一侧表面，并且第二表面是第二侧表面。在一些实施方式中，第一表面是顶表面，并且第二表面是侧表面。在一些实施方式中，第一表面是底表面，并且第二表面是侧表面。

通道可具有有助于组织向内生长的横截面形状。在一些实施方式中，横截面形状可以是正方形、三角形、五边形、六边形、七边形、八边形、矩形、梯形、椭圆形、梅花形、具有任意数量的臂的星形、三叶草形、具有任意数量的臂的叶形，其他曲线或直线形状等，或它们的组合。在一些实施方式中，一组或一群(cluster)通道可具有蜂窝构造。

在一些实施方式中，单一植入物中可使用两种或更多种不同的通道横截面。在一些实施方式中，一些通道的横截面为矩形，一些通道的横截面为六边形(制成蜂窝结构)。可以使用实现治疗用途的任何组合。

在一些实施方式中，植入物可以装载有至少一种类型的干细胞。在一些实施方式中，所述至少一种类型的干细胞是神经干细胞。神经干细胞是胚胎干细胞、iPSC来源的干细胞，分化的干细胞、直接分化的神经干细胞(例如，从皮肤分化成神经元，而不经过干细胞状态)、表达GFP的神经干细胞，或它们的组合。在另一些实施方式中，至少一种类型的干细胞是间充质干细胞。可以将干细胞工程化以表达BDNF、NT3、GDNF，或它们的组合。

植入物可以几乎任何长度形成。在一些实施方式中，植入物可具有约1mm、约2mm、约3mm、约4mm、约5mm、约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约20mm、约30mm、约40mm、约50mm、在约2mm与约4mm之间、在约2mm与约10mm之间、或在约2mm与约20mm之间的长度。

在一些实施方式中，植入物可以形成为模拟脊髓架构的结构和形状。这些结构可包括但不限于轴突束(track)和通道。轴突束可以包括红核-红核脊髓束、缝核-缝核脊髓束、网状-网状脊髓束、本体-本体脊髓束、脊髓丘脑-脊髓丘脑束和CST-皮质脊髓束。

在一些实施方式中，植入物可包括到植入物中轴突的入口和出口，其在本文中被称为“通道”，其保持在整个病变部位中的3D坐标，从而与自然宿主架构匹配。

在一些实施方式中，植入物可具有大于约250kPa、大于约200kPa、大于约300kPa、在约250kPa与约300kPa之间，或在约200kPa与约300kPa之间的弹性模量。

在一些实施方式中，植入物是基本上生物稳定的。基本上生物稳定意为植入物在植入后3个月后、4个月后、5个月后、6个月后、1年后或5年后超过80％、90％、95％、99％或完全完整。

在一些实施方式中，植入物可以抵抗其表面上的胶原沉积。在一些实施方式中，当与由另一种聚合物或金属材料形成的植入物相比时，本文所述的植入物可以使胶原沉积减少大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％，或大于约95％。

在一些实施方式中，植入物可以抵抗植入部位处的反应性细胞沉积(或减小反应性细胞层的大小)。在一些实施方式中，当与由另一种聚合物或金属材料形成的植入物相比时，本文所述的植入物可以使反应性细胞层的大小减小大于约20％、大于约30％、大于约40％、大于约50％，或大于约60％。在一些实施方式中，当与由琼脂糖形成的植入物相比时，本文所述的植入物可以使反应性细胞层的大小减小大于约20％、大于约30％、大于约40％、大于约50％，或大于约60％。

在一些实施方式中，植入物可在植入后吸引最小的反应性细胞层，所述最小的反应性细胞层具有小于约400μm、小于约350μm、小于约300μm、小于约250μm、或在约400μm与约200μm之间的厚度。

在一些实施方式中，当与由另一种聚合物或金属材料形成的植入物相比时，所述植入物可以使植入部位的神经胶质瘢痕形成减少大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％，或大于约90％。神经胶质瘢痕形成(神经胶质增生)是涉及在中枢神经系统损伤后发生的星形胶质细胞增生的反应性细胞过程。在一些实施方式中，当与由琼脂糖形成的植入物相比时，植入物可以使植入部位的神经胶质瘢痕形成减少大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％，或大于约90％。

在一些实施方式中，当与未治疗的病变相比时，植入物可以使植入部位处的神经胶质瘢痕形成减少大于约20％、大于约30％、大于约40％、大于约50％，或大于约60％。

当与琼脂糖植入物相比时，本发明的植入物可以产生纵向地布置到通道中的胶质纤维，在所述通道中它们可以潜在地支撑延伸的轴突。

本文描述的植入物可以良好地血管化，从而允许血管渗透植入物。

此外，植入物可以允许轴突穿透植入物材料。该穿透与诸如基于琼脂糖的植入物的其他植入物不同，在所述其他植入物中轴突不能穿过在这些植入物周围存在的星形胶质细胞瘢痕。穿透本文描述的植入物的轴突可以与邻近的包鞘施万细胞相缔合。

在一些实施方式中，当植入物装载有至少一种类型的干细胞时，宿主轴突可以进入干细胞填充的通道，并在所述通道中线性地或平行地再生。在另一些实施方式中，宿主羟色胺能轴突可以从病变的头侧方向进入干细胞填充的通道，并在所述通道中线性地或平行地再生。在一些实施方式中，即使在不存在干细胞时，羟色胺能轴突也可以进入植入物并且在通道中线性地或平行地再生。然而，与含有干细胞的植入物相比，该再生可减少约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％，或约40％至约50％。

在一些实施方式中，再生宿主轴突可以到达植入物的尾侧部分。在一些实施方式中，与没有干细胞的植入物相比，当负载有至少一种类型的干细胞时，植入物导致到达植入物尾侧部分的轴突增多至少约50％、至少约80％、至少约100％，或至少约120％。

在一些实施方式中，植入物可以允许运动轴突离开通道的尾侧方向，以再生到病变远端的宿主脊髓或周围神经内。在另一些实施方式中，运动轴突可以在距病变多至约3.5mm、多至约2.5mm、或多至约4.5mm处保持为可检测的。

在一些实施方式中，本文描述的植入物中的通道可以容纳或募集不同直径的轴突。此外，在通道内再生的轴突可以是有髓鞘的。在一些实施方式中，当轴突在通道中形成时，突触可以在通道内的轴突与植入的神经干细胞的树突之间形成。突触可以是非对称的和/或为含有圆化囊泡的突触前的结。在一些实施方式中，形成的突触中的至少一部分可以是兴奋性的。

在一些实施方式中，宿主轴突可以再生到通道中，并与植入的神经干细胞的树突形成附着接触。

在一些实施方式中，本文描述的植入物可以提供运动诱发电位(MEP)响应的至少部分恢复。在直接刺激脊髓(磁性刺激或电刺激)后，记录来自肌肉的运动诱发电位。在一些实施方式中，这些MEP响应可以在包括手指和脚趾的手臂和/或腿中。当与空植入物相比时，装载有干细胞的植入物可以使MEP响应增大至约4倍至约10倍、约3倍至约10倍、约4倍至约8倍、或约3倍至约8倍。

在一些实施方式中，本文描述的植入物可以提供损伤后运动行为的至少部分功能改善。经由Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)运动量表测量啮齿动物的损伤后运动行为。量表(0-21)表示连续恢复阶段，并对关节运动、后肢运动、踏步、前肢和后肢协调、躯干位置和稳定性、爪子放置和尾部位置的组合进行分类。

在一些实施方式中，在植入后，植入物通道可以均匀地填充有干细胞。在一些实施方式中，在植入后，通道可以均匀地填充有神经干细胞。在一些实施方式中，干细胞可以占据植入物与宿主之间的界面。在一些实施方式中，通道中的干细胞来源的细胞可以表达神经元标记物，诸如但不限于Hu或NeuN。在另一些实施方式中，通道中的干细胞来源的细胞可以表达诸如但不限于Olig2的少突胶质细胞标记物，或诸如但不限于GFAP的星形胶质细胞标记物。在一些实施方式中，细胞可以表达上述中的两种或更多种。

令人惊讶的是，在一些实施方式中，脊髓来源的神经干细胞移植物中不存在羟色胺能神经元细胞体。在一些实施方式中，在脊髓来源的神经干细胞移植物中基本上不存在羟色胺能神经元细胞体。

在一些实施方式中，相对于植入空植入物的宿主，植入有本文所述的装载有至少一种类型的干细胞的植入物的宿主可表现出更短的MEP延迟。在一些实施方式中，植入有本文所述的装载有至少一种类型的干细胞的植入物的宿主可表现出与无损伤宿主中观察到的延迟非常相似的MEP延迟。在一些实施方式中，MEP延迟可在约9ms与约12ms之间，在约8ms与约10ms之间，在约8ms与约12ms之间，在约9ms与约10ms之间，或在约7ms与约13ms之间。

如所讨论的，在一些实施方式中，打印本文所述的植入物。生物打印功能组织通常面临许多挑战，其中包括缺乏适当的生物制造技术来构建引导细胞生长和促进组织成熟所必需的复杂3D微架构。常见的基于喷墨或挤出的生物打印方法使用喷嘴来沉积材料，从而允许打印诸如皮肤、软骨的简单2D结构和诸如血管、主动脉瓣和气管的简单3D结构。

在一些实施方式中，可以使用微尺度连续投影3D打印(μCPP)来制造本文所述的植入物。微尺度连续投影打印可以使用多种生物材料和细胞来制造复杂的3D架构。此类打印可以在不沿X和Y两个方向扫描的情况下完成(与基于喷嘴的方法不同)。因此，3D对象可以在Z方向上以一个连续打印制造。在一些实施方式中，可仅需要几秒钟来打印整个植入物。在一些实施方式中，植入物可在约1秒、约2秒、小于约2秒、小于约3秒、小于约4秒、小于约5秒、小于约10秒、小于约20秒，或小于约30秒内打印。在一个实施方式中，打印整个2mm植入物仅需要约1.6秒。此打印速率代表速度比传统喷嘴打印机快约1,000倍。

使用聚焦光进行聚合产生1μm的打印分辨率，相较于基于喷嘴的喷墨打印机提高了50倍。在基于喷墨或挤出的方法中，机械完整性可能受到液滴或线之间的人工界面的损害，并且可能在体内应用期间或之后引起机械故障。通过在Z方向上提供无分层分辨率，结构可不呈现由线性平台移动到新位置而诱发的这些平面现象(界面)。因此，如本文所述的μCPP可以改善3D打印植入物的机械完整性，并且以微尺度分辨率提供复杂3D仿生结构的快速制造。

在一些实施方式中，植入物以单个部分打印，以用于在脊髓横断或周围神经损伤部位处进行植入。在一些实施方式中，植入物以两个或更多个部分打印，由此可以用本文所公开的植入物治疗受损但未被横断的脊髓或周围神经。如果脊髓损伤(SCI)或周围神经损伤不是横断，则可以将植入物的一个或多个部分植入在存活组织周围，并且将这些部分使用生物学上可接受的粘合剂彼此粘附。因此，可维持任何存活的组织，并在损伤部位处促进宿主脊髓或周围神经的再生。

为每位患者定制植入物。在对患者脊髓或周围神经损伤进行成像后，使用CAD软件创建3D模型。然后使用该模型来打印适配并填充病变的患者特异性植入物。因此，有时没有必要按照如图1D中的设计来打印整个植入物。如果损伤没有整个脊髓那么大(部分病变)，则模型将小于图1D所示的模型。医生将对哪个部分或全部或病变部位可用植入物填充做出最终决定。例如，医生可决定仅打印通道部分(没有蝴蝶形状)。

在另一些实施方式中，基于脊髓或周围神经损伤打印3D打印的仿生植入物，并且仅在损伤部位处植入打印植入物的一部分。在一些实施方式中，仅植入蜂窝部分。

本文所述的植入物可以表现出体内稳定性并支持穿过严重(完全)SCI部位的轴突再生和髓鞘再生。美国有超过50万人患有SCI，这给患者和护理人员带来了巨大的心理和经济成本。使用本文描述的装置和方法的三维打印可以允许制造个性化植入物，所述个性化植入物“适配”个体损伤的精确解剖结构，以刺激、引导和对齐轴突再生。此外，植入物可以装载有神经干细胞，以产生进一步支持神经修复或髓鞘再生的植入物。

在一些实施方式中，宿主运动轴突可再生并通过仿生植入物跨越完整的脊髓或周围神经病变部位桥连进入远端脊髓或周围神经。

在另一些实施方式中，本发明的植入物和治疗方法可以支持在最具挑战性的SCI模型，即完全脊髓横断中恢复功能。

在一些实施方式中，快速3D打印和干细胞生物学的融合，即本发明的植入物，可通过提供患者特异性再生疗法来提供脊髓或周围神经治疗。

在一些实施方式中，本发明的植入物可促进脊髓或周围神经损伤后的轴突再生。

在一些实施方式中，本发明的植入物可以在1-20毫米或更长的距离上提供大于数百个受损宿主轴突的再生或髓鞘再生。在一些实施方式中，本发明的植入物可以在1-20毫米或更长的距离上提供大于数千个受损宿主轴突的再生或髓鞘再生。在一些实施方式中，本发明的植入物可在1-20mm、1-10mm、1-5mm、1-4mm、1-3mm、1-2mm、2-4mm、3-4mm、2-5mm、或3-5mm的距离上提供宿主轴突的再生或髓鞘再生。在一些实施方式中，本发明的植入物可以支撑这样的轴突，所述轴突可以延伸大于约50mm、大于约100mm、大于约150mm、大于约200mm或更长的距离。

在一些实施方式中，即使在完全脊髓或周围神经横断后，本发明的植入物也可为宿主提供功能改善。在一些实施方式中，本发明的植入物可以在导致受损线路“拼接”的干细胞植入后为宿主提供功能性益处，其中宿主轴突穿透移植物并与移植物中的神经元突触连接，并且移植物来源的轴突继而从病变部位延伸出并与损伤尾侧处的宿主椎管内或周围神经元突触连接。

在一些实施方式中，本发明的植入物可以优化从病变部位中的神经干细胞植入物中出现的轴突的功能实用性。在一些实施方式中，本发明的植入物可以使拼接的线路与它们的正确尾侧白质投影对齐。

在一些实施方式中，本发明的植入物可以为个体患者病变提供“定制配合”植入物。

还描述了制造本文所述植入物的方法。该方法可包括扫描需要治疗的区域和打印如本文所述的植入物的步骤。可以通过3D打印进行打印。

此外，描述了使用本文描述的植入物治疗病症的方法。所述病症可包括但不限于神经损伤、脊髓损伤、运动完全脊髓损伤、运动不完全脊髓损伤、周围神经损伤、肠功能障碍、失禁、阳痿、其他性功能障碍、疼痛、麻木、神经病、体温不调等，或它们的组合。这些病症中的某些是脊髓损伤的后遗症，因此治疗损伤部位和所述损伤部位处功能的恢复将治疗后遗症中的一种或多种。

在一个实施方式中，描述了用于治疗神经损伤的方法。用于治疗神经损伤的方法可包括扫描需要治疗的区域，打印如本文所述的植入物，将所述植入物植入到所述区域内的位置，以及治疗所述神经损伤。

在一个实施方式中，描述了用于治疗脊髓损伤的方法。用于治疗脊髓损伤的方法可包括扫描需要治疗的区域，打印如本文所述的植入物，将所述植入物植入到所述区域内的位置，以及治疗所述脊髓损伤。

在一些实施方式中，描述了用于治疗运动完全脊髓损伤的方法。用于治疗运动完全脊髓损伤的方法可包括扫描需要治疗的脊髓区域，打印如本文所述的植入物，将所述植入物植入到所述区域内的位置，以及治疗所述运动完全脊髓损伤。

在一些实施方式中，描述了用于治疗麻痹的方法。用于治疗麻痹的方法可包括扫描需要治疗的脊髓区域，打印如本文所述的植入物，将所述植入物植入到所述区域内的位置，以及治疗所述麻痹。

在一些实施方式中，描述了用于治疗由脊髓损伤引起的肠功能障碍的方法。治疗由脊髓损伤引起的肠功能障碍的方法可包括扫描需要治疗的脊髓区域，打印如本文所述的植入物，将所述植入物植入到所述区域内的位置，以及治疗所述由脊髓损伤引起的肠功能障碍。

在一些实施方式中，描述了用于治疗由脊髓损伤引起的阳痿的方法。用于治疗由脊髓损伤引起的阳痿的方法可包括扫描需要治疗的脊髓区域，打印如本文所述的植入物，将所述植入物植入到所述区域内的位置，以及治疗所述由脊髓损伤引起的阳痿。

在一些实施方式中，描述了用于治疗疼痛的方法。用于治疗疼痛的方法可包括扫描需要治疗的脊髓区域，打印如本文所述的植入物，将所述植入物植入到所述区域内的位置，以及治疗所述疼痛。

在一些实施方式中，描述了用于治疗周围神经损伤的方法。用于治疗完全或部分周围神经损伤的方法可包括扫描需要治疗的周围神经部位的区域，打印如本文所述的植入物，将所述植入物植入到所述区域内的位置，以及治疗所述周围神经损伤。

在一些实施方式中，所述位置可以是脊髓病变。

在一些实施方式中，所述位置可以是周围神经病变。

在一些实施方式中，治疗方法还可以包括使个体接受其他治疗方式。这些治疗方式可以包括训练装置或系统，所述训练装置或系统被配置为对受试者进行物理训练，从而在受试者身体因损伤而受损的部分中提供附加的神经信号。训练装置可以使用机器人、外骨骼、跑步机、手杖、助行器、拐杖，体重支撑系统、物理治疗，或它们的组合来辅助训练。

在一些实施方式中，治疗方法还可包括使轴突生长穿过植入物通道。

还描述了套件(kit)。所述套件可包括在统一容器中的植入物和使用说明书。

一些套件可包括在统一容器中的对需要治疗区域的扫描(scan)和使用说明书。

另一些套件可包括在统一容器中的对需要治疗区域的扫描、打印植入物所需的聚合物，以及使用说明书。

另一些套件可包括在统一容器中的对需要治疗区域的扫描，用于打印植入物的PEGDA和GelMa，以及使用说明书。

实施例1

使用大鼠脊髓作为模板来设计脊髓植入物。

本实施例中使用的植入物材料：PEGDA(Mn＝700Da)购自Sigma-Aldrich(USA)。如先前报道中所述合成甲基丙烯酰化明胶(GelMa)(Soman,P.等人，Biotechnol Bioeng 110:3038-3047,2013)。如先前所报道的合成光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚膦酸锂(LAP)(Fairbanks,B.D.等人，Biomaterials 30:6702-6707,2009)。用于打印植入物的基质材料是通过在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中混合7.5％(w/v)GelMa、25％(v/v)PEGDA和0.225％(w/v)LAP而制备的。

本实施例中使用的植入物3D打印：本文所述的3D生物打印机(μCPP)包括如图1A所示的以下六个部件：(1)用于光聚合的UV LED光源(365nm)；(2)数字微镜阵列装置(DMD)芯片(Texas Instruments)，其由用于光学图案生成的1920×1080个微镜组成；(3)投影光学器件，其用于将DMD芯片上的光学图案成像到平台上的制造平面；(4)自动平台，其承载用于制造的单体溶液；(5)数码相机，其用于实时监测制造过程和对制造过程进行成像；以及(6)计算机，其协调所述UV光源、所述DMD芯片、所述平台和所述相机进行3D打印过程。

本实施例中使用的大鼠脊髓植入物打印：通过处理脊髓的横截面图像而生成芯(表示脊髓的灰质)和壳(表示脊髓的白质)的数字图像，稍后将所述数字图像输入到DMD芯片中以在打印过程期间控制微镜。将通道(直径200μm)结合到壳中，以为轴突再生提供线性或平行的引导。将芯设计为GelMa、25％(v/v)PEGDA和0.225％(w/v)LAP的实心块，以增强打印植入物的机械强度。将基质材料的单体溶液装入具有2mm PDMS间隔物的贮存器中，以控制打印植入物的z轴高度。使用内部开发的用于控制3D打印机的软件来启动连续打印过程。将植入物分两步打印，每步0.8秒，一步用于壳图像，另一步用于芯图像。然后将打印的植入物从贮存器中取出并用无菌DPBS和抗生素(1％青霉素链霉素)冲洗三次。

本实施例中使用的人脊髓植入物打印：使用颈部MRI扫描来对典型的慢性脊髓损伤进行建模。对病变进行追踪，并使用3D脊髓计算机辅助设计(CAD)模型来匹配人体损伤尺寸。然后将3D模型沿脊髓的纵向方向切成一系列数字掩模，将其依次输入DMD芯片中。通过随着平台的移动动态地改变数字掩模，使用上述方法得到患者特异性脊髓植入物。

本实施例中使用的模板化琼脂糖支架的制作：从由聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)连续基质隔开的排列成六边形密堆积阵列的200μm直径的聚苯乙烯纤维(Paradigm Optics,Vancouver,WA)制成多组分纤维束(MCFB)模板。将其以66μm的间距排列成蜂窝阵列，以产生最终植入物，所述最终植入物的壁大小为66μm并且通道直径为200μm。将束同时挤出并熔合，使得聚苯乙烯纤维取向为平行于束的纵轴。将多组分纤维束模板修剪至长度为2mm并且横截面宽度和深度为1.5mm。使用环己烷将长度为1.5mm的聚苯乙烯端盖结合至纤维束末端，以锚定聚苯乙烯纤维并形成外部的刚性多组分纤维束模板。然后将六个这种多组分纤维束单元与两个聚苯乙烯侧盖串联对齐，从而粘着成线性模板阵列。然后通过在99.7％碳酸丙烯酯(Sigma-Aldrich)中浸渍三次，然后用95％乙醇冲洗并用蒸馏水冲洗，来选择性去除聚(甲基丙烯酸甲酯)基质。将超纯琼脂糖(30mg/ml，Sigma-Aldrich)溶于100℃的蒸馏水中，然后冷却至65℃。将多组分纤维束模板浸没到琼脂糖溶液中并离心(以300rpm进行30s)，以使琼脂糖渗透穿过堆积的聚苯乙烯纤维阵列。然后使琼脂糖铸件在室温下胶凝，进行修剪，并在室温下在99％四氢呋喃(Sigma-Aldrich)中浸渍24小时。将此步骤重复两次以去除聚苯乙烯模具，从而得到单独的自由浮动琼脂糖支架。将支架收集并依次在丙酮、95％乙醇和三次循环的无菌水中进行洗涤。将支架在室温下储存在无菌水中，直至使用。

本实施例中使用的E14神经干细胞的制备：简而言之，将来自表达GFP的E14F344胚胎的脊髓进行解剖，并取出脑膜。将组织用胰蛋白酶消化15分钟，然后在室温下以2,500rpm离心。将组织重悬于含有2％B27(Gibco)的NeuroBasal培养基(Gibco)中，并使用逐渐变小的火抛光巴斯德移液管轻轻捣碎该脊髓组织。然后将细胞以2,500rpm离心2min，重悬于含有B27的NeuroBasal培养基中，并使用40μm细胞过滤器滤网(filter strainer)进行过滤。

本实施例中使用的外科手术：严格遵循NIH实验室动物护理和安全指南。进行植入物到T3脊髓水平的完全横断中的植入。简言之，将动物深度麻醉，进行T3椎板切除术，然后使用显微手术剪和微量吸入的组合来进行脊髓横断。去除1.8mm的块并植入2mm长的植入物，由此植入物牢固地保持在脊髓的横断区段之间。第1组(n＝14)接受空琼脂糖支架，第2组(n＝14)接受空3D打印植入物，第3组(n＝14)接受装载有E14神经干细胞的3D打印植入物，所述E14神经干细胞悬浮在含有以下四组分生长因子混合物的纤维蛋白基质中：用于支持神经干细胞存活的50ng/μL BDNF(Peprotech)、用于促进血管生成的10ng/μL VEGF(Peprotech)和10ng/μL bFGF(Peprotech)，以及用于神经保护的50μM钙蛋白酶抑制剂MDL28170(Sigma)。第4组(n＝8)进行假手术，其中进行了损伤但没有植入植入物。第5组(n＝8)接受大鼠E14脊髓来源的多能神经祖细胞的植入，如先前所述(Lu,P.等人，Cell 150:1264-1273,2012)。将细胞悬浮在上述具有生长因子混合物的相同纤维蛋白原/凝血酶基质中。植入后，将背部肌肉和皮肤缝合，并施用抗生素和镇痛药。

设计微通道(直径200μm)以引导轴突并将轴突从它们在损伤上方的横断点与它们在损伤下方重新进入完整脊髓的正确点对齐(图1A至图1E)。内芯区域通常没有在损伤部位下方突出的轴突。因此，植入物的该部件被设计为实心区域，该实心区域增强了植入物的结构支撑。先前对琼脂糖微通道化植入物的研究表明，80％进入病变部位的轴突是由植入物引导的并桥连到病变的相对侧。然而，琼脂糖引起由基于胶原的反应性细胞层组成的异物反应，所述基于胶原的反应性细胞层将轴突减弱和捕获在植入物内，从而阻止轴突从通道脱出。因此，植入物由可降解材料制成，所述可降解材料由于异物反应的减少而可减少反应性细胞层，从而允许宿主轴突更好地穿透和穿过病变。使用两种生物相容性材料聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)和甲基丙烯酰化明胶(GelMa)的组合作为植入物材料。PEGDA对细胞不具粘性，因此加入保留细胞结合配体和基质金属蛋白酶(MMP)降解位点的可光聚合的变性胶原蛋白GelMa，潜在地增强长期细胞活力。每种材料的浓度和打印植入物的交联密度可经设计以模拟天然脊髓组织的力学性质，因为植入物与宿主之间的力学性质不匹配可导致脊髓界面处的压迫或撕裂，从而导致整合失败。

使用动态力学分析(DMA)来测量3D打印PEGDA/GelMa植入物的弹性模量。根据200-600kPa的天然脊髓弹性模量，用于植入的生物打印植入物的弹性模量在260kPa-300kPa的范围内(图2)。

进行免疫标记。将脊髓在以20μm间隔设置的低温恒温器上切片，并处理以进行：1)GFP标记，其用于评定移植细胞存活和分化以及轴突延伸(GFP兔多克隆，Invitrogen，稀释度为1:500)；2)神经细胞标记物，包括用于年轻神经元的Hu(人多克隆，稀释度为1:500)、用于成熟神经元核的NeuN(小鼠单克隆，Abcam，稀释度为1:500)、用于成熟神经元的MAP-2(小鼠单克隆，BD Biosciences，稀释度为1:500)、用于标记轴突的神经丝200(小鼠单克隆，Millipore，稀释度为1:500)、用于成熟神经元和轴突的羟色胺(5HT，山羊多克隆，ImmunoStar，稀释度为1:500)、用于星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白(GFAP，鸡多克隆，Millipore，稀释度为1:500)、用于少突胶质细胞的Olig2(Olig2，小鼠单克隆，IBL，稀释度为1:200)。3)用S100标记施万细胞(兔多克隆，Dako，稀释度为1:500)。4)IV型胶原蛋白(兔多克隆，Biogenex，稀释度为1:500)。对于一抗，将切片在室温下孵育过夜，然后在Alexa488、Alexa 594或Alexa 647缀合的山羊或驴二抗(1:250，Invitrogen)中在室温下孵育3小时。在200x总放大倍数下测量Nissl染色切片中反应性细胞层的厚度(对每只动物8个切片进行定量，其中结果表示为平均值±SEM)。将GFAP免疫反应性定量为在GFAP免疫标记切片上的宿主脊髓-植入物界面处测量的每像素平均灰度值(对每只动物8个切片进行定量，其中结果表示为平均值±SEM)。使用通道尾侧部分的400μm部分的200倍放大图像进行5HT运动轴突定量(对轴突进行手动计数，并对每只动物8个切片进行定量)。使用上述抗体定量通道内的干细胞分化。用DAPI和GFP对每个载玻片进行反标记，并对细胞进行手动计数。将每个细胞类型的数目归一化为通道中总的DAPI/GFP标记的核(对每只动物8个切片进行定量。使用ImageJ进行定量)。

统计分析——通过双尾学生t检验(JMP软件)以指定的显著性水平P<0.05来测试两组比较。在指定显著性水平P<0.05处通过单尾ANOVA(JMP软件)测试多组比较，然后使用Tukey检验进行事后分析。

电子显微镜——使用电子显微镜如下进行对轴突的突触形成和髓鞘形成的详细分析：向受试者灌输4％多聚甲醛和0.25％戊二醛，将脊髓用1％四氧化锇后固定，脱水，并包埋入在Durcupan树脂中。将0.5μm的半薄切片用甲苯胺蓝染色以获得一般形态。然后，使用超微切片机切割60nm切片，并使用UCSD CryoElectron Microscopy Core Facility的FEI 200KV Sphera显微镜进行观察。

扫描电子显微镜成像——使用扫描电子显微镜(SEM,Zeiss Sigma 500)对患者特异性脊髓植入物进行成像。将植入物在一系列乙醇浴中脱水，并用超临界点干燥器(Tousimis AutoSamdri 815A)干燥，然后使用Emitech K575X在85mA的沉积电流下用铱溅射涂覆7秒。在溅射涂覆之后，使用Zeiss Sigma 500SEM在5kV下对植入物进行成像。

功能分析——每周由两名不知道组身份的独立观察者评定BBB开放场21点运动评定量表。

电生理学——测量后肢中的MEP。简而言之，使用丙泊酚(100mg/kg，丙泊酚Abbot)麻醉动物。经颅电(使用DS3恒定电流隔离刺激器(Digitimer,Welwyn Garden City,UK)在9mV下达1ms的脉冲持续时间)使用两个经皮放置的30G不锈钢刺激电极。通过放置在两个后肢上的环形电极记录MEP，直到三至五个最高(稳定)记录的电位是相似的。在植入后第26周记录MEP。

在一些实施方式中，3D生物打印的一个优点是能够快速打印不同大小(图17A至图17B)和不规则形状的植入物，以符合个体患者的病变部位，如在手术前在MRI扫描上所识别出的。打印植入物以符合患者慢性病变腔的简明形状和大小，如图3A至图3E所示。

将生物打印的植入物植入大鼠脊髓完全T3横断部位中。这是用于脊髓再生研究的最具挑战性的模型和最严重的SCI模型。它也是用于研究轴突再生的模型，因为轴突在损伤时被切断，这与挫伤不同，所述挫伤中存在具有幸存轴突的保留组织的边缘，使得难以确定观察到的轴突是真正再生的轴突还是幸存或萌发的轴突。将十九只Fischer 344大鼠进行T3完全脊髓横断，并立即将2mm长的植入物置入病变部位中。8只对照动物仅具有病变。四周后，去除脊髓，并评定植入物结构、生物相容性和轴突再生/髓鞘再生。将发现与具有相同病变和存活时间的先前接受模板化琼脂糖植入物的动物进行比较。

植入后4周时，3D打印的PEGDA/GelMa植入物保持结构完整性：在所有动物中植入物的通道和实心芯保持它们在植入前的结构，而没有破裂或变形(图4)。在该四周时间点处，植入物生物降解尚不明显。使用诸如透明质酸的其他植入物材料的早先努力导致更快速的植入物降解和结构塌缩(图18A)。植入物降解经6个月的时间进行表征，表现出壁厚减少44μm，表明保留了66％的结构(图19)。保持植入物结构被认为对于保持对病变部位的物理支撑和支持、组织和对齐再生轴突的生长是必需的。

六个月后的解剖学分析显示，所有植入物都保留了它们的3D架构(图15A)；然而，与它们在植入前的大小相比，植入物的壁厚度减少了49％，表明随着时间推移的降解缓慢。在植入空植入物的动物中，宿主的神经丝标记轴突以相对中度的数目(118±8个)再生到植入物中，该数目类似于在植入后4周时观察到的数目(97±8个轴突)。在植入空植入物的动物中，宿主轴突在任何情况下都不会再生超出植入物并进入远端宿主脊髓。在植入装载有神经干细胞的3D仿生PEGDA/GelMa植入物的动物中，移植细胞在所述六个月期间存活并完全填充所有通道(图15)。未检测到巢蛋白标记，表明植入的神经干细胞的成熟完成，并且也未检测到Ki67标记，表明移植物完成了细胞分裂。如在第4周植入物中观察到的，5HT免疫反应性轴突进入植入物。87±5个羟色胺能轴突到达装载有神经干细胞的通道的尾侧端，并继续再生到尾侧脊髓中，类似于在植入后4周时观察到的轴突数量(图14B)；该观察结果表明到四周时羟色胺能轴突到植入物内的再生完成。通过将表达红色荧光蛋白(RFP)的AAV2载体注射到运动皮层中而顺行标记的宿主皮质脊髓运动轴突也再生到装载有干细胞的植入物内(图15B)并延伸到植入物中点，延伸了1mm的距离。皮质脊髓轴突在植入物通道内的NeuN标记神经元上形成推定的结样结构(图15C)。此外，移植来源的GFP标记轴突从植入物突出并进入损伤尾侧的宿主脊髓内，从而在病变尾侧的脊髓中的宿主神经元上形成推定的结样结构(图15D至图15E)。从植入物向外生长到远端宿主脊髓内的移植来源的轴突的量(图15D)大大超过再生到植入物外部的宿主羟色胺能轴突的数目；该观察结果表明，病变部位上恢复的神经继电物(如果存在的话)可以通过以下方式介导：宿主轴突再生到植入物内，突触连接到移植的神经干细胞，并且干细胞来源的轴突延伸到远端宿主脊髓内。

与模板化琼脂糖支架相比，接受3D打印植入物的动物中存在反应性细胞层的减弱，其表征为胶原沉积减少(图4B)和颗粒化组织减少(图5A)。反应性细胞层的厚度为340±52μm，与琼脂糖支架相比显著降低35％(P<0.05；图5A)。3D打印植入物还减弱了星形胶质细胞响应：在对照病变受试者中，星形胶质细胞变得具有反应性并且隔绝(walled off)病变部位(图6A)。在具有琼脂糖支架的动物中，星形胶质细胞的壁仍然存在并且隔离来自宿主脊髓的支架(图6B)。相比之下，3D打印的植入物表现出星形胶质细胞瘢痕厚度的减弱和瘢痕的重组，使得瘢痕不再中断从宿主脊髓到植入物通道的连续性(图6C)。在一些实施方式中，星形胶质细胞过程从在与宿主的界面处形成垂直壁转变为形成线性穿透植入物的链，再生宿主轴突与所述链相缔合。三维打印植入物表现出星形胶质细胞免疫反应性与琼脂糖支架相比降低66％，并且与仅病变动物相比降低97％(P<0.05；图6D)。植入物沿其整个长度变得容易且广泛地血管化(图7A至图7B)。

根据反应性细胞层厚度的减小，接近3D打印植入物的宿主轴突沿着脊髓的头侧-尾侧(下行)轴对齐，并且在没有偏转的情况下容易地穿透植入物的通道；这与在琼脂糖支架与宿主的界面处发生的频繁轴突不对齐和偏转形成对比(图8A至图8B)。来自周围神经系统的宿主施万细胞迁移到植入物内，并且对再生的宿主轴突进行包鞘或再髓鞘化(图9A至图9C)。

在一些实施方式中，本文所述的用于脊髓修复的植入物可以装载有可增强再生或髓鞘再生的细胞。因此，3D打印的植入物装载有表达GFP的大鼠神经干细胞，所述大鼠神经干细胞取自Fischer 344大鼠的第14天胚胎脊髓。通过直接注射将总共3×10⁶个细胞以8μl的体积装载到植入物内。对总共14只大鼠进行T3脊髓完全横断，去除1.8mm长的脊髓区段并植入2mm长的装载有神经干细胞的3D打印植入物。让动物存活四周，然后处死以评定植入物完整性、细胞存活和宿主轴突再生以及髓鞘再生。

在一些实施方式中，干细胞在每个移植动物中存活并填充植入物通道(图10A、图20A至图20D)。神经干细胞也存在于植入物与宿主脊髓之间的界面处，而不会使植入物或宿主脊髓结构变形(图20A至图20D)。在测试的样品中，47±2％的移植干细胞表达早期神经元标记物Hu(图21A)，20±3％的移植细胞表达成熟神经元标记物NeuN(图521B)，11±2％的细胞表达少突胶质细胞标记物Olig2(图21C)，并且21±3％的细胞表达星形胶质细胞标记物GFAP(图21D和图22)。未检测到干细胞状态标记物巢蛋白。

宿主轴突容易地穿透植入物(通过不存在GFP报道子表达而与移植来源的轴突区分)(图10B)。许多宿主长束羟色胺能轴突也容易地穿透装载有干细胞的3D打印植入物，并根据通道取向而线性化(图10C)。干细胞移植物不能使穿透轴突线性化(图23)。引导5HT轴突再生到植入物的尾侧端(图10E)。相比之下，几乎没有羟色胺能轴突到达空植入物(没有干细胞填充)或干细胞移植物的尾侧端。(图24A至图24B)。定量出每个动物的每个植入物的加载有干细胞的通道的尾侧400μm内有平均85±21个羟色胺能轴突，而空3D打印植入物中为11±5个轴突。在具有没有植入物的干细胞移植的动物中，到达病变部位的末端的羟色胺能轴突的平均值为8±4个轴突，与含有植入物的干细胞移植相比轴突数目减少了10倍(P<0.05ANOVA，P<0.05Tukey事后比较，比较了具有干细胞的植入物与没有干细胞的植入物；图10F)。因此，在一些实施方式中，含有神经干细胞的3D打印植入物可增强宿主轴突到病变部位的尾侧端的再生。在另一些实施方式中，该增强可为显著的和大量的。

在一些实施方式中，宿主羟色胺能运动轴突完全穿过病变部位/植入物再生，并重新进入尾侧脊髓(图10G)。位于病变尾侧的宿主脊髓中的羟色胺能轴突不是移植来源的，因为植入物中的神经干细胞没有5HT(羟色胺)免疫标记并且这些轴突没有GFP标记(图25)。在距离植入物尾侧边缘2mm处，在宿主脊髓的白质和灰质中检测到了羟色胺能轴突，并且所述羟色胺能轴突频繁分支进入灰质(图26A至图26C)。在病变部位外多至3.5mm处检测到宿主长束羟色胺能轴突(图10H)，而在超出3.5mm处未检测到，进一步支持了这些轴突是再生轴突的事实。在一些实施方式中，本发明的植入物和装置可以提供宿主运动轴突到植入于完全脊髓横断部位中的植入物内的再生和超出所述植入物的再生。通道和宿主尾侧脊髓中存在GAP43免疫标记的轴突进一步证实了再生(图27A至图27B)。

在一些实施方式中，组织工程的一个障碍是器官血管化。甲苯胺蓝和电子显微镜分析证明了本文所述的植入物通道内的广泛血管化(图28A至图28B)。在这些血管周围的血小板衍生生长因子受体(PDGFR)免疫标记的呈现证实了周细胞的存在和血脑屏障的恢复(图29)。对填充有神经干细胞的通道中的轴突的电子显微镜分析证明了一系列轴突径和髓鞘化状态，从小的无髓鞘轴突(<1μm直径)到大的有髓鞘轴突(1-3μm，图11)。甲苯胺蓝染色显示少突胶质细胞对这些轴突进行髓鞘化(图12)。因为植入物装载有表达成熟神经元标记物NeuN的神经干细胞，所以存在在植入物通道中的再生宿主轴突与神经元之间形成突触的潜能。在一些实施方式中，容易观察到不对称突触，所述不对称突触接受来自含有圆化突触囊泡的轴突的输入，这是兴奋性突触典型的(图13)。再生到通道内的宿主羟色胺能轴突可以与干细胞来源的神经元的树突密切缔合，这通过MAP2和GFP共标记被鉴定出(图14)，也表明了突触的形成。

使用两个独立的测试来测量功能和行为结果。植入后二十六周时，通过对运动皮层施加经颅电刺激进行电生理学研究，并记录来自后肢的运动诱发电位(MEP)。可使用MEP来测试功能的电生理恢复(在人和动物中)，以通过记录来自肌肉的EMG信号来测试对周围神经系统上的脑的脊髓上控制。损伤后二十六周时，植入了装载有神经干细胞的3D打印植入物的大鼠表现出MEP响应的恢复，所述MEP响应的恢复在C8脊柱水平(植入部位上方；T3)处的脊髓再次横断时被消除。这些数据表明后肢中的肌肉活动是通过穿过植入物的来自宿主的突触传递产生的(图15A至图15E，图31)。因此，在一些实施方式中，所描述的植入物可以提供穿过所述植入物的来自宿主的突触传递，以在后肢中提供肌肉活动。

由于后肢被去除神经支配并且所述动物不以后肢支撑体重，所以肌肉变得萎缩，并且存在更少的可进行响应的肌单位。这解释了未损伤动物与实验动物之间的量级差异(图15A至图15E)。与该观察结果一致，MEP的幅度显著大于具有空植入物的动物(p<0.05，图15E)。此外，记录的MEP的延迟(到最大幅度的时间)在干细胞植入物中更短，并且更接近观察到的完整延迟(ANOVA p<0.01，图30)。

为了确定3D仿生PEGDA/GelMa植入物对运动功能的恢复程度，在6个月的时段内使用Beattie Basso Bresnahan(BBB)运动量表来评定动物，直至行为达到平台并且稳定。与具有空植入物的动物相比，接受装载有神经干细胞的植入物的动物表现出显著的功能恢复。

在损伤后的前四周，在病变对照和移植受试者中后肢运动均(例如，严重地)受损。在第五周，植入了装载有NSC的植入物的接受者开始显示出BBB量表改善，达到7级，指示绕后肢的每个关节的运动，与在病变对照中的最小运动(如果有任何运动的话)不同(重复测量ANOVA p<0.01；各个时间点*p<0.01；图16)。

在六个月前接受了植入物中的神经干细胞的动物在BBB量表上的功能评分达到6.6+0.5分(+SEM)的平均值，指示绕后肢的每个关节的运动，相比之下，空植入物对照中的平均评分为0.3+0.2分，反映绕仅一个关节的不一致运动(*p<0.01，重复测量ANOVA；对各个时间点的t检验和Tukey事后比较；图15F)。通过测量响应于对脑的电刺激而来自后肢的肌原性MEP，经由穿过完全横断部位的电生理学传递来进一步研究神经继电物的形成(图15G、图16A至图16C)。

在损伤后六个月时，植入了装载有神经干细胞的3D仿生PEGDA/GelMa植入物的大鼠表现出运动诱发反应的恢复，而植入空植入物的动物表现出在基线噪声范围内的反应(p<0.01，t-检验；图15G和图16D)。在C8水平(植入部位上方)处重新横断脊髓导致后肢中的所有诱发电位丧失(图16A至图16C)，证实了穿过病变形成了新的电生理学继电物。

该研究证明了使用快速3D打印来打印仿生中枢神经系统结构。这些植入物可以针对特定的病变形状和长度而容易地个性化。三维打印的PEGDA/GelMa植入物可在体内维持其结构达至少26周。此外，所描述的打印植入物可以支持神经干细胞的移植。此外，所描述的打印植入物可以支持新突触的形成。在一些实施方式中，植入物变成良好血管化的，从而提供足够可用的血液、氧和营养物来支持连贯的细胞和轴突存活。

前述公开内容是说明性实施方式。本领域技术人员应该理解，本文公开的装置、技术和方法阐明了在本公开的实践中良好作用的代表性实施方式。然而，本领域技术人员应当根据本公开内容理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方式进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。

除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示成分的量、性质(诸如分子量)、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，所述近似值可以根据本发明寻求获得的所需性质而变化。无论如何并非试图限制权利要求书范围的等同物的原则的应用，每个数值参数应至少根据报告的有效位的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实施例中列出的数值是尽可能精确报告的。然而，任何数值固有地含有必然由其各自相应的测试测量中存在的标准偏差引起的某些误差。

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权利要求中术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开支持仅涉及替代方案和“和/或”的定义。

本文公开的本发明的替代要素或实施方式的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独地或与该组中的其他成员或本文中找到的其他要素任意组合地被提及和要求保护。预期组中的一个或多个成员可以出于方便和/或可专利性的原因而被包括在组中或从组中删除。当发生任何此类包括或删除时，本说明书在此被视为包含经修改的组，从而满足对所附权利要求书中使用的所有马库什组的书面描述。

本文描述了本发明的优选实施方式，包括本发明人已知的用于实现本发明的最佳方式。当然，对于本领域普通技术人员来说，在阅读前面的描述后，那些优选实施方式的变型将变得显而易见。本发明人希望本领域普通技术人员适当地采用此类变型，并且本发明人希望以不同于本文具体描述的方式实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的本文所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或明显与上下文相矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能变型的任何组合。

本文公开的具体实施方式可以在权利要求中使用由......组成或基本上由……组成的语言来进一步限制。当在权利要求中使用时，无论是原始提交还是按照修正添加，过渡术语“由...组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡术语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤，以及不会对基本和新颖特征产生实质性影响的那些材料或步骤。如此要求保护的本发明的实施方式在本文中被固有地或明确地描述和实现。

此外，应理解，本文公开的本发明的实施方式是对本发明原理的说明。可以采用的其他修改在本发明的范围内。因此，举例来说而非限制，可以根据本文的教导使用本发明的替代配置。因此，本发明不被限制为如精确地所示和所描述的。

Claims (19)

1.一种用于脊髓或周围神经损伤的仿生植入物，所述植入物包括：

三维(3D)植入物，其包括第一端和第二端并且包括芯和壳并且模拟所述损伤的部位的结构，

至少一个通道，其在所述壳中始于所述第一端并终止于所述第二端，以及

至少一种类型的干细胞，其包含在所述至少一个通道中。

2.根据权利要求1所述的植入物，其中植入物通过3D打印产生。

3.根据权利要求1所述的植入物，其中所述至少一种类型的干细胞是神经干细胞。

4.根据权利要求3所述的植入物，其中所述神经干细胞是胚胎干细胞、iPSC来源的干细胞、直接分化的神经干细胞，或它们的组合。

5.根据权利要求1所述的植入物，其中所述至少一种类型的干细胞是间充质干细胞。

6.根据权利要求1所述的植入物，其中所述干细胞经工程化以表达BDNF、NT3、GDNF，或它们的组合。

7.根据权利要求1所述的植入物，其中三维打印植入物包括聚乙二醇二丙烯酸酯或甲基丙烯酰化明胶，或它们的组合。

8.根据权利要求1所述的植入物，其中所述植入物是脊髓仿生的。

9.根据权利要求1所述的植入物，其中所述植入物是周围神经仿生的。

10.根据权利要求1所述的植入物，其中所述通道是线性的。

11.根据权利要求1所述的植入物，其中所述通道是相互平行的。

12.根据权利要求1所述的植入物，其中所述通道引导轴突从所述第一端再生到所述第二端。

13.根据权利要求1所述的植入物，其中所述植入物包括具有聚集为蜂窝结构的六边形横截面的两个或更多个通道。

14.一种治疗有此需要的宿主的神经损伤的方法，所述方法包括：

将权利要求1所述的仿生植入物植入到需要治疗的位置；以及

使所述损伤的部位处的细胞再生。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述神经损伤是脊髓损伤、运动完全脊髓损伤、运动不完全脊髓损伤，或周围神经损伤。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述神经损伤是脊髓损伤。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述神经损伤是周围神经损伤。

18.根据权利要求13所述的方法，所述方法还包括向所述宿主提供物理治疗。

19.一种制造根据权利要求1所述的仿生植入物的方法，所述方法包括：

扫描需要治疗的宿主中的脊髓或周围神经位置，以确定损伤区域；以及

三维打印所述植入物以覆盖所述损伤区域。