CN114366383A - 促进脊髓损伤后轴突定向延伸的仿生脊髓支架 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及医疗器械领域，提供一种促进脊髓损伤后轴突定向延伸的仿生脊髓支架，所述仿生脊髓支架包括：至少两层基体层，所述基体层承载有骨髓间充质干细胞；及至少一层支撑层，所述支撑层设置于所述至少两层基体层之间，所述支撑层用于支撑所述至少两层基体层，所述支撑层包括间隔排列的多个支撑单元，所述多个支撑单元之间形成孔隙；所述支撑单元承载有雪旺细胞，所述孔隙用于引导轴突定向延伸。本申请提供的促进脊髓损伤后轴突定向延伸的仿生脊髓支架，能够模拟脊髓结构的结构和功能，促进骨髓间充质干细胞向神经元方向分化，引导突轴定向延伸。

Description

促进脊髓损伤后轴突定向延伸的仿生脊髓支架
技术领域
本申请涉及医疗器械技术领域，具体地讲，涉及促进脊髓损伤后轴突定向延伸的仿生脊髓支架。
背景技术
脊髓损伤是一种永久性的破坏性疾病，与高残疾、低预后和高成本有关。脊髓损伤后的功能恢复主要集中在神经元的再生和轴突的生长。然而，单一的治疗策略，如细胞移植，不能有效、长期和稳定的发挥作用，以至于不能适应多变的微环境。因此，建立细胞移植联合组织工程策略是必不可少的。
二维细胞支架培养的细胞生长表现出明显的瓶颈效应，二维空间和细胞间竞争的抑制限制了细胞的增殖和生长。由于脊髓组织解剖结构和生物功能的复杂性，组织工程材料的选择范围受到有效性和安全性的限制，目前适用的仿生性材料，因其无法近似模拟脊髓结构的结构和功能，导致其修复效果欠佳。
发明内容
鉴于此，本申请提出促进脊髓损伤后轴突定向延伸的仿生脊髓支架，能够模拟脊髓结构的结构和功能，促进骨髓间充质干细胞向神经元方向分化，引导突轴定向延伸。
第一方面，本申请提供一种促进脊髓损伤后轴突定向延伸的仿生脊髓支架，所述仿生脊髓支架包括：
至少两层基体层，所述基体层承载有骨髓间充质干细胞；及
至少一层支撑层，所述支撑层设置于所述至少两层基体层之间，所述支撑层用于支撑所述至少两层基体层，所述支撑层包括间隔排列的多个支撑单元，所述多个支撑单元之间形成孔隙；所述支撑单元承载有雪旺细胞，所述孔隙用于引导轴突定向延伸。
在一种可行的实施方案中，所述仿生脊髓支架满足以下特征a～g中的至少一种：
a.所述支撑单元为球状、纤维状或柱状；
b.相邻两层基体层之间的距离为150um至250um；
c.间隔排列的相邻两个支撑单元之间的间距为150um至250um；
d.所述基体层包括多个交错分布排列的纤维丝；
e.所述基体层包括多个平行排列的纤维丝；
f.所述孔隙的直径为180um至220um；
g.所述孔隙的延伸深度为2mm至2.2mm。
在一种可行的实施方案中，所述仿生脊髓支架由三维打印技术打印形成。
在一种可行的实施方案中，用于打印所述仿生脊髓支架的材料包括含嫁接官能团的水凝胶。
在一种可行的实施方案中，用于打印所述仿生脊髓支架的材料包括含嫁接官能团的明胶和蓝光引发剂。
在一种可行的实施方案中，用于形成所述基体层的打印材料包括骨髓间充质干细胞与甲基丙烯酸酐化明胶。
在一种可行的实施方案中，用于形成所述支撑层的打印材料包括雪旺细胞与甲基丙烯酸酐化明胶。
在一种可行的实施方案中，所述仿生脊髓支架包括第一基体层、第二基体层及第三基体层，所述第一基体层与所述第二基体层之间设有两层支撑层，所述第二基体层与所述第三基体层之间设有两层支撑层；
所述第一基体层、所述第二基体层及所述第三基体层承载有骨髓间充质干细胞，所述两层支撑层承载有所述雪旺细胞；
所述骨髓间充质干细胞由于重力作用聚集至位于所述仿生脊髓支架中央的孔隙内，并分化形成神经元；
所述雪旺细胞聚集在所述骨髓间充质干细胞周围，并分化形成少突胶质细胞，并使得包绕于所述神经元周围的少突胶质细胞继续分化形成脊髓神经纤维结构。
在一种可行的实施方案中，所述仿生脊髓支架的表面具有亲水性。
本申请的技术方案至少具有以下有益的效果：
本申请提供的仿生脊髓支架，所述仿生脊髓支架包括基体层及设置于基体层之间的支撑层，所述支撑层包括间隔排列的多个支撑单元，所述多个支撑单元之间形成孔隙；通过基体层来承载骨髓间充质干细胞，在孔隙内填充雪旺细胞，孔隙用于引导轴突定向延伸。仿生脊髓支架具有机械强度和力学性能良好，能够填充损伤区域维持脊髓轮廓结构，可以促进具有相对空间位置的干细胞定向分化，骨髓间充质干细胞向神经元方向分化，而雪旺细胞向少突胶质细胞分化进而分化为髓鞘。
附图说明
图1为本申请实施例提供的仿生脊髓支架的结构示意图；
图2为本申请实施例提供的仿生脊髓支架的另一角度的结构示意；
图3为本申请实施例提供的仿生脊髓支架的另一角度的结构示意；
图4为本申请提供的仿生脊髓支架的中的细胞分布示意图；
图5a为本申请实施例提供的仿生脊髓支架的体外降解测试结果示意图；
图5b为本申请实施例提供的仿生脊髓支架的体内降解测试结果示意图；
图5c为本申请实施例提供的仿生脊髓支架的脑源性神经营养因子释放曲线；
图5d为本申请实施例提供的三维仿生脊髓支架与二维仿生脊髓支架的生物降解比对结果示意图；
图5e为本申请提供的仿生脊髓支架的qPCR实验测试图；
图5f为本申请提供的仿生脊髓支架的细胞活动测试图；
图5g为本申请提供的仿生脊髓支架的细胞计数统计曲线分析图；
图6a为本申请提供的仿生脊髓支架的傅里叶红外光谱图；
图6b为本申请提供的仿生脊髓支架的热重分析结果图；
图6c为本申请提供的仿生脊髓支架的杨氏模量结果图；
图6d为本申请提供的仿生脊髓支架的蠕变测试结果图；
图6e为本申请提供的仿生脊髓支架的亲水性测试图；
图6f为本申请提供的仿生脊髓支架的电阻率测试结果图；
图7为本申请提供的仿生脊髓支架的扫描电镜图；
图8a为本申请提供的仿生脊髓支架以及各对照组的大鼠后肢运动功能的恢复情况评分图；
图8b为本申请提供的仿生脊髓支架以及各对照组的细胞扫描电镜图；
图9a、图9b以及图9c为本申请实施例提供的大鼠脊髓损伤部位的免疫学测试结果示意图；
图10为本申请实施例提供的大鼠脊髓空洞区域的细胞免疫荧光染色的结果示意图；
具体实施方式
以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
本申请实施例提供了一种促进脊髓损伤后轴突定向延伸的仿生脊髓支架，如图1至图3所示，所述仿生脊髓支架包括：
至少两层基体层1，所述基体层1承载有骨髓间充质干细胞；及
至少一层支撑层2，所述支撑层设置于所述至少两层基体层之间，所述支撑层用于支撑所述至少两层基体层，所述支撑层2包括间隔排列的多个支撑单元21，所述多个支撑单元21之间形成孔隙22；所述支撑单元21承载有雪旺细胞，所述孔隙22用于引导轴突定向延伸。
本申请提供的促进脊髓损伤后轴突定向延伸的仿生脊髓支架，通过基体层来承载骨髓间充质干细胞，在孔隙内填充雪旺细胞，孔隙用于引导轴突定向延伸。仿生脊髓支架具有机械强度和力学性能良好，能够填充损伤区域维持脊髓轮廓结构，可以促进具有相对空间位置的干细胞定向分化，骨髓间充质干细胞向神经元方向分化，而雪旺细胞向少突胶质细胞分化进而分化为髓鞘。
作为本申请可选的技术方案，所述仿生脊髓支架由三维打印技术打印形成。通过研究发现，运用3D打印技术打印成型的仿生脊髓支架，可以促进细胞存活率和粘附生长，并且对细胞增殖没有任何明显的限制，而且可以帮助干细胞更好的分化。所述仿生脊髓支架能够模拟脊髓组织的功能，可以模拟仿生脊髓支架内的细胞的相对空间位置。
作为本申请可选的技术方案，用于打印所述仿生脊髓支架的材料包括含嫁接官能团(MA)的明胶水凝胶。可以理解地，由于仿生脊髓支架的成分简明清晰，具有低免疫源性，有利于减轻移植物免疫排斥反应。
具体地，可以通过调整水凝胶的材料类型从而达到不同的修复效果，如：载生长因子和肝素的泊洛沙姆温敏型水凝胶，可以显著提高细胞对神经生长因子的摄取效率，对脊髓损伤大鼠模型中胶质瘢痕的形成有明显的抑制作用。
可以通过添加不同的辅助因子来达到修复效果，如：搭载脑源性生长因子或血管内皮生长因子的聚乳酸乙醇酸水凝胶与抗Nogo受体的抗体混合物，通过下调Rho GTP酶的活性，降低损伤部位Rho GTP酶以及胶质细胞原纤维酸性蛋白的表达水平，抑制星形胶质细胞在损伤边缘聚集，减少胶质瘢痕的形成。
可以往仿生脊髓支架内移植不同细胞，如：注射脂肪干细胞脂肪促进神经丝蛋白表达水平并减少胶质瘢痕形成，促进轴突再生。
在一种具体的实施方式中，用于打印所述仿生脊髓支架的材料包括含嫁接官能团的明胶和蓝光引发剂。具体地，明胶为甲基丙烯酸酐化明胶(简写为GelMA)，通过3D打印技术打印得到的仿生脊髓支架，具有单方向孔隙。在脊髓组织中，神经元主要分布在中央灰质区域，神经支持细胞主要分布在周围白质区域内。本申请提供的仿生脊髓支架，将骨髓间充质干细胞(简写为BMSCs)和雪旺细胞(简写为RSCs)固定在仿生脊髓支架的固定位点，可以提高仿生脊髓支架的仿生性能。具体如下：
1.所述仿生脊髓支架表面具有亲水性，有利于培养基湿润和营养物质交换。
2.所述仿生脊髓支架具有稳定缓释能力，有利于神经营养因子和干细胞的释放。
3.所述仿生脊髓支架具有良好的导电性，有利于神经电信号的传导。
4.所述仿生脊髓支架具有良好的生物相容性，有利于细胞的增殖并维持其分化潜能。
本申请的仿生脊髓支架将骨髓间充质干细胞(BMSCs)和雪旺细胞(RSCs)加载到特定的支架位置。利用重力作用使BMSCs聚集在孔隙中央进而分化为神经元，利用扩散作用使RSCs聚集在BMSCs周围进而分化为少突胶质细胞继而分化为髓鞘，模拟脊髓结构中神经元和支持细胞的相对空间位置，建立细胞间连接，促进干细胞定向分化，并引导轴突沿单方向孔径定向延伸，从而达到修复脊髓损伤的目的。
所述支撑单元21可以为球状、纤维状或柱状，当然也可以是其它形状，在此不做限定，只要能够支撑基体层1即可。现有的三维打印材料具有水凝胶溶胀效应，即水凝胶一类的材料在移植后，都会因为吸取组织间的一部分水分而发生膨胀，在移植后，脊髓组织可能会因此而收到压迫，造成二次损伤，在本方案中，通过将多个支撑单元21间隔排列，即使支撑单元21吸取组织间的水分发生膨胀，其膨胀后会使得支撑单元21之间的间隙减少，但不会造成压迫，支撑单元21之间的间隙能够改善溶胀效应，有利于维持孔隙结构。
在实际三维打印过程中，用于形成所述基体层1的打印材料包括骨髓间充质干细胞与甲基丙烯酸酐化明胶。用于形成所述支撑层2的打印材料包括雪旺细胞与甲基丙烯酸酐化明胶。即将上述材料混合即分别可得到打印材料。
进一步地，可以根据医疗影像数据获取待修复的脊髓半切数字模型，进一步根据3D打印技术打印得到仿生脊髓支架，该支架具有适合神经元轴向再生延伸的结构尺寸和其含有的孔隙的孔径。支架中这两种类型的细胞长时间保持在稳定的相对位置。将打印得到的支架植入至待修复部位即可。由于3D打印得到的仿生脊髓支架中的骨髓间充质干细胞与雪旺细胞长期保持在相对固定的位置，它们的相互作用靶向抑制骨髓间充质干细胞向星形胶质细胞分化，促进向神经元分化。同时，雪旺细胞受到具有相对空间位置的骨髓间充质干细胞的作用，其中大部分分化成少突胶质细胞，进一步分化成髓鞘，并包绕在再生神经元的轴突，形成一个郎飞氏结结构，形成有髓神经纤维。
作为本申请可选的技术方案，相邻两层基体层1之间的距离为150um至250um；具体可以是150um、160um、170um、180um、190um、200um、210um、220um、230um、240um或250um，在此不做限制。
作为本申请可选的技术方案，间隔排列的相邻两个支撑单元之间的间距为150um至250um；具体可以是150um、160um、170um、180um、190um、200um、210um、220um、230um、240um或250um，在此不做限制。
在一些实施例中，所述基体层1可以包括多个交错分布排列的纤维丝；在其他实施例中，所述基体层1也可以包括多个平行排列的纤维丝。
在一些实施例中，支撑层2中的支撑单元21沿基体层1的表面依次间隔排列，其形成的孔隙尽量具有单一的延伸方向，从而可以诱导轴突的定向延伸。所述孔隙的直径为180um至220um；具体可以是180um、185um、190um、195um、200um、205um、210um、215um或220um等，在此不做限制。所述孔隙的延伸深度为2mm至2.2mm，具体可以是2mm、2.05mm、2.1mm、2.15mm、2.18mm或2.2mm等，在此不做限定。
在一种具体的实施方式中，如图3所示，所述仿生脊髓支架包括第一基体层11、第二基体层12及第三基体层13，所述第一基体层11与所述第二基体层12之间设有两层支撑层21，所述第二基体层12与所述第三基体层13之间设有两层支撑层21；所述第一基体层11、所述第二基体层12及所述第三基体层13承载有骨髓间充质干细胞，所述两层支撑层21承载有所述雪旺细胞；所述骨髓间充质干细胞由于重力作用聚集至位于所述仿生脊髓支架中央的孔隙内，并分化形成神经元；所述雪旺细胞聚集在所述骨髓间充质干细胞周围，并分化形成少突胶质细胞，并使得包绕于所述神经元周围的少突胶质细胞继续分化形成髓神经纤维结构。
如图4(a)所示，在仿生脊髓支架结构中，骨髓间充质干细胞和雪旺细胞被装载在支架的特定位置，具有稳定的空间位点，规律排列。如图4(b)所示，具有相对空间位置的两种干细胞相互作用，RSCs促进BMSCs向神经元方向分化，并延伸出轴突。如图4(c)所示，在脊髓组织中，神经元主要分布在中央灰质区域，神经支持细胞主要分布在周围白质区域。在仿生脊髓支架结构中，骨髓间充质干细胞(BMSCs)和雪旺细胞(RSCs)加载到特定的支架位置，利用重力作用使BMSC聚集在孔径中央，利用扩散作用使RSCs聚集在BMSCs周围，模拟脊髓组织中神经细胞的相对空间位置。同时，支撑层中装载的雪旺细胞可以分泌神经营养因子和促轴突生长物质，同时作用引导轴突定向延伸。
以下通过具体实施例对本方案进行进一步地解释：
实验方法、材料及结果
1.仿生脊髓支架的制作：
首先，将10％GelMA水凝胶冻干粉(GelMA，SP-BI-G01-2，SunP(北京)生物技术有限公司)与0.25％的亮氨酰氨基肽酶(LAP)重组蛋白进行混合，并分别添加1*106/ml BMSCs和RSCs到其中，形成用于打印基体层的第一打印墨水(含BMSCs)，以及用于打印支撑层的第二打印墨水(含RSCs)。调试3D打印机(SUNPBiomaker，SunP(北京)生物技术。有限公司)实现喷嘴温度28℃，平台温度10℃，打印速度3mm/s，紫外线消毒灭菌。将完成的生物打印墨水放入针管中，针头尺寸为23G(内径约350um)。启动打印流程。打印后，将3D支架放置在距蓝色光源(405nm)2-3cm的距离处，并将其交联固化15秒。然后放入培养基，置于37℃，在体积分数5％CO2下加入培养液进行常规培养。
2.同源干细胞的提取：
眼钳沿腹股沟抬起大鼠的皮肤，眼剪剪断腹股沟的皮肤，露出腿部肌肉，从关节处切开大鼠大腿。取出附着在骨表面的软组织，放入另一个无菌培养皿中。用无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗创口。眼科剪刀切断两端骨骺，露出骨髓腔，置于含10％胎牛血清的10ml菌培养皿中，取新鲜的含各种氨基酸和葡萄糖的培养基(DMEM)全培养液。取出1ML注射器，用钳举一端，用注射器抽吸全培养液将骨髓腔冲洗至另一培养皿中，从一段骨髓腔中冲出骨髓，重复3次，然后反方向冲出骨髓，重复3次，直至骨髓腔冲洗液变清。
将细胞悬液输送到分散细胞中，将骨髓悬液收集在15mL离心管中，并室温下1000r/min离心5min。离心后，取上清液，用6mL完全培养液重新悬浮，轻轻移液制成单细胞悬液，转移至25cm2培养瓶中，轻轻摇匀；将培养瓶置于37℃，在体积分数5％CO2下孵育于饱和湿度培养箱中，培养24小时。取培养物置于显微镜下观察，可见细胞浓度增大，全球形大鼠骨髓中的红细胞如积沙等悬浮在培养基中，少量红细胞相互聚集。换液去除漂浮血细胞，再每两三天换一次液体，直至增殖达到融合。
大约7天后，在倒置显微镜下观察细胞形态和生长。贴壁细胞数量显著增加，融合达到80％～90％，细胞可传代。用1％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉一只2个月大的雄性小鼠，无菌条件下切断坐骨神经远端。术后7天，将20-25mm的预变性坐骨神经分离提取，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤3次，置于D-汉克斯，剥离外神经膜。
将获得的组织切割成约1mm3大小，分离0.05％胶原酶-双酶复合消化液，37℃消化3h-5h，2000/min，离心10min，弃上清液。再将组织悬浮于含10％胎牛血清(FCS)、各种氨基酸和葡萄糖的培养基(DMEM)培养基中，900r/min离心5min，弃去上清液。最后，它被制造出来了用含10％FCS的含各种氨基酸和葡萄糖的培养基(DMEM)培养基接种到单细胞悬浮液中，接种于10μg/ml拉米宁(37℃，2h)的培养皿中。于37℃，体积分数为5％CO2孵育于饱和湿度培养箱中孵育3-5天。
3.扫描电镜：
将上述制备的水凝胶样品用真空冷冻干燥机脱水24h。将薄片放置在真空室中，均匀地涂覆一层薄薄的金，然后将薄片加载到场发射扫描电子显微镜中进行形态成像。
4.C-AM/PI细胞染色：
在含有200μg钙素-AM粉末的试管中加入200μl二甲基亚砜，并通过管道溶解。使用钙黄绿素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)存储溶液和碘化丙啶(PI)存储溶液返回室温。在5ml磷酸缓冲盐溶液中加入10μl Calcein-AM储存液和15μl PI储存液，混合制成工作溶液。此时Calcein-AM浓度为2μmol/l，而PI浓度为4.5μmol/l。制备Calcein-AM和PI染色液后，用磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞3次，直接加入染色液进行染色。取出上清液，加入磷酸缓冲盐溶液制备细胞悬液(105ml-106ml)。重复步骤2和步骤3多次，以消除介质中的酯酶活性。将100μl染色工作液与200μl细胞悬液混合，于37℃，体积分数为5％CO2孵育于饱和湿度培养箱中孵育15分钟。
在490±10nm的激发波长下照射预培养支架，同时观察到黄绿色荧光活细胞和红色荧光死细胞。此外，在室温37℃，545nm的激发波长下照射15分钟，观察到死细胞。
5.细胞增殖实验：
每组待测样品用磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，每个样品中加入培养基和试液的混合物(1ml BMSCs完全培养基+0.1ml细胞计数试剂)。在37℃在黑暗中孵育2h，并接受培养。将营养组加入96孔板中(每孔110L)，用标记450nm含有细胞的空白孔读取OD值作为空白对照。在每组的每个时间点(第1天，第4天，第7天，第14天)设置了三次独立复制。标准曲线计算每个样本中的细胞数。
6.聚合酶链式反应(PCR)的测定：
采用Trizol法提取各组细胞的总RNA，按照逆转录试剂盒的说明书进行逆转录，得到cDNA。反应体系：配置荧光定量所用试剂，SYBR预混Ex TaqⅡ(TaiRNasePlus)2×10μL，聚合酶链式反应(PCR)前向引物(浓度为10μmol/L)0.8μL，PCR反向引物(浓度为10μmol/L)0.8μL，模板2μL，蒸馏水dH2O6.4。反应条件：95℃下反应3min；95℃下反应1min，60s～30s，72℃下反应5min，扩增循环40次。进行聚合酶链式反应，用2-△△Ct法分析基因相对表达量。
7.抗脑源性神经营养因子释放实验：
在96孔板中加入2000pg/mL、1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL和31.2pg/mL标准溶液(配置的BDNF溶液)。取100uL样品稀释液，加入96孔板中作为零孔。在不同时间点收集100uL上清液，加入96孔板中，用密封纸密封，37℃孵育90min。将96孔板的每个孔，将吸水纸吸干，不要清洗；在每口井中加入100uL抗脑源性神经营养因子(BDNF)抗体，用密封胶密封，37℃孵育60min。
洗板：将孔中的液体取出，加入300uL磷酸缓冲盐溶液浸泡1min，弃去清洗液，用吸水纸吸干，重复3次；加入100uL亲和素生物素过氧化物酶复合物(ABC)试液，用密封纸密封，37℃孵育30min。洗板5次；每口井加入90uL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色液，用密封纸密封，在37℃黑暗中孵育30min。每口井加入100uL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺终止液，颜色由蓝色变为黄色，在450nm处读取OD值。计算每个标准孔的OD值，绘制标准曲线。根据标准曲线计算各孔抗脑源性神经营养因子的含量，统计分析各时间点抗脑源性神经营养因子释放量。
8.支架降解实验：
将3D打印支架放置在培养皿中连续观察28+7天后，用立体镜拍照观察。
9.动物模型构建：
健康成年雌性SD(SragueDawelege大鼠)体重200克-300克。用0.3％戊巴比妥(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，固定大鼠，切开背部皮肤，暴露背部脊柱两侧的半球肌和肌腱，因为L1以下两侧的半球肌与肌腱连接在中线上，按顺序计数到T10的标记，在T10-11的椎间隙中点做标记，用中指捏一下位置尽可能从腹部标记以增加椎间隙，并用拇指和食指尾固定头部。另一只手拿着一把手术锋利的刀，刀刃对着侧面被切成两半。刀尖在标记处与棘突平行并进入椎间隙后，垂直力迅速到达椎体，将手柄30°向未切侧倾斜。迅速抬起并切断脊髓，发现后肢抽搐后麻痹为宿主模型。缝合切口，自然光照，保持干燥。
10.组织学染色：
将切片依次放入二甲苯I10min，二甲苯II 10min，无水乙醇I 5min，无水乙醇II5min，95％酒精5min，90％酒精5min，80％酒精5min，70％酒精5min，蒸馏水中进行洗涤。切片用Harris苏木精染色3-8分钟，用自来水冲洗，用1％盐酸和酒精区分数秒，用自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，用流水冲洗。切片放入伊红染色液中，染色1-3min。将切片依次放入95％醇I 5min，95％醇II 5min，无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min，二甲苯I 5min，二甲苯II 5min进行洗涤后脱水透明顺序放置，从二甲苯中取出切片，稍加Gum封口剂干燥。显微镜检查，影像获取和分析。
11.共聚焦染色：
用磷酸缓冲盐溶液或0.9％氯化钠溶液洗涤两次，每次3分钟，并将液体排出。洗涤器应用于洗涤，或手动摇动几次。可以在a中操作六孔板。加入0.5ml活细胞标记(Hoechst33258)染色液，染色5分钟。可以使用自动摇床或手动摇床。用磷酸缓冲盐溶液或0.9％氯化钠溶液洗涤两次，每次3分钟。将切片放在玻璃玻片上，滴一滴防淬火安装溶液，盖上干净的盖板，尽量避免气泡。荧光显微镜可以检测蓝色细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右。Hoechst33258的吸收光谱和发射光谱，左边的峰是吸收光谱，右边的峰是发射光谱。
12.大鼠后肢运动功能的恢复情况评估：
将动物放置在直径为2m的圆形平台上，并将其后肢的步行和肢体活动评分分为三个部分。第二部分为8-13，判断后肢的步态和协调功能。第三部分采用14-21分评价大鼠后肢在运动中的精细运动。满分21分的三只实验动物分别于手术前后第三天，术后1周，术后2周，术后4周给予大鼠后肢运动功能的恢复情况评分。所得数据经Student-t检验进行统计学处理。
13.坡道试验：
根据文献报道，分别在手术前1天和手术后1、3和7天进行倾斜板试验。试验前，将大鼠放置在倾斜板上倾斜度为30°。驯化1min后，以5°为单位连续增加斜板。如果老鼠坚持这种倾斜5s和3次，他们继续增加角度后，休息1min，直到大鼠不能坚持5s和3次。记录大鼠能保持5s和3次的最大角度。
14.统计分析：
所有实验至少重复三次，数据以平均±SD(标准差)表示。Student-t检验作为对比例，p值<0.05。统计分析使用科研统计作图软件为GraphPadPrism8.0。
支架的生物学行为测试：
图5a为本申请实施例提供的仿生脊髓支架的体外降解测试结果示意图；图5b为本申请实施例提供的仿生脊髓支架的体内降解测试结果示意图；通过对仿生脊髓支架进行降解实验，测试包括仿生脊髓支架的体外降解和仿生脊髓支架的体内降解，两种测试结果显示支架具有稳定性，与之前检测到良好的机械强度相匹配；
图5c为本申请提供的仿生脊髓支架的脑源性神经营养因子释放曲线(c)，图5d为本申请实施例提供的三维仿生脊髓支架与二维仿生脊髓支架的生物降解比对结果示意图；如图5c所示，仿生脊髓支架具有稳定缓释能力。如图5d所示，骨髓间充质干细胞无干性改变，仅有CD29明显改变，扩散能力下降，有聚集在支架孔径内部的趋势
图5e为本申请提供的仿生脊髓支架的qPCR实验测试图(实时荧光定量核酸扩增检测)，如图5e所示，仿生脊髓支架可以维持干细胞分化潜能。仿生脊髓支架的细胞存活率高于95％，与无干预措施的正常细胞存活率近似。
图5f为本申请提供的仿生脊髓支架的细胞活动测试图，如图5f所示，仿生脊髓支架在光镜下的增殖细胞的形态和密度均能够满足设计需求。
图5g为本申请提供的仿生脊髓支架的细胞计数统计曲线分析图，如图5g所示，仿生脊髓支架可促进干细胞大量增殖，与其微观结构中疏松网状结构有利于细胞粘附和存活相匹配，仿生脊髓支架具有较强的细胞相容性及促进细胞增殖能力。
仿生脊髓支架理化性质的检测：
图6a为本申请提供的仿生脊髓支架的傅里叶红外光谱图，如图6a所示，仿生脊髓支架成分清晰，由明胶、嫁接官能团和蓝光引发剂组成。
图6b为本申请提供的仿生脊髓支架的热重分析结果图，如图6b所示，通过热重分析显示仿生脊髓支架热稳定良好，在人体稳温度37℃时分解不到5％。
图6c为本申请提供的仿生脊髓支架的杨氏模量结果图，如图6c所示，通过杨氏模量分析结果可知仿生脊髓支架具有良好的机械强度，单方向孔隙的仿生脊髓支架相比于多方向孔隙的脊髓支架具有更稳定的机械强度，显示单方向孔隙的脊髓支架的优异稳定性。
图6d为本申请提供的仿生脊髓支架的蠕变测试结果图，如图6d所示，脊髓由椎体保护。脊柱的弯曲度和外部压力因运动而改变。仿生支架具有力学应变响应能力，当应力或频率发生变化时，其蠕变特性具有与脊髓相似的变形趋势。它还模拟了脊髓细胞的应激环境，模拟了应激改变状态下的细胞生态。
图6e为本申请提供的仿生脊髓支架的亲水性测试图，如图6e所示，通过测试仿生脊髓支架的水含量，测试结果显示支架表面具有亲水性，有利于培养基湿润和营养物质交换；
图6f为本申请提供的仿生脊髓支架的电阻率测试结果图，如图6f所示，通过测试仿生脊髓支架的电阻率，测试结果显示支架的电阻率与脊髓组织相似，有利于神经电信号传导。
图7为本申请提供的仿生脊髓支架的扫描电镜图，如图7所示，仿生脊髓支架的扫描电镜图显示支架具有疏松网状结构，有利于细胞粘附和存活。
仿生脊髓支架的体内试验及运动功能评价：
实验设计，
假手术组(SG)：只咬伤T9椎板，无脊髓损伤；
对照组(CG)：脊髓损伤后不进行移植；
单纯支架组(SSG)：脊髓损伤后移植不搭载细胞的3D打印支架；
GelMA水凝胶组(HG)：水凝胶包裹两种类型的细胞，即骨髓间充质干细胞(BMSCs)和雪旺细胞(RSCs)；
3D打印支架组(PSG)：3D打印的仿生脊髓支架，含有骨髓间充质干细胞(BMSCs)和雪旺细胞(RSCs)用于移植。
实验步骤：
将上述支架组置于培养基上预培养支架24小时，使装载的干细胞适应仿生脊髓支架内环境；制备T9脊髓损伤半切模型并移植入仿生脊髓支架，皮下血管与仿生脊髓支架具有一定关联性。
图8a为本申请提供的仿生脊髓支架以及各对照组的大鼠后肢运动功能的恢复情况评分图，如图8a所示，大鼠后肢运动功能的恢复情况评分和斜坡测试显示仿生脊髓支架组的大鼠运动能力、后肢支撑能力和时间远远优于其他组，且具有统计学意义。
图8b为本申请提供的仿生脊髓支架以及各对照组的细胞扫描电镜图，如图8b所示，支架植入后皮下组织HE染色，分别记录大鼠植入支架后的第7天、第14天、第21天及第28天炎症状态，结果显示支架移植后炎症反应随时间而逐渐减轻，具有低免疫源性，符合移植标准。
脊髓损伤部位的免疫学评价
(1)HE染色：将脊髓的大体结构与损伤部位进行比较。如图9a所示，100X:支架脊髓局部结构如图所示，400X:细胞的形态和数量的照片如图所示。
(2)神经元免疫组化染色，观察脊髓组织、支架或关节内神经元(NeuN)的形态和数量如图9b所示。
(3)LFB:髓磷脂染色(蓝色)观察脊髓大体结构，与HE染色相互证实。黑色虚线:正常组织与干预组织的分界线，如图9c所示。
显示支架可以填充损伤区域，维持脊髓大体结构，且与健侧脊髓无明显接触排异反应。
脊髓空洞区域的细胞免疫荧光染色
(a)骨髓间充质干细胞:GD2(绿色)，雪旺细胞:SOX10(红色)；
(b)星形胶质细胞：GFAP(红色)，少突胶质细胞：MBP(绿色)；白色虚线:脊髓与支架的分界线。
(c)神经元：NeuN(绿色)，轴突：β-III Tubulin(红色)；色虚线区域：3d打印支架。
(d)神经元：NF-200/NeuN(绿色)，雪旺细胞：SOX10(红色)，髓鞘：MBP(红色)；
(e)神经元：NeuN(绿色)，髓鞘：MBP(红色)；白色箭头：髓鞘围绕再生神经元。
如图10所示，仿生脊髓支架治疗组中的大鼠脊髓损伤空洞区域可见大量骨髓间充质干细胞和雪旺细胞，并且可见由BMSC分化而成的神经元，RSCs分化而成的少突胶质细胞继而分化为髓鞘。再生神经元和轴突大致沿孔径长轴方向延伸。并可见髓鞘包绕再生神经元，形成有髓神经纤维的基础结构。有利于神经电信号的传导。

Claims (9)

1.一种促进脊髓损伤后轴突定向延伸的仿生脊髓支架，其特征在于，所述仿生脊髓支架包括：
至少两层基体层，所述基体层承载有骨髓间充质干细胞；及
至少一层支撑层，所述支撑层设置于所述至少两层基体层之间，所述支撑层用于支撑所述至少两层基体层，所述支撑层包括间隔排列的多个支撑单元，所述多个支撑单元之间形成孔隙；所述支撑单元承载有雪旺细胞，所述孔隙用于引导轴突定向延伸。
2.根据权利要求1所述的仿生脊髓支架，其特征在于，其满足以下特征a～g中的至少一种：
a.所述支撑单元为球状、纤维状或柱状；
b.相邻两层基体层之间的距离为150um至250um；
c.间隔排列的相邻两个支撑单元之间的间距为150um至250um；
d.所述基体层包括多个交错分布排列的纤维丝；
e.所述基体层包括多个平行排列的纤维丝；
f.所述孔隙的直径为180um至220um；
g.所述孔隙的延伸深度为2mm至2.2mm。
3.根据权利要求1或2所述的仿生脊髓支架，其特征在于，所述仿生脊髓支架由三维打印技术打印形成。
4.根据权利要求3所述的仿生脊髓支架，其特征在于，用于打印所述仿生脊髓支架的材料包括含嫁接官能团的水凝胶。
5.根据权利要求3所述的仿生脊髓支架，其特征在于，用于打印所述仿生脊髓支架的材料包括含嫁接官能团的明胶和蓝光引发剂。
6.根据权利要求1所述的仿生脊髓支架，其特征在于，用于形成所述基体层的打印材料包括骨髓间充质干细胞与甲基丙烯酸酐化明胶。
7.根据权利要求1所述的仿生脊髓支架，其特征在于，用于形成所述支撑层的打印材料包括雪旺细胞与甲基丙烯酸酐化明胶。
8.根据权利要求1所述的仿生脊髓支架，其特征在于，所述仿生脊髓支架包括第一基体层、第二基体层及第三基体层，所述第一基体层与所述第二基体层之间设有两层支撑层，所述第二基体层与所述第三基体层之间设有两层支撑层；
所述第一基体层、所述第二基体层及所述第三基体层承载有骨髓间充质干细胞，所述两层支撑层承载有所述雪旺细胞；
所述骨髓间充质干细胞由于重力作用聚集至位于所述仿生脊髓支架中央的孔隙内，并分化形成神经元；
所述雪旺细胞聚集在所述骨髓间充质干细胞周围，并分化形成少突胶质细胞，并使得包绕于所述神经元周围的少突胶质细胞继续分化形成髓神经纤维结构。
9.根据权利要求1所述的仿生脊髓支架，其特征在于，所述仿生脊髓支架的表面具有亲水性。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115414319A (zh) * 2022-07-19 2022-12-02 浙江大学 携载间充质干细胞球的双层凝胶体系及其制备方法与应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030054035A1 (en) * 2001-09-14 2003-03-20 Benjamin Chu Cell storage and delivery system
US20080208358A1 (en) * 2005-03-07 2008-08-28 Georgia Tech Research Corporation Nanofilament Scaffold for Tissue Regeneration
CN101653366A (zh) * 2009-06-11 2010-02-24 广州中大中山医科技开发有限公司 一种用于修复神经损伤的明胶海绵圆柱体支架的构建
US20110033504A1 (en) * 2007-07-23 2011-02-10 Drexel University Articles and methods for repairing damaged nervous tissue
CN103272288A (zh) * 2013-06-24 2013-09-04 谢杨 基于生物打印技术的细胞-生物支架复合物的制备方法及其应用
KR20150027337A (ko) * 2013-08-30 2015-03-12 전홍석 집적회로 전극칩과 생체물질로 만든 지지체를 이용한 신경연결장치
CN110475528A (zh) * 2016-12-12 2019-11-19 加利福尼亚大学董事会 仿生植入物

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030054035A1 (en) * 2001-09-14 2003-03-20 Benjamin Chu Cell storage and delivery system
US20080208358A1 (en) * 2005-03-07 2008-08-28 Georgia Tech Research Corporation Nanofilament Scaffold for Tissue Regeneration
US20110033504A1 (en) * 2007-07-23 2011-02-10 Drexel University Articles and methods for repairing damaged nervous tissue
CN101653366A (zh) * 2009-06-11 2010-02-24 广州中大中山医科技开发有限公司 一种用于修复神经损伤的明胶海绵圆柱体支架的构建
CN103272288A (zh) * 2013-06-24 2013-09-04 谢杨 基于生物打印技术的细胞-生物支架复合物的制备方法及其应用
KR20150027337A (ko) * 2013-08-30 2015-03-12 전홍석 집적회로 전극칩과 생체물질로 만든 지지체를 이용한 신경연결장치
CN110475528A (zh) * 2016-12-12 2019-11-19 加利福尼亚大学董事会 仿生植入物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DIEGO NOÉ RODRÍGUEZ-SÁNCHEZ 等: "3D-printed nerve guidance conduits multi-functionalized with canine multipotent mesenchymal stromal cells promote neuroregeneration after sciatic nerve injury in rats", 《STEM CELL RESEARCH & THERAPY》 *
ER-ZHU YANG 等: "Multichannel polymer scaffold seeded with activated Schwann cells and bone mesenchymal stem cells improves axonal regeneration and functional recovery after rat spinal cord injury", 《ACTA PHARMACOLOGICA SINICA》 *
李昂 等: "骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤的研究进展", 《中国脊柱脊髓杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115414319A (zh) * 2022-07-19 2022-12-02 浙江大学 携载间充质干细胞球的双层凝胶体系及其制备方法与应用
CN115414319B (zh) * 2022-07-19 2024-02-20 浙江大学 携载间充质干细胞球的双层凝胶体系及其制备方法与应用

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