CN101653366A - 一种用于修复神经损伤的明胶海绵圆柱体支架的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于修复神经损伤的多孔隙明胶海绵圆柱体支架材料的构建方法，尤其是一种含有干细胞的多孔隙明胶海绵圆柱体支架的构建方法及其应用。应用时将种植有干细胞及其分化细胞或/和雪旺细胞的多孔隙明胶海绵圆柱体支架移植到全横断或半横断脊髓的损伤处，可更好地促进受损伤中枢神经再生和功能修复。本发明在生物组织工程水平上加强对脊髓创伤后保护受损伤神经元、促进其轴突再生、提高伤病者生存质量、减轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于修复神经损伤的多孔隙明胶海绵圆柱体支架材料的构建方法，尤其是一种含有干细胞的多孔隙明胶海绵圆柱体支架的构建方法及其应用。
背景技术
中枢神经损伤如严重的脊髓创伤主要表现为截瘫和四肢瘫，目前还没有行之有效的治疗方法。传统认为，中枢神经损伤后很难再生。现在认为，中枢神经再生困难的原因主要是它们所处微环境中存在有抑制神经再生的化学因子，同时缺乏促进神经再生的神经营养因子。现阶段促进脊髓损伤修复的策略，多着力于改善神经元发出的神经纤维再生微环境，让再生的神经纤维借助桥接物支架穿过损伤区，进入另一侧的脊髓组织中，重建神经通路联系，恢复原有的功能。
生物材料在医学领域的运用已有一段的历史。在脊髓创伤中，生物组织工程材料作为移植细胞或作为具有保护神经元和促进其轴突再生作用的活性因子的载体，被用于治疗脊髓损伤而逐渐引起人们的关注。这也是生物组织工程材料本身的特性所决定地。组织工程材料具有天然来源生物材料、不可降解合成材料和可降解高分子合成材料。1.天然来源生物材料包括明胶，胶原和海藻酸盐等等，它们能在一定程度上促进脊髓结构和功能的恢复。由于天然材料支架本身结构的无序性和机械性能较差，虽然在体外观察到比较理想的实验结果，但要移植到体内起导向轴突再生作用会有困难。2.不可降解材料的主要代表是硅胶管，这种非降解的合成材料有较高的感染率，易引发慢性炎症反应及纤维化，随着时间的延长对再生轴突会产生卡压的趋势，而需再次手术取出导管。普遍认为无活性的导向通道，在没有外源性生长因子的存在时不能促进再生轴突通过损伤区，而且它不可降解。正是由于这些缺点，不可降解材料而未被广泛研究。3.可降解的高分子材料最大的优点是生物相容性好，降解产物易于被吸收而不产生炎症反应，是目前生物组织工程材料的主要研究对象。可降解的高分子材料以多通道生物多聚体材料---聚左旋乳酸(poly D，L-lactic acid，PLLA)和聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly D，L-lactic-co-glycolic acid，PLGA)为代表。但是，这种材料在用于体内神经损伤修复的实验中，还有许多有待解决的问题。例如，支架材料降解之后产生的酸性物质和崩塌等。
天然生物材料做成的凝胶、明胶海绵和胶原海绵，或者用可降解高分子合成材料做成的导管，都可用于横断性脊髓损伤修复。凝胶能够在脊髓损伤空洞处起填充作用，促进轴突再生，减少星形细胞增生形成的疤痕。但是，它不能较好地介导再生轴突穿越损伤区域，尤其是缺乏机械强度。明胶海绵和胶原海绵具有凝胶的优点，且能够方便承载活性物质，但其机械强度不高。导管最大的优势是在于它有一定的机械强度，能够介导再生轴突穿越导管本身，达到横断伤脊髓组织的另一端，即起到桥接作用，但有些导管在降解之后产生的酸性物质对邻近细胞有损害作用。
发明内容
目前，在国内、外尚未见有文献资料报道用于修复神经损伤的多孔隙明胶海绵圆柱体支架材料的构建方法，尤其是一种含有干细胞的多孔隙明胶海绵圆柱体支架的构建方法及其应用。本发明的目的是想克服现有临床上治疗神经损伤所用的方法上的不足，应用我们自行构建的多孔隙明胶海绵圆柱体支架材料治疗神经创伤性疾病，更好地促进受损伤神经再生和功能修复。
本发明的基本方案包括：
以多孔隙明胶海绵为主体，外面应用PLGA薄膜包裹，形成一种形貌像圆柱体的支架材料。在此基础上吸附骨髓间充质干细胞、神经干细胞或雪旺细胞等，构建成能够促进轴突再生的人工神经导管。应用时，将其移植到横断性脊髓损伤处或神经损伤处。
本发明的优点显著。本研究选择一种含有骨髓间充质干细胞、神经干细胞或雪旺细胞的多孔隙明胶海绵圆柱体支架来促进受损伤的中枢神经元轴突再生，对危害人民健康较大的创伤性中枢神经疾病如脊髓损伤等进行防治基础性研究，将会有力地推动整个创伤性中枢神经疾病防治研究领域的发展。这对延长人类寿命，提高伤病者生存质量，减轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展都具有重要意义。本发明将使我国的创伤性中枢神经疾病防治水平居于国际领先水平。
[附图说明]
图1 PLGA膜包裹的明胶海绵多孔隙支架材料的制备。
图2 MSCs的培养与鉴定。A：P3代MSCs，相差显微镜，标尺＝40μm；B：MSCs经成脂诱导后油红O染色标尺＝40μm；C：MSCs经成骨诱导后，茜素红染色，标尺＝40μm。
图3 种植7天后MSCs在材料中的粘附和分布。A：材料外侧细胞分布；B：材料中央细胞分布。标尺＝450μm。
图4 MTT法检测MSCs在支架材料上细胞活力。
图5 MSCs在支架材料和孔板中增殖率的比较。A：MSCs在孔板中的增殖；B：MSCs在支架材料中的增殖；C：支架材料组和对照组MSCs阳性率比较。标尺＝40μm。
图6 calcein-AM/EthD-III双标细胞示存活和死亡的细胞。标尺＝40μm。
图7 扫描电镜观察MSCs在支架材料中的粘附与分布。A：和B：MSCs种植于支架材料1天；C：和D：MSCs种植于材料7天。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所用的主要仪器、可降解生物材料、可降解高分子材料、实验细胞、实验动物和试剂作详尽的描述：
1.主要仪器
超净工作台(苏州净化设备有限公司)、普通离心机(日本久保田制作所)、低温高速离心机(美国Eppendorf公司)、5％CO2培养箱(美国Queue公司)、倒置荧光显微镜(德国Leica公司)、酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)、显微手术显微镜(镇江光学仪器厂)、恒冷箱切片机(英国Shandon公司)、倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，XL30FEG型扫描电镜(德国Philips公司)。
2.可降解生物材料
明胶海绵购自南京金陵药业股份有限公司的产品。
3.可降解高分子材料
PLGA(50∶50)薄膜购自济南岱罡生物科技公司的产品。
4.实验细胞和实验动物
骨髓间充质干细胞(自行分离培养获取)和成年雌性SD大鼠(由中山大学实验动物中心提供)。
5.主要试剂
DMEM-LG(Gibico)，优级胎牛血清(TBD)，多聚赖氨酸(Sigma)，D-Hank’s平衡液(自配)，胰蛋白酶(Sigma)，EDTA(Sangon)，0.01mol/l PBS(中杉金桥)，MTT(Ameresco公司)，二甲基亚砜(DMSO)(Sangon)，Hoechst33342(Sigma)，DAPI(Sigma)，山羊血清(中杉金桥)，小鼠抗BrdU单克隆抗体(Sigma)，Cy3标记羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)，calcein-AM/EthD-III Live/Dead kit(Biotium)。
本发明详细的具体操作技术说明如下：
1.多孔隙明胶海绵PLGA圆柱体支架的构建
所述的多孔隙明胶海绵PLGA圆柱体支架可分为两部分：第一部分外壳薄壁是环绕圆柱体的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly D，L-lactic-co-glycolic acid，PLGA)，其由可降解的高分子材料PLGA(聚乳酸与聚羟基乙酸比值为50∶50，分子量为100000)构成。0.02毫米厚PLGA薄膜购自山东济南岱罡生物技术公司，材料的构建方法如下：取一定量的PLGA溶解于二氯甲烷中，配成5％溶液，待PLGA完全溶解后，浇注与已调水平的聚四氟模具中，室温(控制温度在20℃)，挥发24小时，第二天小心揭下薄膜，反置于模具中24小时，剪裁到适宜大小后干燥保存。将薄膜包绕在直径为3毫米的不锈钢圆柱磨具上一圈，边缘用丙酮粘贴，形成直径为3毫米的圆筒状PLGA外壳。使用时将PLGA外壳剪成2毫米长度，酒精浸泡15分钟，随后用无菌D-Hank’s清洗三次，每次10分钟。
第二部分是位于圆柱体中央的无菌明胶海绵购自金陵药业公司，在超净工作台中将其剪成直径3mm，厚度2mm大小(约1.0mg)，其形貌呈圆柱体，其中的孔隙直径约200～600μm。将明胶海绵用尖嘴镊小心塞入消毒好PLGA外壳中。材料无菌干燥保存待用。
2.大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定
10天SD大鼠窒息处死，经碘酒、酒精消毒后，无菌条件下快速取出两侧股骨，放置D-Hanks’平衡液中，清除股骨周围的软组织，剪去股骨两端，用含10％胎牛血清(FBS)的L-DMEM培养液的2ml注射器反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬浮液，并用吸管轻轻吹打混合成单细胞悬液，接种至一个预先铺被有多聚赖氨酸的50ml的玻璃培养瓶中，于37℃，5％CO2中培养。第3天半量换液，以后每隔2～3天全量换液。大约7～10天细胞长至接近融合时(70％～80％)，用0.25％胰酶+0.02％EDTA消化2min，按1∶3接种传代(P1代)后继续培养。当细胞再长至接近融合时，同样按照上述方法1∶2进行传代。
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)的鉴定：采用成脂成骨诱导检测MSCs的多能分化潜能，P3～P5代MSCs经成脂诱导液(1μmol/L的地塞米松，0.5mmol/L的1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)，10μg/ml的牛胰岛素，100mmol/L的indomethacin，10％FBS的H-DMEM)诱导14天后行加入油红O染色，光学显微镜下观察。成骨细胞诱导液(含10-7mol/L地塞米松，10mmol/L β-甘油磷酸钠，50μg/ml Vitamin C)，诱导分化的第21天进行茜素红S法染色，显微镜下观察结果。
3.MSCs种植于多孔隙明胶海绵圆柱体支架材料
将P3代MSCs用0.25％胰酶+0.02％EDTA消化，1000rmp离心5分钟，弃去上清后重悬，制备成1×106cells/ml的细胞悬液，每个支架20μl，并接种于上述支架上，将吸附细胞的材料置于24孔板中，每孔一个材料，采用10％FBS的L-DMEM培养液。取同样细胞数量的MSCs种植于24孔板中，作为实验对照组。
4.MSCs在材料中的粘附和分布
取种植MSCs后7天的支架材料用4％多聚甲醛固定30分钟，0.01MPBS漂洗三次后，用核荧光Hoechst33342标记20分钟，PBS避光漂洗两次后，行连续冰冻切片，片厚30μm。分别取位于材料外侧和中央的切片荧光镜下观察细胞分布，计数细胞总数。
5.细胞生长活力的检测
用MTT检测在支架内培养的MSCs生长活力。MSCs在培养0小时、1天、2天、3天、5天和7天后进行MTT检测，每组5个复孔。每孔加入MTT(5mg/ml，即0.5％MTT)100μl，37℃继续孵育4h。弃上清液，每孔加入DMSO 100μl，作用10min，移到另一96孔板，选择波长490nm在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
6.MSCs在材料中的增殖
用BrdU标记法检测MSCs在支架材料中的增殖。取第6天材料，吸去旧液，加入含10μMBrdU的培养液培养。用同样方法标记对照组孔板中培养6天的MSCs。培养24h后，用D-Hank’s清洗3次，4％多聚甲醛固定30min，0.01MPBS清洗三次。支架材料行冰冻切片，片厚30μm。取材料中央和外侧的切片，连同对照组，行BrdU免疫荧光细胞化学染色检测。具体方法是：2N的盐酸37℃作用30min，然后用硼酸缓冲液清洗2次，每次5min，最后用0.01M PBS清洗5min。10％山羊血清封闭30min后弃去，加入小鼠抗BrdU单克隆抗体，4℃过夜。第二天取出，0.01％PBS清洗3次，每次10min，然后加入Cy3标记羊抗小鼠IgG，37℃孵育1h后用PBS清洗3次，每次10min。DAPI标记20min，PBS避光漂洗两次后，在荧光显微镜下观察，计数BrdU染色阳性细胞比率。MSCs增殖率＝BrdU标记细胞数/DAPI标记细胞数。
7.MSCs在材料中存活检测
MSCs在材料中培养第7天，用calcein-AM/EthD-III标记细胞，检测细胞存活率。方法如下：支架材料用D-Hank’s清洗3次，每次10min，然后加入终浓度为2μM的calcein-AM和1μM的EthD-III混合液，37℃，0.5％CO2孵育箱中孵育40min。然后用D-Hank’s清洗3次，每次10min，随后冰冻切片，片厚30μm。荧光显微镜下观察，存活的细胞为绿色荧光，死亡的细胞为红色荧光，计数细胞存活率。存活率＝绿色荧光细胞数/绿色荧光细胞数+红色荧光细胞数。
8.扫描电镜观察MSCs在材料上的生长
取第1天、7天的支架材料用0.01M PBS冲洗5min×3，后以2.5％戊二醛0.1mol/L磷酸缓冲液后固定，一般室温1h左右。随后用梯度酒精脱水：50％酒精，15min×1；75％酒精，15min×1；95％酒精，15min×2；100％酒精，15min×3。然后，将材料放置于冷冻干燥机中干燥72h，每个材料喷金120s，后行扫描电镜观察。
9.统计学分析
培养7天的MSCs数目、MTT检测OD490吸光度值、MSCs增殖率和MSCs存活率等各组数据，用均数±标准差
表示，运用独立样本t检验(Independent samples t test)分析。P＜0.05表示差异有显著性意义。
实验结果显示：
1.PLGA膜包裹的明胶海绵多孔隙支架形貌
图1：示支架材料的构建过程。A：PLGA薄膜，厚度为0.02mm；B：卷成圆筒状的PLGA薄膜，直径为3mm，将其切成2mm长度的圆筒；C：明胶海绵；D：明胶海绵与PLGA外壳；E：明胶海绵塞入PLGA外壳中，并放置于培养皿中培养。
2.MSCs的培养与鉴定检测
在MSCs的原代培养过程中，根据其贴壁的特性分离和纯化MSCs。第4天后，细胞克隆中的细胞不断增殖，数目增多，细胞形态变为长梭形、成纤维细胞样或多角形，呈放射状，形成小集落。当细胞培养至接近融合时，由相邻集落爬出的细胞互相融合，成放射状或旋涡状排列，细胞长梭形，胞界清楚，胞核饱满。随着细胞的传代，细胞也逐渐趋于纯化。当传到P3代时，细胞形态比较均一，多为长梭形或纺锤状(图2A)。
MSCs在成脂诱导培养液的作用下，可观察到细胞胞质内有高折光性的小脂滴。随着诱导时间的延长，含脂滴细胞逐渐增多，经油红O染色，脂滴可被染成桔红色(图2B)；而在成骨诱导培养液的作用下，能形成明显的钙结节。经茜素红-S法染色能染成橘红色(图2C)。
3.MSCs在材料中的粘附和分布检测
Hoechst染色示种植7d后，MSCs在材料中分布均匀。外侧数量为：1348±156个(图3A)；中央数量为：1059±218个(图3B)。细胞在材料不同层面的数量，细胞在外侧数量要比中央多(P＜00.5)。
4.MSCs在材料中生长的活力检测
MTT检测显示，MSCs在PLGA支架中有很好的生长活力。细胞生长活力曲线表明(图4)，OD值随培养时间的延长而逐步增高，第2、3天增殖速度最快，第5天后增殖减缓。
5.MSCs在材料中的增殖检测
如图5显示，BrdU标记24小时后，免疫荧光细胞化学染色技术显示BrdU染色阳性细胞。结果：BrdU阳性细胞为红色荧光(←所示)，DAPI为蓝色荧光(
所示)，两者都标记细胞核。通过BrdU标记的阳性细胞与DAPI标记的总细胞之间比值计算出的增殖率，在孔板中培养的对照组为：59.73±5.60％；在支架材料组为：60.87±3.96％，两者不存在统计学差异(P＞0.05)
6.MSCs在材料中的存活检测
应用calcein-AM/EthD-III双标细胞后，如图6显示，存活的细胞显示绿色荧光，标记胞质部分(
所示)；死亡的细胞显示红色荧光，标记细胞核(←所示)。存活率为96.93±1.51％。
7.扫描电镜观察MSCs在材料上的生长情况
扫描电镜观察MSCs种植到支架材料后1天和7天的形态。如图7所示，在第1天，材料表面有MSCs附着，细胞多呈圆形，有较短的突起伸出(B，←所示)。7天时，材料表面有大量MSCs附着，细胞均匀分布，细胞多数为梭形(D，←所示)，有大量突起与材料表面相连接，少量细胞呈圆形，有细长突起(D，
所示)。
Claims (8)
1.一种用于修复神经损伤的多孔隙明胶海绵圆柱体支架，尤其是一种用于修复横断性脊髓损伤的含有干细胞的多孔隙明胶海绵圆柱体支架材料，其形貌特征是：圆柱体支架表面包裹着由PLGA薄膜构成的薄壁，圆柱体中央填充着明胶海绵；通过明胶海绵吸附种植的干细胞及其分化的细胞或/和雪旺细胞，建造成有利于受损伤神经再生及其功能修复的多孔隙明胶海绵圆柱体支架。
2.根据权利要求1所述的用于修复神经损伤的多孔隙明胶海绵圆柱体支架，其结构特征是：所述的圆柱体支架是由外表薄层的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly D，L-lactic-co-glycolicacid，PLGA)管壁和内部的明胶海绵构成。
3.根据权利要求2所述的修复神经损伤的多孔隙明胶海绵圆柱体支架，其成份特征是：PLGA中聚乳酸与聚羟基乙酸比值为50∶50，分子量为：100000。
4.根据权利要求3所述的修复神经损伤的多孔隙明胶海绵圆柱体支架，其特征是：PLGA构成的管壁厚度为0.02mm，横截面直径为3mm，长度为2mm。
5.根据权利要求2所述的修复神经损伤的多孔隙明胶海绵圆柱体支架，其特征是：明胶海绵为多孔隙结构。
6.根据权利要求5所述的修复神经损伤的多孔隙明胶海绵圆柱体支架，其结构特征是：明胶海绵为圆柱体，横截面直径3mm，长度为2mm。
7.根据权利要求1所述的修复神经损伤的多孔隙明胶海绵圆柱体支架，其特征是：所吸附种植的细胞为骨髓间充质干细胞、神经干细胞或/和雪旺细胞。
8.一种用于修复脊髓损伤的多孔隙明胶海绵圆柱体支架的应用方法，其特征是：应用时移植到全横断或半横断脊髓的损伤处，以促进受损伤脊髓神经再生和功能修复。
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