CN104258460A - 一种用于修复脊髓损伤的缓释TrkC受体配体明胶海绵圆柱体支架的构建 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于修复脊髓损伤的缓释TrkC受体配体-神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)明胶海绵圆柱体支架的构建方法，尤其是一种含有过表达TrkC受体细胞的缓释TrkC受体配体明胶海绵支架材料的构建方法。应用时将种植有过表达TrkC受体细胞及其分化细胞的缓释TrkC受体配体明胶海绵圆柱体支架移植到横断性脊髓损伤处，可更好地促进受损伤中枢神经再生和功能修复。本发明在生物组织工程水平上加强对横断性脊髓损伤后保护受损伤神经元、促进其轴突再生、提高伤病者生存质量、减轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展有重要意义。

Description

一种用于修复脊髓损伤的缓释TrkC受体配体明胶海绵圆柱体支架的构建

技术领域

本发明涉及一种用于修复脊髓损伤的缓释TrkC受体配体-神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)明胶海绵圆柱体支架的构建方法，尤其是一种含有过表达TrkC受体细胞的缓释TrkC受体配体明胶海绵支架材料的构建方法及其应用。

背景技术

中枢神经损伤如严重的脊髓创伤主要表现为截瘫和四肢瘫，目前还没有行之有效的治疗方法。传统认为，脊髓神经损伤后很难再生。现在认为，脊髓神经再生困难的原因主要是它们所处微环境中缺乏促进神经再生的神经营养因子。因此，要想脊髓神经损伤后能够再生，必需进行人工干预。现阶段促进脊髓神经损伤修复的策略，多着力于改善神经元发出的神经纤维再生微环境，让再生的神经纤维借助桥接物支架穿过损伤区，进入另一侧的脊髓组织中，重建神经通路联系，恢复原有的功能。

在脊髓损伤修复的策略中，生物组织工程材料作为具有保护神经元和促进其轴突再生作用的活性因子或作为移植干细胞的载体，被用于治疗脊髓损伤且逐渐引起人们的关注。组织工程材料主要有天然高分子生物材料和可降解高分子合成材料。天然高分子生物材料包括明胶、胶原、壳聚糖和海藻酸盐等。天然材料具有良好的生物相容性，在体外能促进细胞的黏附、增殖与分化。它们方便承载神经营养因子，与脊髓组织的整合性好，能够降低炎症反应以及减少星形胶质细胞增生所形成的疤痕，在一定程度上能够促进受损伤脊髓的结构和功能恢复。由于天然材料存在加工、机械性能较差和降解速率不易调控等问题，在体内应用受到一定限制。可降解的高分子合成材料以聚左旋乳酸(poly D，L-lactic acid，PLLA)和聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly D，L-lactic-co-glycolic acid，PLGA)为代表，它最大的优点易于加工成各种复杂的结构和形状，有一定的机械强度，能够起到桥接组织的作用，降解产物易于被吸收。但是，这种材料在体外没有促进细胞黏附和生长的功能，植入体内后可能存在降解产物呈酸性的问题。

天然生物材料做成的凝胶、明胶海绵和胶原海绵，都可用于横断性脊髓损伤修复。凝胶能够在脊髓损伤空洞处起填充作用，促进轴突再生，减少星形细胞增生形成的疤痕。但是，它不能较好地引导再生轴突穿越损伤区域，尤其是缺乏机械强度。明胶和胶原具有凝胶的优点，且能够方便承载活性物质。明胶来自于胶原，但去胶原的自然属性后(de-nature collagen)没有了胶原的抗原性，而且含有类似精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，能够促进细胞的黏附和迁移。另外，明胶价格比较便宜，但其机械强度也不高。

明胶海绵应用于临床已经有许多年的历史了，这得益于它的良好的组织相容性和细胞亲和力。但是近年有病例报告指出，由于明胶海绵吸水容易膨胀，最终导致植入中枢神经后出现对周围组织挤压的情况。基于这种情况，我们设计用一种相对膨胀系数较小的材料PLGA膜作为导管外壳，并在导管的中央填塞明胶海绵(曾园山，曾湘。一种用于修复神经损伤的明胶海绵圆柱体支架的构建。获中华人民共和国发明专利，发明专利号：ZL 200910040176.9)。这明胶海绵圆柱体支架一方面可以尽可能保持明胶海绵的良好材料特性，另一方面可以减少明胶海绵的过度膨胀。此外，由于有了机械强度较高的PLGA膜作为导管外壳，导管中间的明胶海绵不容易发生塌陷。这些优点都有利于我们进行体内、外的实验研究。

丝素蛋白(silk fibroin)与其它天然高分子相比有明显的优越性：(1)安全可靠；丝素蛋白是来源于家蚕的天然高纯度蛋白质，向人类传播疾病的风险比较少，而且具有明确的一级结构，不存在潜在的危害性。(2)通过不同处理方法可以获得膜状或液态性状。(3)可以通过某些氨基酸的氨基和侧链的化学修饰，改变其表面性能，较容易吸附细胞。(4)在体内、外可缓慢降解，具有一定的缓释性。

应用神经营养因子治疗中枢神经损伤是目前研究的热点之一，但所运用的多是神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)等神经营养因子。现已证明NGF主要作用于感觉神经元，对运动神经元作用不明显，而BDNF作用的神经元类型范围较窄小。许多研究认为，NT-3对神经元的发育、分化以及对受损伤中枢神经元的存活及其轴突再生有重要作用。有研究还证实，NT-3对脊髓损伤处皮质脊髓束神经纤维的再生有明显的促进作用，这也在我们先前的研究中得到了验证。许多研究表明，NT-3通常与细胞膜上的高亲力受体-TrkC结合而发挥作用。

目前脊髓损伤后神经再生尚未得到有效解决，损伤处微环境缺乏神经营养因子可能是最关键的因素之一。因此，给予外源性神经营养因子是必要的。新近认为，联合治疗策略有望使脊髓损伤修复达到更好的效果，如神经营养因子与生物支架材料联合应用等。研究表明，由于外源性给药方式不能满足在脊髓神经再生过程中的要求，传统注射神经营养因子等给药途径取得的临床效果并不理想，使得神经营养因子的广泛应用受到了限制。因此，亟需找到一种理想的承载神经营养因子，且能使其在脊髓损伤处微环境一定时间内维持有效浓度的方法。

综合上述研究中存在的问题，本项发明专利试图通过在天然生物材料----多孔隙明胶海绵圆柱体支架内添加NT-3/丝素蛋白，利用丝素蛋白特性将使NT-3结合到明胶上，构建一种用于修复脊髓损伤的缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架。然后，在此支架内种植骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)。

发明内容

目前，在国内、外尚未见有文献资料报道用于修复脊髓损伤的缓释TrkC受体配体(NT-3)明胶海绵圆柱体支架的构建方法，尤其是一种含有过表达TrkC受体干细胞的缓释TrkC受体配体明胶海绵支架材料的构建方法及其应用。本发明的目的是想克服现有临床上治疗脊髓损伤所使用的方法上的不足，应用我们自行构建的含有过表达TrkC受体细胞的缓释TrkC受体配体明胶海绵支架材料治疗脊髓创伤性疾病，可能会更好地促进受损伤脊髓神经再生和功能修复。

本发明的基本方案包括：

以多孔隙明胶海绵为主体，加入丝素蛋白和NT-3，外面应用PLGA薄膜包裹，形成一种形貌像圆柱体的支架材料。在此基础上种植骨髓间充质干细胞等，构建成能够促进脊髓神经再生的人工神经导管。应用时，将其移植到脊髓横断性损伤处。

本发明有其显著优点；它是在我们前一项发明专利(一种用于修复神经损伤的明胶海绵圆柱体支架的构建，发明专利号：ZL 200910040176.9)的基础上构建一种含有过表达TrkC受体细胞的缓释TrkC受体配体(NT-3)明胶海绵支架，用于促进受损伤的脊髓神经再生及其功能修复，对危害人民健康较大的创伤性中枢神经疾病进行临床前研究，将会有力地推动整个创伤性中枢神经疾病防治研究领域的发展。这对延长人类寿命，提高伤病者生存质量，减轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展都具有重要意义。本发明将使我国的创伤性中枢神经疾病防治水平居于国际领先水平。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所用的主要仪器、可降解天然生物材料、可降解高分子合成材料、家蚕蚕茧、神经营养因子、实验细胞、实验动物和试剂作详尽的描述：

1.主要仪器

超净工作台(苏州净化设备有限公司)、普通离心机(日本久保田制作所)、低温高速离心机(美国Eppendorf公司)、5％CO₂培养箱(美国Queue公司)、倒置荧光显微镜(德国Leica公司)、酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)、恒冷箱切片机(英国Shandon公司)和XL30FEG型扫描电镜(德国Philips公司)。

2.可降解天然生物材料

明胶海绵购自南京金陵药业股份有限公司的产品。

3.可降解高分子合成材料

PLGA(50∶50)薄膜购自济南岱罡生物科技公司的产品。

4.家蚕蚕茧

制备丝素蛋白溶液所用的原料---家蚕蚕茧，是由浙江省农业科学院蚕桑研究所赠送的产品。

5.神经营养因子

人NT-3基因重组蛋白(neurotrophin-3，NT-3；购自Sigma公司的产品)

6.实验细胞和实验动物

绿色荧光骨髓间充质干细胞(MSCs，自行分离培养获取)和绿色荧光蛋白转基因SD(Sprague-Dawley)大鼠乳鼠(Osaka University，Osaka，Japan)。

7.主要试剂

DMEM-LG(Gibico)，优级胎牛血清(TBD)，多聚赖氨酸(Sigma)，D-Hank’s平衡液(自配)，胰蛋白酶(Sigma)，EDTA(Sangon)，0.01mol/1PBS(中杉金桥)，MTT(Sigma)，二甲基亚砜(DMSO)(Sangon)，Hoechst33342(Sigma)，山羊血清(中杉金桥)等。

本发明详细的具体操作技术说明如下：

1.缓释NT-3的多孔隙明胶海绵PLGA圆柱体支架的构建

所述的缓释NT-3的多孔隙明胶海绵PLGA圆柱体支架的构建可分为4个步骤。第1步骤是制备支架外壳：外壳薄壁是环绕圆柱体的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly D，L-lactic-co-glycolic acid，PLGA)，其由可降解的高分子合成材料PLGA(聚乳酸与聚羟基乙酸比值为50∶50，分子量为100000)构成。0.02mm厚PLGA薄膜购自山东济南岱罡生物技术公司，材料的构建方法如下：取一定量的PLGA溶解于二氯甲烷中，配成5％溶液，待PLGA完全溶解后，浇注与已调水平的聚四氟模具中，室温(控制温度在20℃)，挥发24小时，第2天小心揭下薄膜，反置于模具中24小时，剪裁到适宜大小后干燥保存。将薄膜包绕在直径为3mm的不锈钢圆柱磨具上一圈，边缘用丙酮粘贴，形成直径为3mm的圆筒状PLGA外壳。使用时将PLGA外壳剪成2mm长度，酒精浸泡15分钟，随后用无菌D-Hank’s平衡液浸洗3次，每次10分钟。

第2步骤是制备丝素蛋白溶液：(1)将20g Na₂CO₃溶于4升水中，加热至100℃，放入75g家蚕蚕茧(由浙江省农业科学院蚕桑研究所赠送)，保持溶液微沸，并不断搅拌。1小时后，倒去溶液。再重复上述过程1次。将煮沸好的蚕茧自然冷却，用去离子水冲洗干净，放在烘箱内24小时，50℃烘干后备用。(2)取CaCl₂44.40g、乙醇46.00ml，去离子水57.60ml制成混合溶液，在此溶液中放入烘干的蚕茧15.00g。使溶液充分浸没蚕茧后，80℃水浴加热，搅拌溶解。1小时后，蚕茧全部溶解为丝素蛋白溶液。停止加热和搅拌，自然冷却丝素蛋白溶液至室温。(3)用透析袋(购自于广州市齐云生物技术有限公司)透析去除丝素蛋白溶液中的盐离子。前2天用自来水浸泡含有丝素蛋白溶液的透析袋，后1天改用去离子水浸泡，共透析3天。在透析期间，每隔3小时换1次自来水或去离子水。(4)将透析后的丝素蛋白溶液倒入量筒中，静置4小时，除去溶液中的固体杂质。用锥形瓶收集静置后的丝素蛋白溶液，4℃冰箱保存，在1周内使用完毕。(5)取约10ml静置后的丝素蛋白溶液倒入小烧杯中，60℃烘干。称量烘干后的丝素蛋白的质量，除以溶液质量，即可得到丝素蛋白溶液的浓度。计算公式为：C为丝素蛋白溶液的浓度；m₀为小烧杯的质量；m₁为丝素蛋白溶液与烧杯质量的；m₂干燥后丝素蛋白与烧杯质量的和。我们制备的丝素蛋白溶液浓度约为6％～7％。

第3步骤是制备负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵：(1)取0.2μg人NT-3基因重组蛋白(NT-3，购自Sigma公司)溶于1ml丝素蛋白溶液中，混匀。将此混匀的NT-3/丝素蛋白溶液加入到明胶海绵(无菌医用明胶海绵，购自南京金陵药业公司)上至饱和。再在4℃冰箱内静置4小时，接着放入-80℃冰箱冷冻过夜。(2)将冷冻后负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵放入冷冻干燥机中，-80℃真空冷冻干燥12小时。(3)将冻干后的负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵放入带帽的离心管中，-80℃冰箱保存。在应用负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵前用甲醇处理5分钟。

第4步骤是制备缓释NT-3的多孔隙明胶海绵PLGA圆柱体支架：在超净工作台中将负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵剪成直径3mm，厚度2mm大小，其形貌呈圆柱体。再将负载NT-3/丝素蛋白的圆柱体明胶海绵用尖嘴镊小心塞入消毒好PLGA外壳中。缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架无菌干燥保存待用。

2.负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵的NT-3释放检测

取两个负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵材料(体积与质量大体相同)，75％酒精消毒10分钟，用D-Hank’s平衡液浸洗3次后放置于24孔板中。每孔加入L-DMEM培养液300μl，于37℃温箱中放置。每天定时取出L-DMEM培养液(收集后放入-30℃冰箱保存)，同时补充加入300μl新的L-DMEM培养液。如此重复到至28天为止。取1天、3天、5天、7天、14天、21天和28天7个时间点的培养液，用ELISA的方法检测其中的NT-3浓度，并绘制NT-3释放线条图。

3.负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵的形貌及其孔隙大小检测

取1个负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵材料，在干燥的状态下直接喷镀金，并在扫描电镜下观察、拍照。观察负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵材料的表面形貌，并在材料中取5个视野，测算其孔隙的直径与范围。

4.大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定

参照我们前一项发明专利的骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养及鉴定方法(曾园山，曾湘。一种用于修复神经损伤的明胶海绵圆柱体支架的构建。2011年6月8日获中华人民共和国发明专利，发明专利号：ZL 200910040176.9)。

5.MSCs种植于缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架材料内的过程

将缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架材料在75％酒精中浸泡10分钟消毒，用D-Hank's平衡液浸洗3次，将残留酒精成分清除。获取P3-P5代骨髓间充质干细胞(MSCs)，弃丢培养液后用D-Hank’s平衡液浸洗1次，用0.25％胰酶(0.02％EDTA)消化1分钟，再用含10％FBS的L-DMEM培养液终止消化。1000r/分钟，离心5分钟。弃上清，用含10％FBS的L-DMEM培养液重新悬浮MSCs，用计数板计数。按每个支架材料种植2～3×10⁵个细胞/20μl。计算体积后，获取相应细胞量再离心，后弃上清液。以相应体积的含10％FBS的L-DMEM培养液重新悬浮MSCs。种植MSCs时，要在支架材料上、下两面加入MSCs悬浮液。最后在支架材料周围加入少量含10％FBS的L-DMEM培养液过夜，让支架材料内种植的MSCs更好地贴壁生长。第2天再更换为含有维甲酸(RA，工作浓度为10^-6mmol/L)和10％FBS的L-DMEM培养液，其量以浸没支架材料为宜。目的是让MSCs在RA和NT-3(缓释)的诱导下过表达TrkC受体。以后两天换液1次。在上述培养液中常规加入1％双抗。

6.MSCs在缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架内的粘附及其分布检测

取出种植MSCs后培养7天(RA和NT-3诱导)的缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架材料，用4％多聚甲醛固定30分钟，用0.01M PBS漂洗支架材料3次。将支架材料行连续冰冻切片，片厚25μm。分别取位于支架材料外侧及其中部的横切片于荧光镜下观察MSCs的分布。

7.MSCs在缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架内的生长活力检测

用MTT方法检测种植在缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架内的MSCs生长活力。培养1天、3天、5天和7天后，各时间点各取4个支架材料做MSCs生长活力检测。每组4个复孔。每孔加入MTT(5mg/ml，即0.5％MTT)50μl和L-DMEM培养液450μl，37℃继续孵育4小时。弃丢上清液，每孔加入DMSO 350μl，脱色摇床上剧烈摇晃20分钟。将每孔的DMSO溶液分别转移到另一96孔板中，每个支架材料加3个复孔，每孔100μl。在酶联免疫监测仪上选择波长490nm，测定各孔的光密度值。以各分组为横坐标，光密度值(OD值)为纵坐标，绘制MSCs生长活力线条图。

8.扫描电镜观察MSCs在缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架上的生长状态

取第1天、7天的支架材料用0.01M PBS冲洗5分钟×2，后以2.5％戊二醛0.1mol/L磷酸缓冲液后固定，一般室温30分钟左右。随后用梯度酒精脱水：30％酒精，10分钟；50％酒精，10分钟×1；75％酒精，10分钟×1；95％酒精，10分钟×1；100％酒精，15分钟×1。然后，将支架材料放置自然干燥，每个支架材料喷金120秒。后行扫描电镜观察，并拍照。

9.统计学分析

MTT方法检测MSCs生长活力数据，用均数±标准差()表示，运用方差分析(one-wayANOVA)。P＜0.05表示差异有显著性意义。

实验结果显示：

1.应用PLGA膜包裹负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵构建成缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架

如图1显示所制备的缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架的形貌。A.家蚕蚕茧；B.PLGA薄膜；C.医用明胶海绵；D.左为负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵，右为医用明胶海绵；E.PLGA薄膜围卷成的中空圆柱体；F.缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架。图6A显示缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架的低倍大体形貌；图6B显示支架内部的高倍形貌结构；

2.负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵的NT-3体外释放曲线

如图2显示，两个负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵的NT-3释放量在第1天最高，随着体外培养时间的延长，每天的释放量呈逐渐下降的趋势。在第28天时，仍有NT-3的释放。这表明，在28天的观察期内，每天都有NT-3从负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵中缓慢释放出来。

3.缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架的形貌及其孔隙大小

如图6B显示，缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架的明胶海绵是一种不规则、多孔隙结构材料。随机取5个高倍视野观察，其孔隙的大小大部分在30μm～300μm之间。

4.MSCs的体外培养与纯化

在MSCs的原代培养过程中，根据其贴壁的特性分离和纯化MSCs。第4天后，细胞克隆中的细胞不断增殖，数目增多，细胞形态变为长梭形、成纤维细胞样或多角形，呈放射状，形成小集落。当细胞培养至接近融合时，由相邻集落爬出的细胞互相融合，成放射状或旋涡状排列，细胞长梭形，胞界清楚，胞核饱满。随着细胞的传代，细胞也逐渐趋于纯化。当传到P₄代时，细胞形态比较均一，多为长梭形或星形(图3)。

5.MSCs的鉴定

见我们前一项发明专利的MSCs鉴定结果(曾园山，曾湘。一种用于修复神经损伤的明胶海绵圆柱体支架的构建。2011年6月8日获中华人民共和国发明专利，发明专利号：ZL200910040176.9)。

6.MSCs在缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架内的粘附及其分布

种植7天后，MSCs在支架内分布相对均匀。支架外侧横切片上MSCs(图4A)比中部的横切片的MSCs(图4B)分布均匀。MSCs在支架不同层面的数量，外侧层面要比中部层面的多。

7.MSCs在缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架内生长的活力

应用MTT方法检测显示，MSCs在缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架内有较好的生长活力(图5)。MSCs生长活力线条图表明，MSCs生长活力随培养时间的延长而逐步增高，第3天生长活力开始明显增高，一直增高至第7天。

8.扫描电镜显示MSCs在缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架内生长的形态

扫描电镜显示MSCs种植到缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架内1天和7天的生长形态。如图6C所示，在第1天，支架材料表面有MSCs附着，细胞多呈梭形，有较短的突起伸出。有些MSCs之间的突起相互接触。图6D示第7天支架材料表面有许多MSCs粘附，细胞均匀分布，多数为梭形。它们伸出较长的突起，并相互发生接触。

附图说明

图1.所制备缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架的形貌A.家蚕蚕茧；B.PLGA薄膜；C.医用明胶海绵；D.左为负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵，右为医用明胶海绵；E.PLGA薄膜围卷成的中空圆柱体；F.缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架。

图2.示两个负载NT-3/丝素蛋白的明胶海绵的NT-3体外释放曲线。

图3.体外培养与纯化的MSCs。白箭示培养的P4代MSCs(绿色荧光)，它们呈长梭形或星形的胞体，其中含有蓝色荧光的细胞核(Hoechst33342标记)。荧光显微镜，标尺＝40μm。

图4.种植7天后MSCs在缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架中的粘附和分布。A.白箭示支架外侧横切片上MSCs的分布；B.白箭示中部横切片上MSCs的分布。标尺＝320μm

图5.MTT方法检测MSCs在缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架内的生长活力。

图6.扫描电镜显示MSCs在缓释NT-3明胶海绵圆柱体支架中的粘附与分布。A.示支架材料的低倍大体形貌；B.示支架材料内部的高倍形貌结构；C.红箭示在支架中培养1天的MSCs；D.红箭示在支架中培养7天的MSCs。

Claims (3)

1.一种用于修复横断性脊髓损伤的含有过表达TrkC受体细胞的缓释TrkC受体配体明胶海绵支架材料，其形貌结构特征是：支架中央填充着负载TrkC受体配体/丝素蛋白的明胶海绵；通过负载TrkC受体配体/丝素蛋白的明胶海绵吸附种植的过表达TrkC受体细胞，构建成有利于受损伤脊髓神经再生及其功能修复的缓释TrkC受体配体明胶海绵支架。

2.根据权利要求1所述的用于修复横断性脊髓损伤的含有过表达TrkC受体细胞的缓释TrkC受体配体明胶海绵支架材料，其过表达TrkC受体细胞特征是：所吸附种植的过表达TrkC受体细胞为过表达TrkC受体的干细胞。

3.根据权利要求1所述的用于修复横断性脊髓损伤的含有过表达TrkC受体细胞的缓释TrkC受体配体明胶海绵支架材料，其负载的TrkC受体配体特征：是能够与TrkC这种高亲力受体特异性结合的NT-3。