CN1380115A - 一种脊髓、周围神经修复材料的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明所制出的新型脊髓、周围神经修复材料具有同方向微管型结构特性。按需制成不同的外型,如圆柱型,长方型等。具有以下特点:①材料的外表面为全封闭结构,可有效阻止体内纤维结缔组织的长入。②材料的微管径大小可控制在30μm～200μm,有利于神经再生纤维的生长;③微管的排列走行方向为轴向且相互间平行、均匀,有利于神经再生纤维的定向延伸。本发明制备的脊髓、周围神经修复材料,既可直接植入修复脊髓、周围神经缺损;也可作为各种细胞移植的载体,携带不同的神经生长因子及嗅鞘细胞、雪旺细胞和神经干细胞等,用于修复脊髓、外周神经节段性损伤、缺损。
Description
一、所属领域
本发明涉及医学领域中可用于人体创伤后的治疗或动物实验研究的一种材料的制备，特别涉及一种用胶原蛋白和氨基聚糖制成的用于桥接周围神经或脊髓节段性损伤的具有同方向微管型结构特性的脊髓、周围神经修复材料的制备工艺。
二、背景技术
已知细胞外基质包含三大类：胶原、氨基聚糖、糖蛋白。胶原和氨基聚糖等不仅赋予机体的物理性特征，为全身的各种细胞提供附着的支架，而且还对这些细胞的生物学功能具有深远的影响。具有细胞粘附、细胞间传递信号、迁移并与纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、亲玻粘连蛋白、胶原蛋白之间存在结合等功能。胶原在人体内分布最广，约占人体总蛋白的30％，是基膜的主要成份，具有对抗压力、维持结构等功能。硫酸软骨素-6、硫酸软骨素-4等属氨基聚糖，是由一个核心多肽分子与一个或多个氨基聚糠侧链相结合，具有促成神经细胞迁移等作用。脊髓和外周神经主要以I、III、IV型胶原为主。既往研制的基质载体材料内部结构在管径大小和管隙方向上杂乱无规律，使脊髓或外周神经节段性损伤后的再生纤维不能有效地定向生长，从而严重影响了治疗或实验的效果。因此需要研制出具有同方向微管型结构特性的基质材料，使脊髓或外周神经损伤后的再生纤维能够有效地定向生长、再生，提高治疗效果。
三、发明内容
本发明的目的是提供一种有效的制备具有同方向微管型结构特性的脊髓、周围神经修复材料的制备工艺。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：该脊髓、周围神经修复材料可用胶原(I、III、IV型)与氨基聚糖(硫酸软骨素-6或硫酸软骨素-4)混合制成，在一定的低温条件下，调整注有胶原-氨基聚糖混合物管降入冷淋液中速度和/或冷淋液温度，以达到制备在内部结构上具有微管径大小不同和微管隙呈轴向均匀且平行的规律性排列的具有同方向微管型结构特性的修复材料，其制作方法按以下步骤进行：
1)在制作中称取一定量的胶原蛋白按27.5mg/ml放入0.05M(醋酸、盐酸等，以下与此相同)酸性溶液中，在恒温4℃环境中，以2000r/min，搅拌90min，制成悬浊液；
2)再称取氨基聚糖按1.33mg/ml加入0.05M酸性溶液中，同样在恒温4℃、2000r/min，搅拌90min，制成悬浊液；
3)胶原与氨基聚糖混合比按所制材料应用需要，可以在(60-120)∶(1-2)之间调节，按比例混合两种悬浊液，在4℃、2000r/min、继续搅拌90min，制成胶原纤维和氨基聚糖悬浊液，将此悬浊液放入长颈烧瓶中，抽真空静置30min。再将其注入硅胶管中(所制材料直径可以在3mm-16mm之间调节)，两端封堵，顺轴向放入冷淋剂中，并控制放入速度；
a)调节浸入速度，速度分别为1.0×10-4m/s、1.0×10-5m/s……依次递减至10×10-8m/s；从而得到相应温度的各种速度下的胶原-氨基聚糖悬浊液冰晶圆柱体；
b)调节冷淋液温度在-10℃～-180℃之间任意变化，从而得到相应速度下的各种温度下的胶原悬浊液冰晶圆柱体；
c)注有悬浊液硅胶管每次保留于冷淋剂中30min～60min，将胶原-氨基聚糖悬浊液彻底冷冻结晶；
d)将悬浊液-硅胶管冰冻体按应用要求切成短节段，取中央完整的放在铝盘中，冻干(-30℃、100mtorr)24h，真空状态下升温至0℃保持24h；
e)再继续升温至22℃保持45min-90min，解除真空，取出干燥的胶原基质节段，最后将胶原基质节段包入铝箔小包中(开放)，放入烤箱，压力为30mmHg、温度为105℃、时间24h，然后取出将小包密封保存至干燥箱；
f)通过改变冷冻速度和/或冷淋液温度来控制材料内微管的直径和走行方向。
本发明的其它特点是，所述胶原-氨基聚糖混合物包括I、III、IV型胶原和硫酸软骨素-6或硫酸软骨素-4。
四、附图说明
图1是本发明的制作工艺流程示意图；
图2是具有同向微管型结构的脊髓、周围神经修复材料大体立体示意图；
图3是具有同向微管型结构的脊髓、周围神经修复材料横截面(截面有微孔)大体立体示意图；
图4是具有同向微管型结构的脊髓、周围神经修复材料纵截面(截面有纵向微孔剖面)大体立体示意图。
五、具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：参见图1，按照本发明的技术方案，以I型胶原蛋白和硫酸软骨素-6为例，其制作方法按以下步骤进行：
1)在制作时将I型胶原蛋白按27.5mg/ml溶于0.05M(醋酸、盐酸等，以下与此相同)酸性溶液中，在恒温4℃～10℃环境下，以2000r/min搅拌90min，制成悬浊液；
2)将硫酸软骨素-6按1.33mg/ml加入0.05M酸性溶液中，同样在恒温4℃～10℃下，以2000r/min搅拌90min，制成悬浊液；
3)按5∶1比例混合两种悬浊液，在4℃～10℃，以2000r/min、继续搅拌90min，制成胶原蛋白和硫酸软骨素-6混合性悬浊液，将此悬浊液放置于长颈烧瓶中，抽真空静置30min，消除泡沫；
4)将胶原蛋白和硫酸软骨素-6混合性悬浊液其注入内径为3mm～16mm的管中，两端封堵后垂直、纵向缓慢地放入冷淋剂(-10℃～-180℃)中，控制放入速度分别为1.0×10-4m/s、1.0×10-5m/s、1.0×10-6m/s、1.0×10-7m/s、1.0×10-8m/s；
5)将胶原蛋白和硫酸软骨素-6混合性悬浊液管保留于冷淋剂中30min～60min，使其混合性悬浊液完全彻底冷冻结晶；可得到各种条件(温度、浸入速度)下的胶原悬浊液冰晶圆柱体；
6)将胶原蛋白和硫酸软骨素-6混合性悬浊液冰晶圆柱体冻干(-30℃、100mtorr)24h，真空状态下升温至0℃保持24h；
7)将胶原蛋白和硫酸软骨素-6冻干物放入烤箱，压力为30mmHg、温度为105℃、时间24h；
8)将胶原蛋白和硫酸软骨素-6冻干物包装、三层密封，同位素照射灭菌，保存于干燥箱。
为了达到速度快慢变化大、匀速平稳性要求高的实验要求，用可调速度控制器，它是由可调控速度的马达配以直径在1.5cm～4cm之间的五个由小到大的齿轮等部件构成。冷淋液温度调节则另外研制了冷淋装置，调节冷淋液温度在-10℃～-180℃之间任意变化。从而得到各种条件下的胶原悬浊液冰晶圆柱体。注有悬浊液硅胶管每次保留于冷淋剂中30min～60min，将胶原冻透。先将铝盘、刀片放入-30℃恒温箱中，冷冻备用。将10cm长悬浊液-硅胶管冰冻体切成长2.0cm短节段，取中央完整的放在铝盘中，冻干(-30℃、100mtorr)24h，真空状态下升温至0℃保持24h。再继续升温至22℃保持45 min-90min，解除真空，取出干燥的胶原基质节段。最后将胶原基质节段包入铝箔小包中(开放)，放入烤箱，压力为30mmhg、温度为105℃、时间24h，然后取出将小包密封保存至干燥箱。
将各种条件下制出的材料切成横截面和纵截面，在物镜下观察其内部孔的规律性，微管径大小和微管的走向，通过电镜观察胶原基质内孔和微管的三维结构并将所得照片，采用Leica WinQ.3.2v图象分析软件先测量出孔和微管的直径(见表1)。
表1 在-180℃，速度与孔径、孔向间的关系
| 速度(m/s) | 孔方向 | 孔径(μm) |
| 10×10-5 | 无规律 | 51.71～37.95 |
| 5×10-5 | 无规律 | 74.70～48.60 |
| 2×10-5 | 轴向且平行 | 178.47～146.97 |
| 5×10-6 | 轴向且平行 | 91.86～66.41 |
| 1.25×10-6 | 轴向且平行 | 25.39～19.09 |
本发明在制备脊髓、周围神经修复材料着重解决了以下的技术问题：
1.制备过程中研制了①调速度调控仪，使速度控制在10×10-5m/s～1.5×10-7m/s之间；②冷淋温控仪，使冷淋温度在-10℃～-180℃之间任意调控。
2.探明了温度、速度与神经组织修复材料内部结构间关系：
(1)如在-180℃、速度为10×10-5m/s，脊髓、周围神经修复基本材料的孔呈无规律性排列，孔径为74.70μm～48.60μm；
(2)如在-180℃、速度为1.25×10-6m/s，孔呈轴纵向微管排列，管径为25.39μm～19.09μm；；
(3)如在-180℃、速度在2×10-5m/s时，孔呈轴纵向微管排列，微管直径最大，为146.97μm～178.47μm；
(4)各种温度、速度电镜下材料外表面为全封闭结构；
(5)各条件下的材料内轴向微管均平行且基本均匀。
本发明所制出的脊髓、周围神经修复材料参见图2～4，具有以下特点：①材料的外表面为全封闭结构，可有效阻止体内纤维结缔组织的长入。②材料的微管径大小可控制在30μm～200μm，有利于神经再生纤维的生长；③微管的排列走行方向为轴向且相互间平行、均匀，有利于神经再生纤维的定向延伸。本发明制备的脊髓、周围神经修复材料，既可直接植入修复脊髓、周围神经缺损；也可作为各种细胞移植的载体，携带不同的神经生长因子及嗅鞘细胞、雪旺细胞和神经干细胞等，用于修复脊髓、外周神经节段性损伤、缺损。
以下实例2～6.胶原(I、III、IV型)与氨基聚糖(硫酸软骨素-6或硫酸软骨素-4)混合比相同。
实施例2：采用III型胶原蛋白和硫酸软骨素-6作为原始材料制备。其实施过程同实施例1。
实施例3：采用IV型胶原蛋白和硫酸软骨素-6作为原始材料制备。其实施过程同实施例1。
实施例4：采用I型胶原蛋白和硫酸软骨素-4作为原始材料制备。其实施过程同实施例1。
实施例5：采用III型胶原蛋白和硫酸软骨素-4作为原始材料制备。其实施过程同实施例1。
实施例6：采用IV型胶原蛋白和硫酸软骨素-4作为原始材料制备。其实施过程同实施例1。
Claims (2)
1.一种脊髓、周围神经修复材料的制备工艺，该脊髓、周围神经修复材料可胶原(I、III、IV型)与氨基聚糖(硫酸软骨素-6或硫酸软骨素-4)混合制成，在一定的低温条件下，改变注有胶原-氨基聚糖混合物硅胶管降入冷淋液中速度和/或冷淋液温度可以达到制备在内部结构上具有微管径大小不同和微管呈轴向均匀且平行的规律性排列的具有同方向微管型结构特性的新型脊髓、周围神经组织工程修复材料，其制作方法按以下步骤进行：
1)在制作中称取一定量的胶原蛋白按27.5mg/ml放入0.05M(醋酸、盐酸等，以下与此相同)酸性溶液中，在恒温4℃环境中，以2000r/min，搅拌90min，制成悬浊液；
2)再称取氨基聚糖按1.33mg/ml加入0.05M酸性溶液中，同样在恒温4℃、2000r/min，搅拌90min，制成悬浊液；
3)胶原与氨基聚糖混合比按所制材料应用需要，可以在(60-120)∶(1-2)之间调节，按比例混合两种悬浊液，在4℃、2000r/min、继续搅拌90min，制成胶原纤维和氨基聚糖悬浊液，将此悬浊液放入长颈烧瓶中，抽真空静置30min。再将其注入硅胶管中(所制材料直径可以在3mm-16mm之间调节)，两端封堵，顺轴向放入冷淋剂中，并控制放入速度；
a)调节浸入速度，速度分别为1.0×10-4m/s、1.0×10-5m/s……依次递减至10×10-8m/s；从而得到相应温度的各种速度下的胶原-氨基聚糖悬浊液冰晶圆柱体；
b)调节冷淋液温度在-10℃～-180℃之间任意变化，从而得到相应速度下的各种温度下的胶原悬浊液冰晶圆柱体；
c)注有悬浊液硅胶管每次保留于冷淋剂中30min～60min，将胶原-氨基聚糖悬浊液彻底冷冻结晶；
d)将悬浊液-硅胶管冰冻体按应用要求切成短节段，取中央完整的放在铝盘中，冻干(-30℃、100mtorr)24h，真空状态下升温至0℃保持24h；
e)再继续升温至22℃保持45min-90min，解除真空，取出干燥的胶原基质节段，最后将胶原基质节段包入铝箔小包中(开放)，放入烤箱，压力为30mmHg、温度为105℃、时间24h，然后取出将小包密封保存至干燥箱；
f)通过改变冷冻速度和/或冷淋液温度来控制材料内微管的直径和走行方向。
2.根据权利要求1所述的脊髓、周围神经修复材料的制备工艺，其特征在于，所述胶原—氨基聚糖混合物包括I、III、IV型胶原和硫酸软骨素-6或硫酸软骨素-4。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |