JP2015089433A - 組織再生体およびその製造方法、並びに組織再生体用足場 - Google Patents

Abstract

【課題】酸素・栄養の供給および二酸化炭素・老廃物の排出を改善できる組織再生体およびその製造方法、並びに組織再生体用足場を提供する。【解決手段】本発明に係る組織再生体は、再生医療用に用いられる組織再生体１であって、生体適合性および生分解性を示す造形体により構成された三次元多孔中空骨格１２からなる組織再生体用足場１０と、組織再生体用足場１０に形成され、少なくともターゲット細胞を有する細胞層３１と、少なくともターゲット細胞の接着率を高める接着因子、生着率を高める成長因子および移植後の血管内皮細胞の成長を促進する成長因子の少なくともいずれかを含む生理活性物質含有層３０とを具備する。【選択図】図５

Description

本発明は、再生医療用の組織再生体およびその製造方法に関する。また、再生医療用の組織再生体の細胞層の足場となる組織再生体用足場に関する。

機能低下した臓器や欠損した組織を刷新できる再生医療は、治せなかった疾患や外傷に苦しむ人々に、大きな希望を与える新技術として期待され、種々の提案がなされている。特許文献１には、再生医療用の血管の製造方法が提案されている。詳細には、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換えゼラチンを含む血管内皮細胞遊走用足場および生体から単離した血管内皮細胞を、前記血管内皮細胞遊走用足場に接触させること、前記血管内皮細胞遊走用足場と接触している前記血管内皮細胞を、血管新生に必要な時間にわたって培養する方法が提案されている。

特許文献２には、血管新生、神経再生のための細胞接着、細胞増殖に適した足場材料として適用可能な混紡型高分子ファイバーの製造方法が提案されている。詳細には、高分子溶液に電圧を印加し、高分子溶液のジェットを噴射して高分子ファイバーを形成させるエレクトロスピニング法を利用して高分子ファイバーを製造する方法において、複数種の高分子溶液の紡糸開始点が同一または近接するようにして、前記複数種の高分子溶液のジェットを噴射することで、複数種の高分子が含有された単一の高分子ファイバーを形成させる方法が提案されている。

近年、再生医療のコア技術のひとつとして、細胞シートが著しい発展を遂げている。特許文献３には、間葉系幹細胞をシート状に培養した培養細胞シートと、生分解性物質をシート状に形成した生分解性シートとを積層してなる骨再生シートが提案されている。また、特許文献４には、組織の修復もしくは再生に用いる、支持足場層と細胞シート層で作られた組織工学装置が提案されている。

また、特許文献５には、高分子材料の直接造形法により骨等を造形する方法が開示されている。具体的には、患部のＸ線ＣＴスキャン断層画像から修復すべき組織形状の輪郭抽出を行い、コンピュータで作成すべきスキャンフォールドの三次元構造体のＣＡＤデータから断面形状を抽出するインタフェースを介して、制御装置の自動造形を行う例が開示されている。

更に、非特許文献１においては、３次元プリンターを用いて生きた細胞をインクジェット技術で打ち出す技術が提案されている。

特表２０１３−１６２７９６号公報 特開２００７−１８６８３１号公報 特表２００８−５２３９５７号公報 特表２０１３−１６２７９６号公報 特表２００８−１９４９６８号公報 特表２０１０−１２６５０１号公報

"３Ｄバイオプリンターを開発 生きた細胞をインクジェット技術で打ち出す" Medical Tribune新聞 2013年10月17日

再生医療技術は、細胞シートにより著しい発展を遂げてきたが、細胞シートの場合の問題点として、拡散輸送により酸素・栄養分を十分供給できる限界は０．２ｍｍ程度であり、厚みの限界があるという問題がある。このため、細胞シートを積層すると、枚数が増えるほど酸素・栄養の供給や老廃物の排出が困難となり、生着率の大幅な低下が生じ得る。このため、細胞シートは、角膜や皮膚などの薄い組織の再生には適しているが、厚い実質組織には向かないという欠点がある。

本発明は、上記背景に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、酸素・栄養の供給および二酸化炭素・老廃物の排出を改善できる組織再生体およびその製造方法、並びに組織再生体用足場を提供することを課題とする。

本発明者が鋭意検討を重ねたところ、以下の態様において、本発明の課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
［１］ 再生医療用に用いられる組織再生体であって、生体適合性および生分解性を示す造形体により構成された三次元多孔中空骨格からなる組織再生体用足場と、前記組織再生体用足場に形成され、少なくともターゲット細胞を有する細胞層と、少なくとも前記ターゲット細胞の接着率を高める接着因子、生着率を高める成長因子および移植後の血管内皮細胞の成長を促進する成長因子の少なくともいずれかを含む生理活性物質含有層とを具備する組織再生体。
［２］ 前記三次元多孔中空骨格の空隙体積／骨格形成体積が５以上、１０，０００以下である［１］に記載の組織再生体。
［３］ 前記組織再生体用足場と、前記生理活性物質含有層の間に、当該生理活性物質含有層の被覆強度を高めるためのバインダー層が形成されている［１］又は［２］に記載の組織再生体。
［４］ 前記造形体が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸とポリ乳酸の共重合体、ポリヒドロキシ酪酸、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、リン酸カルシウムおよびハイドロキシアパタイトの少なくともいずれかである［１］〜［３］のいずれかに記載の組織再生体。
［５］ 前記細胞層は、軟骨細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、血管芽細胞、筋芽細胞、上皮細胞、尿路上皮細胞、平滑筋細胞、ケラチン生成細胞、β細胞、内皮細胞、線維細胞、血管内皮細胞、肝細胞、小腸上皮細胞、表皮角化細胞、骨髄間充織細胞、心筋細胞、椎間板細胞、口腔粘膜上皮、胃腸粘膜上皮、尿管上皮、骨格関節滑膜、骨膜、軟骨膜、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、心膜、硬膜、髄膜、ケラチン生成細胞前駆細胞、周皮細胞、グリア細胞、神経細胞、羊膜、胎盤膜、漿膜細胞、未分化幹細胞、未分化前駆細胞、前分化幹細胞、前分化前駆細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、樹状細胞および遺伝子組み換え細胞からなる群から選択された細胞を備える［１］〜［４］のいずれかに記載の組織再生体。
［６］ 前記細胞層は幹細胞を含み、当該幹細胞は、造血細胞、間葉細胞、産後細胞、膵臓細胞、肝細胞、網膜上皮細胞、嗅球細胞、内皮細胞、筋細胞、脂肪由来細胞、腸骨稜細胞、骨髄細胞、歯周靱帯細胞、卵形細胞、真皮細胞、臓器特異的幹細胞および臓器特異的幹細胞の前駆細胞からなる群から選択された［５］に記載の組織再生体。
［７］ 前記細胞層は、細胞外マトリックスタンパク質を更に備える［１］〜［６］のいずれかに記載の組織再生体。
［８］ 前記細胞層は、生理活性物質を更に備える［１］〜［７］のいずれかに記載の組織再生体。
［９］ 前記増殖因子は、血管内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、表皮増殖因子、線維芽増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様成長因子、脳由来神経栄養因子、増殖分化因子−５、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、形質転換増殖因子および骨形成タンパク質からなる群から選択される少なくとも一つを含有する［８］に記載の組織再生体。
［１０］ 前記組織再生体用足場は、フィブリンに基づく材料、コラーゲンに基づく材料、ヒアルロン酸に基づく材料、糖タンパク質に基づく材料、セルロースに基づく材料および絹からなる群から選択されたポリマーを備える［１］〜［９］のいずれかに記載の組織再生体。
［１１］ 再生医療用に用いられる組織再生体の製造方法であって、生体適合性および生分解性を示す造形体よりなる組織再生体用足場を作製する足場作製工程と、前記組織再生体用足場の少なくとも一部に、細胞の接着率を高める接着因子、細胞の生着率を高める成長因子、血管新生を促進する成長因子を含む生理活性物質含有層をコーティングする被覆工程と、前記組織再生体用足場の少なくとも一部にターゲット細胞を増殖させる培養工程とを備える組織再生体の製造方法。
［１２］ 前記足場作製工程後であって、前記被覆工程前に、当該生理活性物質含有層の被覆強度を高めるために、前記組織再生体用足場と前記生理活性物質含有層の間にバインダー層を形成するバインダー層形成工程を具備する［１１］に記載の組織再生体の製造方法。
［１３］ 前記足場作製工程は、３Ｄプリンターにより作製する［１１］又は［１２］に記載の組織再生体の製造方法。
［１４］ 再生医療用の組織再生体の細胞層の足場となる組織再生体用足場であって、生体適合性および生分解性を示す造形体からなり、三次元多孔中空骨格からなる組織再生体用足場。
［１５］ 前記三次元多孔中空骨格の空隙体積／骨格形成体積が５以上、１０，０００以下である［１４］に記載の組織再生体用足場。

本発明によれば、酸素・栄養の供給および二酸化炭素・老廃物の排出を改善できる組織再生体およびその製造方法、並びに組織再生体用足場を提供することができるという優れた効果を有する。

第１実施形態に係る組織再生体の製造方法のフローチャート図。 第１実施形態に係る組織再生体用足場の一例を示す模式的斜視図。 図２ＡのＩＩＢ−ＩＩＢ切断部断面図。 第１実施形態に係る組織再生体の要部の部分拡大断面図。 第１実施形態に係る大腿骨モデルの三次元多孔中空骨格を３Ｄプリンターで打ち出すための出力データの一例を示す写真。 第１実施形態に係る大腿骨モデルの三次元多孔中空骨格を３Ｄプリンターで打ち出すための出力データの一例を示す写真。 第１実施形態に係る大腿骨モデルの三次元多孔中空骨格を３Ｄプリンターで打ち出すための出力データの一例を示す写真。 第１実施形態に係る球状の三次元多孔中空骨格を３Ｄプリンターで打ち出すための出力データの一例を示す写真。 第１実施形態に係る組織再生体の製造に適用可能な造形装置の一例を示す概略説明図。

本発明の組織再生体は、再生医療用の組織再生体であって、少なくとも組織再生体用足場、細胞層および生理活性物質含有層を有するものである。組織再生体用足場は、生体適合性および生分解性を示す造形体により構成された三次元多孔中空骨格からなる。細胞層は、組織再生体用足場に形成され、少なくとも組織再生または修復を目的とする細胞（ターゲット細胞）を有する。生理活性物質含有層は、少なくとも前記ターゲット細胞の接着率を高める接着因子、生着率を高める成長因子および移植後の血管内皮細胞の成長を促進する成長因子の少なくともいずれかを含む層である。

なお、本明細書において再生医療用とは、生体組織の修復もしくは再生に用いる用途全般を広く含むものとする。即ち、生体内に組織再生体を移植する場合に限定されず、以下のような種々の用途に用いることができる。例えば、体外腎臓ろ過ユニット等に用いることも可能である。更に、機能的に有益なタンパク質の貯蔵庫、つまりＥＰＯとして用いることもできる。また、本発明の組織再生体は、例えばトレハロース、グリセロール、ソルビトールといった当業者に知られた賦形剤を用いることによって、凍結保存もしくはフリーズドライして供給することも可能である。更に、組織再生体は、例えばインビトロでの薬剤の浸透性試験に利用することもでき、また、動物実験の代替モデルとして、あるいは移植のための臓器としても利用することができる。本発明の組織再生体を生体移植する場合の適用可能な生体部位は特に限定されないが、一例として、脊髄、神経、骨、軟骨、靱帯、腱、心臓弁、食道、子宮頸部、膀胱、肺組織、腎臓、皮膚、筋膜、血管、心筋パッチ、血管パッチ、心臓弁等が挙げられる。

以下、本発明を適用した実施形態の一例について説明する。なお、本発明の趣旨に合致する限り、他の実施形態も本発明の範疇に含まれることは言うまでもない。また、以降の図における各部材のサイズや比率は、説明の便宜上のものであり、実際のものとは必ずしも一致しない。

［第１実施形態］
図１に第１実施形態に係る組織再生体の製造方法の一例を示すフローチャート図を、図２Ａに第１実施形態に係る組織再生体用足場の一例を示す模式的斜視図を、図２Ｂに、図２ＡのＩＩＢ−ＩＩＢ切断部断面図を示す。また、図３に、組織再生体の要部の一例を示す部分拡大断面図を示す。また、造形装置により造形するための大腿骨モデルの三次元多孔中空骨格を３Ｄプリンターで打ち出すための出力データの一例を図４Ａ〜図４Ｃ、図５に示す。

第１実施形態に係る組織再生体の製造には、まず、生体適合性および生分解性を示す造形体が得られる素材を用いて３次元造形法（３Ｄプリンターなど）により組織再生体用足場を作製する（足場作製工程、ステップ１）。次いで、組織再生体用足場の表面の少なくとも一部に、ターゲット細胞の接着率を高める接着因子、生着率を高める成長因子および移植後の血管内皮細胞の成長を促進する成長因子の少なくともいずれかを含む生理活性物質含有層をコーティングする（被覆工程、ステップ２）。続いて、ターゲット細胞を接触させて培養することで、ターゲット細胞層を得る（培養工程、ステップ３）。

上記方法に代えて、ステップ３の後にステップ２の工程を行ってもよい。また、ステップ２の工程を行わずに、ステップ３の工程で細胞層を形成させる際に細胞層内に生理活性物質含有層の成分を含有させることにより、細胞層内に生理活性物質が含有された層を形成してもよい。即ち、本発明において、細胞層と生理活性物質含有層は、明確に区別されていなくてもよい。これらの方法は、適宜組み合わせることができる。即ち、組織再生体用足場に対して生理活性物質含有層を形成し、次いで細胞層を得、その後に更に生理活性物質含有層を形成してもよく、組織再生体用足場に対して生理活性物質含有層を形成し、次いで生理活性物質を含有する細胞層を形成してもよい。このようにして得られた組織再生体は、例えば、自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織に移植され、生体組織・臓器の再生を図ることができる。なお、組織再生体用足場にこれらの因子が含まれている場合にはステップ２の工程を省略することができる。

組織再生体用足場１０は、生体細胞が接着・増殖する足場となるものである。組織再生体用足場１０は、図２Ｂに示すように、内部に中空１３を有し、空隙１４を有する造形体からなる三次元多孔中空骨格１２からなる。組織再生体用足場１０の形状は、図２Ａの例においては、中空楕円形状を示しているが、用いる用途に応じて形状を自由自在に設計することが可能である。例えば、球形、ロッド、螺旋状とすることができる。組織再生体用足場１０は、内部に中空１３を有する必要があるが、内部に多孔骨格が、例えば毛細血管様に網目状に形成されていてもよい。また、規則的な三次元網目立体構造であってもよい。即ち、中空１３は、内部に形成された三次元多孔中空骨格１２の空隙１４により構成されていてもよい。

組織再生体用足場１０のサイズは、移植する臓器や用途に応じて適宜設計し得るが、肝臓等の比較的大きい臓器に移植する場合には、例えば３ｍｍ〜５ｃｍ程度、筋肉に移植する場合には、例えば３ｍｍ〜３ｃｍ程度とすることができる。

中空１３および空隙１４のサイズや形状は、細胞層への酸素・栄養の供給および二酸化炭素・老廃物の排出を妨げない範囲であり、且つ骨格を維持できる範囲であればよく特に限定されない。目的細胞を効率よく立体培養し、移植後の毛細血管の新生や組織再生を促す観点から、表面積が大きくなるように三次元多孔中空骨格１２を設計しつつ、酸素・栄養の供給および二酸化炭素・老廃物の排出が容易なように適切なサイズや形状を有する空隙１４、中空１３を設けることが好ましい。このような観点から、三次元多孔中空骨格１２の空隙体積／骨格形成体積の好ましい範囲としては、用途により変動し得るものであり、特に限定されるものではないが、５以上、１０，０００以下を挙げることができる。なお、空隙体積とは、中空１３および空隙１４の両者を含む体積をいう。また、三次元多孔中空骨格１２の厚み、凹凸、形状およびサイズは、上記趣旨に応じて、あるいは用途に応じて適宜設計できる。

組織再生体用足場１０は、生体適合性および生分解性を示す造形体を形成する材料を用いて３次元プリンター（3D-printer）等の各種造形装置により製造することができる。造形体として、生分解性プラスチックを用いることにより、湿った生体組織に曝された場合、容易に小さな断片に分解し体に吸収されるか、あるいは体内から断片となって排出される。造形体として熱可塑性樹脂を用いて、溶融固化させる方法や、モノマーを重合させて固化させる方法、湿気により硬化させる方法、光照射により硬化する方法等が例示できる。

組織再生体用足場１０に好適な造形体としては、生分解性を示す材料であればよく特に限定されないが、一例として、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸とポリ乳酸の共重合体、ポリヒドロキシ酪酸、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトンポリブチレンサクシネート、リン酸カルシウムおよびハイドロキシアパタイトから選択される単独材料または２種以上の混合物を例示できる。また、組織再生体用足場１０は、フィブリンに基づく材料、コラーゲンに基づく材料、ヒアルロン酸に基づく材料、糖タンパク質に基づく材料、セルロースに基づく材料および絹からなる群から選択されたポリマーを備えていてもよい。

組織再生体用足場１０の材料は、インビボでの機械的な性能、つまり材料に対する細胞付着、増殖、遊走および分化の面での細胞反応、生体適合性、ならびに任意で生分解動態を考慮して選定する。これらの性能は、化学組成、構成要素の空間分布、ポリマーの分子量および結晶化度によっても変動し得る。

図６に、組織再生体用足場を形成する造形装置の一例を示す。造形装置２０は、ノズル２１を有するディスペンサ２２と、ディスペンサ２２をＸ，Ｙ、Ｚ方向に自在に可動制御し得る駆動機構２３、温度調整部２４、圧力調整部２５、制御部２６、造形ステージ２７、記憶部２８等を有する。ディスペンサ２２は、溶融した材料を所望の吐出量・吐出圧で造形ステージ２７に供給する役割を担う。ディスペンサ２２は、温度調整部２４、圧力調整部２５に接続され、最適な条件に調整可能なようになっている。ディスペンサ２２には、組織再生体用足場を形成するための材料投入口（不図示）があり、適宜、ディスペンサ２２内に材料が導入される。ディスペンサ２２には、例えば、樹脂粉末、フレーク、ペレット、ダブレット等を投入して、加温により溶融させてもよいし、予め加熱溶融した材料を投入してもよい。なお、材料には、樹脂、モノマー、リン酸カルシウム等の無機材料の他、適宜、他の添加剤を加えて、粘度や分散性、加工性を調整することが可能である。

ディスペンサ２２内でおいて、加熱溶融し、所望の温度・圧力になった高分子材料はノズル２１から押し出される。ノズル２１の吐出位置は、制御部２６により制御された駆動機構２３により位置がコントロールされている。ノズル２１から吐出された材料は、造形ステージ２７上において所望の形状のパターン層を形成する。なお、ディスペンサを可動する駆動機構２３に代えて、造形ステージをＸ，Ｙ，Ｚ方向に可動制御することも可能である。

パターン層を繰り返し積層することにより、三次元構造体を造形する。ノズルは、一筆式ノズルでも、複数吐出式ノズルでもよい。吐出量、吐出圧、吐出スピード等の条件は、所望の構造により適宜設計し得る。吐出圧を制御することにより、三次元多孔中空骨格１２の径を制御できる。例えば、材料のポリマーの溶融温度の範囲とし、加圧圧力およびノズル掃引速度を任意の範囲に設定できる。

所望の三次元多孔中空骨格は、記憶部２８に格納されたグラフィックデータに基づき制御部２６の指示に基づいて自動造形を行う。従って、患部のサイズや目的に応じてグラフィックデータを作成することにより、組織再生体用足場を設計して造形するテーラーメード医療を実現できる。

上記直接造形法によれば、材料自体の堅軟、粘着性の有無、軟化点・融点や曲げ強度などの制約を受けずに、任意形態の造形物を作成可能である。特に高融点の樹脂においても造形が可能である。

上記加熱溶融による造形方法に代えて、光重合造形法により組織再生体用足場を製造してもよい。例えば、造形ステージに薄膜状の光硬化性組成物を積層し、骨格形成部位に活性光線を照射して硬化せしめたあと、２層目の薄膜を積層して骨格形成部位に活性光線を照射して硬化する工程を繰り返し行い、最終的に未硬化の組成物を除去することにより組織再生体用足場を得てもよい。

また、加熱溶融による造形法や光重合造形法の他に、レーザー焼結法、焼結粒子造形法、溶融積層造形法などを用いることもできる。組織再生体用足場は、前述のとおり樹脂材料に限定されず、リン酸カルシウムやハイドロキシアパタイト等の無機材料など広範な材料に適用できる。無機材料を用いる場合には、例えば、石膏用３Ｄプリンターが好適である。

得られた組織再生体用足場１０は、生理活性物質含有層３０をコーティングする（ステップ２、図３参照）。生理活性物質含有層３０は、細胞を接着させ、増殖させるために必要な因子である。また、生理活性物質含有層内に、毛細血管の新生を促進する生理活性物質を生体移植後に徐放されるようにすることにより、生着率を格段に高めることが可能となる。生理活性物質含有層３０は、生体内に組織再生体を移植した後に、生着率を高めるように成長因子を徐放する役割の他、細胞培養時の細胞の接着性を高め、増殖・成長を促す役割も担うことが好ましい。

生理活性物質含有層３０のコーティング方法としては、例えば、必要な成長因子を徐放作用のあるコレステロールなどの薬剤と混ぜ、分散または溶解された分散液または溶液を組織再生体用足場１０に浸漬する方法により行うことができる。組織を再生するに当たり、細胞培養して細胞層を形成することが重要となる。また、組織再生には、栄養分の送達が重要なため、生体内で栄養を送達する手段である血管が新生されるかどうかが重要となる。このため、細胞接着因子、細胞増殖因子、血管新生因子を含有させることが通常必要となる。また、細胞の増殖・生存・分化を促進するために、通常の培地成分を組み込んでもよい。

細胞接着因子としては、例えば、クラシックカドヘリン（Eカドヘリン、Nカドヘリン、Pカドヘリン）、プロトカドヘリン、デスモソーマルカドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリー(immunoglobulin superfamily:IgSF)、インテグリンなどが例示できる。

血管の新生を誘導するための増殖因子である血管新生因子としては、公知の因子を用いることができる。例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などが例示できる。また、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニン、キチンおよびキトサン等が挙げられる。

成長因子としては、上皮成長因子（Epidermal growth factor：EGF）、インスリン様成長因子（Insulin-like growth factor：IGF）、トランスフォーミング成長因子（Transforming growth factor：TGF）、神経成長因子（Nerve growth factor：NGF）、脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor：BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（Vesicular endothelial growth factor：VEGF）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor：G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor：GM-CSF）、血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor：PDGF）、エリスロポエチン（Erythropoietin：EPO）、トロンボポエチン（Thrombopoietin：TPO）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor：bFGFまたはFGF2）、肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor：HGF）、骨形成タンパク質(Bone Morphogenetic Protein, BMP)等が挙げられる。

生理活性物質含有層３０は、また、血小板由来増殖因子、表皮増殖因子、線維芽増殖因子、増殖分化因子−５、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）および形質転換増殖因子も好適な例として例示できる。

ステップ２の工程前に、生理活性物質含有層３０を組織再生体用足場１０により強固に接着させるために、生理活性物質含有層３０と組織再生体用足場１０の間に、当該生理活性物質含有層の被覆強度を高めるためのバインダー層を形成するための工程（バインダー層形成工程）を設けてもよい。バインダー層により、生理活性物質の生体移植後の徐放能を適宜調整することができる。バインダー層は、生理活性物質含有層３０と組織再生体用足場１０の接着を強固にし、生体適合性の材料であれば特に限定されないが、例えば、フィブリノゲンとトロンビンという物質を抽出したフィブリン糊（生体糊）等が例示できる。生理活性物質含有層を形成するための分散液中に接着成分を含有させるようにしてもよい。

細胞層３１は、組織再生体用足場１０の表層に少なくともターゲット細胞を立体培養させることにより得られる（ステップ３）。細胞層３１を形成させるのに十分な密度で組織再生体用足場１０上にターゲット細胞を播種する。密度は、細胞の種類により異なるので、細胞に応じて最適化する。軟骨細胞の場合、細胞密度は例えば、１，０００〜１００，０００細胞／ｃｍ²である。また、必要とされる数の細胞を培地中に懸濁し、その懸濁液に組織再生体１を浸漬してもよい。細胞の種類によるが、培養は数日間から数週間継続される。培養の間、培地は必要に応じて交換する。通常、培地は培養０．６日から２日毎に交換される。細胞の増殖、生存率および／または細胞−細胞接着を促進する薬剤の添加を、培養過程中に行ってもよい。細胞外マトリックスタンパク質の産生を増加させ、より強固な細胞層を形成するために、例えば、アスコルビン酸、レチノイン酸および銅などを添加してもよい。細胞外マトリックスタンパク質の産生を刺激可能な増殖因子、あるいは増殖因子、微量元素、ビタミン類などの組合せを利用することもできる。ステップ２の工程を省き、またはステップ２の工程と併用して、細胞培養の際に成長因子を混合させてもよい。

細胞は、自家組織細胞、同種間もしくは異種間由来であってもよい。細胞は、細胞源として役割を果たす適切な臓器もしくは組織から得てもよい。間質細胞を得るための臓器もしくは組織処理のための手法は公知の方法を制限なく利用できる。例えば、個々の細胞の懸濁液を得るために、組織もしくは臓器は機械的に破壊および／または細胞間の相互作用を弱める消化酵素もしくはキレート化剤で処理することができる。機械的破壊、酵素処理およびキレート化剤を組み合わせてもよい。また、組織や臓器を機械的に破壊すると同時、またはその後に任意の数の酵素で単独もしくは組合せて処理できる。細胞の解離に有用な酵素の例は、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼ、ディスパーゼなどが例示できるが、これらに限定されない。機械的破壊は、例えばブレンダー、ふるい、ホモジナイザー、圧力セルなどの使用により行ってもよい。

細胞懸濁液と細胞集団は、更に実質的に均質な細胞型の集団に分けられてもよい。これは、例えばポジティブ選択法（例えば、クローン増殖と特定の細胞型の選択）、ネガティブ選択法（例えば、無用な細胞の溶解）、所定密度溶液中の比重に基づく分離、混合された集団中の細胞の特異的付着特性、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）などの細胞分離のための標準的な手法を用いて達成されてもよい。これらの手法で得られた細胞は、培養皿上に播種するのに必要な十分な細胞数を得るための当業者に知られた標準的な細胞培養手法を用いて、培養物中で更に増やすことができる。また、細胞は治療の取り組みを通じて取得されてもよい。

自家組織細胞を用いることにより、免疫反応の影響を無くしたり、抑えたりすることができるが、同種もしくは異種細胞を用いる場合には、身体の免疫反応の考慮が必要な場合もある。シクロスポリン、ＦＫ−５０６もしくはその他の前述の免疫治療薬による補助的免疫療法を併用してもよい。また、宿主の免疫反応を低減あるいは排除することができる遺伝物質を細胞に形質移入してもよい。

本発明に利用できる細胞は、特に限定されないが、例えば、軟骨細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、血管芽細胞、筋芽細胞、上皮細胞、尿路上皮細胞、平滑筋細胞、ケラチン生成細胞、β細胞、内皮細胞、線維細胞、血管内皮細胞、肝細胞、小腸上皮細胞、表皮角化細胞、骨髄間充織細胞、心筋細胞、椎間板細胞、口腔粘膜上皮、胃腸粘膜上皮、尿管上皮、同様にその他の臓器系由来の上皮、骨格関節滑膜、骨膜、軟骨膜、筋細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、心膜、硬膜、髄膜、ケラチン生成細胞前駆細胞、周皮細胞、グリア細胞、神経細胞、羊膜、胎盤膜、漿膜細胞（例えば、体腔を裏打ちする漿膜細胞）、未分化幹細胞、未分化前駆細胞、前分化幹細胞、前分化前駆細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、樹状細胞および遺伝子組み換え細胞からなる群から選択される細胞を例示できる。

幹細胞は特に限定されないが、造血細胞、間葉細胞、産後細胞、膵臓細胞、肝細胞、網膜上皮細胞、嗅球細胞、内皮細胞、筋細胞、脂肪由来細胞、腸骨稜細胞（ileac crest）、骨髄細胞、歯周靱帯細胞、卵形細胞、真皮細胞、臓器特異的幹細胞および臓器特異的幹細胞の前駆細胞が例示できる。

節足動物（昆虫）を含む任意の動物の細胞を使用することもでき、同様に生殖細胞と胚細胞を使用することもできる。実施例は、胚幹細胞、体幹細胞、神経幹細胞、メラニン細胞、血管平滑筋細胞、毛母細胞、星状細胞、小肝細胞、羊膜由来細胞、胎児肝臓由来細胞、胎児腎臓由来細胞、胎児肺由来細胞および細胞系の定着細胞、ＨｅＬａ細胞、ＦＬ細胞、ＫＢ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＷＩ−８８細胞、ＭＡ１０４細胞、ＢＳＣ−１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＶ−１細胞、ＢＨＫ−２１細胞、Ｌ細胞、ＣＬ細胞、ＢＡＥ細胞、ＢＲＬ細胞、ＰＡＥ細胞などを含む。

また、細胞層に用いる細胞として遺伝子操作された細胞を用いることも可能である。遺伝子操作された細胞層は細胞の集団を含み、前記細胞集団のうちの少なくとも一つの細胞は、組織の回復、置換、維持および診断を補助するための外因性のポリヌクレオチドが発現診断のための産物および／または治療のための産物（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を発現するように、外因性ポリヌクレオチドで少なくとも１細胞の細胞集団が形質移入される。本発明に用いることもできる「有益なタンパク質」（および同タンパク質をコード化する遺伝子）の例は、サイトカイン、増殖因子、ケモカイン、走化性ペプチド、メタロプロテイナーゼの組織阻害因子、ホルモン、血管新生の刺激もしくは阻害のいずれかを行う調節因子、免疫調節タンパク質、神経保護タンパク質、神経再生タンパク質およびアポトーシス阻害因子を例示できる。より具体的には、望ましいタンパク質はエリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＫＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−δ、ＭＳＨ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＢＤＮＦ、ＧＤＦ−５、ＢＭＰ−７およびＩＬ−６を例示できる。

細胞層の細胞およびその子孫細胞は、継続的に目的とする遺伝子産物を産生するように設計してもよい。また、細胞は一時的に産物を産生するようにしてもよい。例えばＤＮＡ分子のような外因性ポリヌクレオチドによる細胞の形質転換法もしくは形質移入法は、例えばカルシウム−リン酸もしくはＤＥＡＥ−デキストランを介した形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソームを介した形質移入、直接マイクロインジェクション法およびアデノウイルス感染などの手法を含む。最も広く用いられる方法は、カルシウム−リン酸もしくはＤＥＡＥ−デキストランを介した形質移入法である。遺伝子操作された細胞を有する組織を利用する場合の利点は、比較的少数の遺伝子操作された細胞を単純に播種する場合と比較して、大量の細胞を利用する事ができる点である。

更に、細胞層は、外因的に添加された細胞外マトリックスタンパク質、例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、インテグリン、グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸など）、エラスチンおよびフィブリンで強化された細胞を有していてもよい。また、細胞層３１は外因的に添加された、例えば血管内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞成長因子、インスリン様成長因子および形質転換因子といった増殖因子および／またはサイトカインに組み込んでもよい。

従来の細胞シートにおいては、特に、細胞シートを厚みのある組織の再生に用いる場合、シートを積層して枚数がかさむほど内層奥深くの細胞において、酸素・栄養分の供給や二酸化炭素・老廃物の排泄が困難となり、壊死に陥りやすくなるという問題があった。現時点で達成可能な細胞シートの積層レベルは最大でも２００μｍ程度である。

第１実施形態によれば、内外の表面積の大きな組織再生体用足場１０の表層を足場として、三次元多孔中空骨格を用いているので、目的の細胞を効率よく立体培養できる。また、組織再生体用足場１０の内外の豊富な空隙を通し、物質の供給・排出に不可欠な毛細血管の新生を効率よく行うことができる。また、組織再生体用足場１０を生分解性材料により構成することにより、毛細血管・目的細胞の安定構築が得られた時点で不要になる構造体を、生体吸収または排出させて消失させることができる。即ち、本発明によれば、三次元骨格からなる組織再生体用足場を用いることにより局所循環の確保が容易となる。また、単位体積当たりの細胞接着面積が大きく、物質の交換ルートとして利用できる細かな隙間を形成できるという優れたメリットがある。更に、３Ｄプリンター等を利用した造形装置により、バイオプラスチックなどの材料をコンピュータグラフィックに忠実に、金型なしで成型できるため、迅速・安価に、修復組織の形状に合わせた個別の設計・造形が可能となり、テーラーメード医療も可能となる。また、組織再生体用足場１０を、３Ｄプリンターを用いて製造することにより、安価に個別設計が可能であるという優れたメリットも有する。

［第２実施形態］
次に、上記実施形態とは異なる組織再生体の一例について説明する。第２実施形態に係る組織再生体およびその製造方法は、以下の点を除く基本的な構成および製造方法は第１実施形態と同様である。即ち、第２実施形態においては、組織再生体用足場に支持部が設けられている点において、支持部を設けない第１実施形態とは相違する。

第２実施形態に係る組織再生体は、組織再生体用足場に一体的に支持部が設けられている。例えば、図２Ａに示す組織再生体用足場の底面部に一つ又は複数の脚部となる支持部を設ける。ワイングラスの支え部のような形状でもよいし、机の脚部のような構成でもよい。また、前記構成に代えて、側面において互いに反対方向に延在する軸状の支持部を設けてもよい。支持部を設けることにより、組織再生体用足場の底面を含む全領域を対象に細胞層や生理活性物質含有層を形成することができる。

また、上記構成に代えて、生分解性糸等により組織再生体用足場を吊り下げ、細胞培養を行うことにより、組織再生体用足場の底面を含む全領域を対象に細胞層や生理活性物質含有層を形成してもよい。また、細胞培養中に、載置位置による不均衡を是正するために、組織再生体用足場を回転させたりすることができる。例えば、側面において、互いに反対方向に延在する軸状の支持部を所望の速度で、或いは所望の頻度で回転させることができる。生理活性物質含有層や細胞層が形成された組織再生体は、生体移植するタイミング等において、支持部を切断して切り離すことにより除去される。

第２実施形態に係る組織再生体によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。また、組織再生体用足場の全領域を対象に、細胞層や生理活性物質含有層を効率よく形成できるというメリットを有する。

［第３実施形態］
第３実施形態に係る組織再生体およびその製造方法は、以下の点を除く基本的な構成および製造方法は第１実施形態と同様である。即ち、第３実施形態においては、組織再生体用足場が複数の足場ユニットを合体して得られたものである点において、ワンユニットからなる足場から構成されて成る第１実施形態とは相違する。

第３実施形態に係る組織再生体は、組織再生体用足場が第１足場ユニット、第２足場ユニット、第３足場ユニットからなる。これらは、互いに固設せしめられて、一体的な組織再生態様足場となる。より詳細には、各足場ユニットは棚状の足場ユニットからなる。各足場ユニットの棚状部は三次元中空骨格により構成されている。

なお、各ユニット足場を固設する方法は特に限定されず、種々の方法を適用できる。例えば、凸部と凹部よりなる係合部を足場ユニットに設け、当該係合部同士を嵌合することにより固設する方法、生体適合性および生分解性を示す糸等により固設する方法等が例示できる。

第１ユニット足場には、第１のターゲット細胞を培養させ、第２ユニット足場には、生理活性物質含有層を形成する。そして、第３ユニット足場には、第２のターゲット細胞を培養させる。そして、培養後に、第１ユニット足場と第２ユニット足場を互いに固設せしめる。同様に、第２ユニット足場と第３ユニット足場を互いに固設せしめる。この方法によれば、効率よく複数のターゲット細胞や生理活性物質含有層を取り込んだ組織再生体を簡便に製造できる。

なお、上記例は一例であり、ユニット足場の形状、ユニット足場の個数、各ユニット足場に形成する層等は任意に変更可能である。例えば、各ユニット足場において、生理活性物質層を最下層に形成し、次いで、細胞層を形成してもよい。この場合の細胞層の細胞は、１つである場合に限定されず、複数の細胞を含有することができる。また、細胞層に生理活性物質を任意に含ませることができる。更に、各ユニットを、同一の層構成とすることも可能である。

第３実施形態に係る組織再生体によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。また、複数の細胞層や生理活性物質含有層を組織再生体用足場に簡便に取り込むことができる。第３実施形態の製造方法によれば、同時に培養することが難しい細胞層を組織再生体に組み込みたい用途等において特にメリットがある。

［第４実施形態］
第４実施形態に係る組織再生体およびその製造方法は、以下の点を除く基本的な構成および製造方法は第１実施形態と同様である。即ち、第４実施形態においては、組織再生体用足場に微細孔を有する生理活性物質を収容し、経時的に徐放可能な徐放ユニットを有する点において、徐放ユニットを有さない第１実施形態とは相違する。

第４実施形態に係る組織再生体は、組織再生体用足場に微細孔を有する生理活性物質を注入するための徐放ユニットが設けられている。徐放ユニットは、一つ又は複数設けることができる。徐放ユニットは、予め微細孔を有するように造形することもできるし、造形後に針等により微細孔を形成してもよい。そして、これらの徐放ユニットに、生体移植等を行う前に、生理活性物質を注入すればよい。なお、生理活性物質含有層を組織再生体用足場に形成せずに、徐放ユニットのみから生理活性物質含有層を供給することも可能である。

第４実施形態に係る組織再生体によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。また、組織再生体用足場に生理活性物質含有層の徐放能とは異なる速度で徐放を行うことが可能となり、生体移植後等において、より複雑な徐放を設計することが可能となる。また、複数種類の生理活性物質を異なる徐放能で設計することが容易になるというメリットがある。

［第５実施形態］
第５実施形態に係る組織再生体およびその製造方法は、以下の点を除く基本的な構成および製造方法は第１実施形態と同様である。即ち、第５実施形態においては、組織再生体用足場に微細孔を有する微細孔を有する薬剤注入ユニットを有する点において、薬剤注入ユニットを有さない第１実施形態とは相違する。

第５実施形態に係る組織再生体は、組織再生体用足場に微細孔を有する薬剤注入ユニットが設けられている。薬剤注入ユニットは、一つ又は複数設けることができる。薬剤注入ユニットは、予め微細孔を有するように造形することもできるし、造形後に針等により微細孔を形成してもよい。薬剤注入ユニットは、生体移植後に薬剤を注入するためのユニットである。薬剤注入ユニットは、薬剤を貯めておくための容積を具備し、且つ所望の徐放能を示すように設計された微細孔が設けられている。

第５実施形態に係る組織再生体によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。また、組織再生体用足場に薬剤注入ユニットを設けることにより、生体移植後の治療の幅を広げることができる。また、微細孔のサイズや数を設計することにより、所望の徐放能を付与することが可能となる。また、複数種類の薬剤を異なる徐放能で設計することが容易になるというメリットがある。

［第６実施形態］
第６実施形態に係る組織再生体およびその製造方法は、以下の点を除く基本的な構成および製造方法は第１実施形態と同様である。即ち、第６実施形態においては、組織再生体用足場にマイクロデバイスを組み込んだユニットを有する点において、マイクロデバイスを有さない第１実施形態とは相違する。

第６実施形態に係る組織再生体は、組織再生体用足場にマイクロデバイスが設けられている。マイクロデバイスは生体再生等の趣旨に合致する範囲において特に限定されないが、例えば、マイクロインフュージョンポンプが例示できる。マイクロインフュージョンポンプとしては、例えば、iPRECIO [SMP-200]（プライムテック社製）等が例示できる。マイクロデバイスの別の例としては、チップ搭載型小型電気浸透流ポンプが例示できる。チップ搭載型小型電気浸透流ポンプは、試料・試薬の輸送，反応，分離などの処理の流体制御を行う。例えば、ナノフュージョン社製のチップ搭載型のマイクロ電気浸透流ポンプ等が例示できる。

組織再生体用足場にマイクロインフュージョンポンプを組み込む方法としては、種々の方法が可能であるが、第３実施形態のように、細胞層および生理活性物質含有層が形成された組織再生体用足場からなる第１ユニットと、マイクロデバイスを収容する造形体からなる第２ユニットにそれぞれ係合部を設け、互いに嵌合せしめることにより一体的に構成させる方法が例示できる。また、第１ユニットと第２ユニットとを、生体適合性および生分解性を示す糸等を用いて固設してもよい。また、マイクロデバイスを直接、第１ユニットに固設してもよい。

第６実施形態に係る組織再生体によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。また、組織再生体用足場にマイクロデバイスを設けることにより、生体移植後の治療の選択肢を広げることができる。

［第７実施形態］
第７実施形態に係る組織再生体およびその製造方法は、以下の点を除く基本的な構成および製造方法は第１実施形態と同様である。即ち、第７実施形態においては、組織再生体用足場に磁力集積ユニットを有する点において、磁力集積ユニットを有さない第１実施形態とは相違する。

第７実施形態に係る組織再生体は、組織再生体用足場に磁力集積ユニットが設けられている。磁力集積ユニットは、生体適合性を示す磁力集積手段が足場を構成する造形体によって内包されている。組織再生体用足場に磁力集積ユニットを組み込む方法としては、種々の方法が可能であるが、第３実施形態のように、細胞層および生理活性物質含有層が形成された第１ユニットと、磁力集積手段を収容する第２ユニットにそれぞれ係合部を設け、これらを互いに嵌合せしめることにより一体的に構成させる方法が例示できる。

磁力集積手段の一例としては、本発明者が提案した磁気照射装置（特許文献６）や公知の方法を適用できる。磁力集積手段は、例えば、磁石と、磁石を収容して密封する生体適合性のあるケーシングにより構成することができる。ケーシング材料としては、チタン系材料、セラミック、オキシニウム、超高分子ポリエチレン等が例示できる。磁力集積手段を内包する造形体（第２ユニット）を組織再生体用足場からなる造形体（第１ユニット）同士を嵌合させることにより一体的に構成してもよいし、本発明の組織再生体の係合部と嵌合可能な係合部を上記磁気照射装置に設け、これらを嵌合することにより一体的に形成してもよい。また、係合部に代えて、生体適合性糸などの固設手段を用いて第１ユニットと第２ユニットを一体的に結合させてもよい。

第７実施形態に係る組織再生体によれば、第１実施形態と同様の効果を得ることができる。また、組織再生体用足場に磁力集積ユニットを設けることにより、生体移植後の治療の幅を広げることができる。例えば、上記特許文献６の方法を適用することにより、生体に移植後に薬剤を集中的にそのユニットに投与することが可能となる。

なお、上記実施形態は一例であり、また、各実施形態それぞれにおいても種々の変形が可能である。更に、これらの実施形態は、互いに好適に組み合わせることができる。

本発明に係る組織再生体は、再生医療分野において広範囲に適用できる。特に、従来の二次元の細胞シートにおいては難しかった実質臓器の再生分野に有用である。

１ 組織再生体
１０ 組織再生体用足場
１２ 三次元多孔中空骨格
１３ 中空
１４ 空隙
２０ 造形装置
２１ ノズル
２２ ディスペンサ
２３ 駆動機構
２４ 温度調整部
２５ 圧力調整部
２６ 制御部
２７ 造形ステージ
２８ 記憶部
３０ 生理活性物質含有層
３１ 細胞層

Claims (15)

1. 再生医療用に用いられる組織再生体であって、
   生体適合性および生分解性を示す造形体により構成された三次元多孔中空骨格からなる組織再生体用足場と、
   前記組織再生体用足場に、少なくともターゲット細胞を有する細胞層と、前記ターゲット細胞の接着率を高める接着因子、生着率を高める成長因子および移植後の血管内皮細胞の成長を促進する成長因子の少なくともいずれかを含む生理活性物質含有層とを具備する組織再生体。
2. 前記三次元多孔中空骨格の空隙体積／骨格形成体積が５以上、１０，０００以下である請求項１に記載の組織再生体。
3. 前記組織再生体用足場と、前記生理活性物質含有層の間に、当該生理活性物質含有層の被覆強度を高めるためのバインダー層が形成されている請求項１又は２に記載の組織再生体。
4. 前記造形体が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸とポリ乳酸の共重合体、ポリヒドロキシ酪酸、ポリジオキサノン、ポリカプロラクトン、ポリブチレンサクシネート、リン酸カルシウムおよびハイドロキシアパタイトの少なくともいずれかである請求項１〜３のいずれか１項に記載の組織再生体。
5. 前記細胞層は、軟骨細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、血管芽細胞、筋芽細胞、上皮細胞、尿路上皮細胞、平滑筋細胞、ケラチン生成細胞、β細胞、内皮細胞、線維細胞、血管内皮細胞、肝細胞、小腸上皮細胞、表皮角化細胞、骨髄間充織細胞、心筋細胞、椎間板細胞、口腔粘膜上皮、胃腸粘膜上皮、尿管上皮、骨格関節滑膜、骨膜、軟骨膜、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、心膜、硬膜、髄膜、ケラチン生成細胞前駆細胞、周皮細胞、グリア細胞、神経細胞、羊膜、胎盤膜、漿膜細胞、未分化幹細胞、未分化前駆細胞、前分化幹細胞、前分化前駆細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、樹状細胞および遺伝子組み換え細胞からなる群から選択された細胞を備える請求項１〜４のいずれか１項に記載の組織再生体。
6. 前記細胞層は幹細胞を含み、当該幹細胞は、造血細胞、間葉細胞、産後細胞、膵臓細胞、肝細胞、網膜上皮細胞、嗅球細胞、内皮細胞、筋細胞、脂肪由来細胞、腸骨稜細胞、骨髄細胞、歯周靱帯細胞、卵形細胞、真皮細胞、臓器特異的幹細胞および臓器特異的幹細胞の前駆細胞からなる群から選択された請求項５に記載の組織再生体。
7. 前記細胞層は、細胞外マトリックスタンパク質を更に備える請求項１〜６のいずれか１項に記載の組織再生体。
8. 前記細胞層は、生理活性物質を更に備える請求項１〜７のいずれか１項に記載の組織再生体。
9. 前記生理活性物質含有層は、血管内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、表皮増殖因子、線維芽増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様成長因子、脳由来神経栄養因子、増殖分化因子−５、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、形質転換増殖因子および骨形成タンパク質からなる群から選択される少なくとも一つを含有する請求項８に記載の組織再生体。
10. 前記組織再生体用足場は、フィブリンに基づく材料、コラーゲンに基づく材料、ヒアルロン酸に基づく材料、糖タンパク質に基づく材料、セルロースに基づく材料および絹からなる群から選択されたポリマーを備える請求項１〜９のいずれか１項に記載の組織再生体。
11. 再生医療用に用いられる組織再生体の製造方法であって、
    生体適合性および生分解性を示す造形体よりなる組織再生体用足場を作製する足場作製工程と、
    前記組織再生体用足場の少なくとも一部に、細胞の接着率を高める接着因子、細胞の生着率を高める成長因子、血管新生を促進する成長因子を含む生理活性物質含有層をコーティングする被覆工程と、
    前記組織再生体用足場の少なくとも一部にターゲット細胞を増殖させる培養工程とを備える組織再生体の製造方法。
12. 前記足場作製工程後であって、前記被覆工程前に、前記生理活性物質含有層の被覆強度を高めるために、前記組織再生体用足場と前記生理活性物質含有層の間にバインダー層を形成するバインダー層形成工程を具備する請求項１１に記載の組織再生体の製造方法。
13. 前記足場作製工程は、３Ｄプリンターにより作製する請求項１１又は１２に記載の組織再生体の製造方法。
14. 再生医療用の組織再生体の細胞層の足場となる組織再生体用足場であって、
    生体適合性および生分解性を示す造形体からなり、三次元多孔中空骨格からなる組織再生体用足場。
15. 前記三次元多孔中空骨格の空隙体積／骨格形成体積が５以上、１０，０００以下である請求項１４に記載の組織再生体用足場。