KR20190095940A - 생체 모방 임플란트 - Google Patents

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샤오천 천
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Abstract

척수 및 말초 신경 손상을 위한 이식형 장치가 기술된다. 임플란트는 내부에 배치된 줄기 세포를 갖는 3차원 프린팅된 구조를 포함한다. 개시된 임플란트로 뉴런 손상을 치료하는 방법 또한 개시된다.

Description

생체 모방 임플란트
관련 출원의 상호 참조
본 발명은 2016년 12월 12일 제출된 미국 가출원 제62/433,142호의 이익을 주장하고, 상기 가출원은 그 전체가 참조에 의해 본원에 포함된다.
연방정부 후원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 과제 번호 EB014986 하에 정부 보조로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
기술분야
척수 및 말초 신경 손상의 치료를 위한, 줄기 세포를 포함하는 3차원 생체 모방 임플란트가 본원에 기술된다.
기능성 조직을 바이오프린팅하는 방법은 많은 도전과제에 직면해왔으며, 그 중에서도 세포 성장을 유도하고 조직 성숙을 촉진시키는 데 필수적인 복잡한 3차원(3D) 마이크로아키텍처를 구축하기 위한 적합한 바이오패브리케이션 기술이 부족하다. 중추 신경계 구조의 3차원 프린팅은 이전에 성공적으로 달성되지 못했다.
조직 수복을 위한 이식형 장치 또는 임플란트가 본원에 기술된다. 몇몇 실시양태에서, 조직은 척수 조직 또는 말초 신경 조직일 수 있다. 이들 임플란트는 이러한 유형의 조직 중 어느 하나에 대한 손상을 치료하는 데 사용될 수 있다.
상기 임플란트는 층이 없는 3차원 프린팅된 구조를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 임플란트는 제1 단부 및 제2 단부, 제1 단부에서 시작하여 제2 단부에서 끝나는 하나 이상의 채널, 및 적어도 하나의 채널에 포함된 하나 이상의 유형의 줄기 세포를 포함하는 3차원 프린팅 구조를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트는 생체 모방성이다. 임플란트는 척수를 생체 모방할 수 있으며, 코어(척수 회색질에 해당함) 및 채널을 포함하는 쉘(척수 백질에 해당함)을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 임플란트는 말초 신경을 생체 모방할 수 있으며, 함께 패킹된 선형 채널의 허니콤 구조를 포함할 수 있다. 척수 또는 말초 신경의 경우, 선형 채널은 재생하는 축삭 돌기를 병변의 다른 쪽으로 유도할 수 있다.
따라서, 척수 또는 말초 신경 손상을 위한 생체 모방 임플란트가 본원에 개시되며, 임플란트는 제1 단부 및 제2 단부를 포함하고 코어 및 쉘을 포함하며 손상 부위의 구조를 모방하는 3차원(3D) 임플란트와, 제1 단부에서 시작하고 제2 단부에서 끝나는 쉘 내부의 적어도 하나의 채널과, 적어도 하나의 채널에 포함된 적어도 하나의 유형의 줄기 세포를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트는 3D 프린팅에 의해 제조된다.
몇몇 실시양태에서, 줄기 세포의 적어도 하나의 유형은 신경 줄기 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 신경 줄기 세포는 배아 줄기 세포, iPSC 유래 줄기 세포, 직접 분화된 신경 줄기 세포, 또는 이들의 조합이다. 몇몇 실시양태에서, 줄기 세포의 적어도 하나의 유형은 중간엽 줄기 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 줄기 세포는 BDNF, NT3, GDNF, 또는 이들의 조합을 발현하도록 조작된다.
몇몇 실시양태에서, 3차원 프린팅된 임플란트는 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 또는 젤라틴 메타크릴올, 또는 이들의 조합을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트는 척수를 생체 모방한다. 몇몇 실시양태에서, 임플란트는 말초 신경을 생체 모방한다.
몇몇 실시양태에서, 채널은 선형이다. 몇몇 실시양태에서, 채널은 서로 평행하다. 몇몇 실시양태에서, 채널은 재생하는 축삭 돌기를 제1 단부로부터 제2 단부로 유도한다. 몇몇 실시양태에서, 임플란트는 허니콤 구조로서 클러스터링된 육각형 단면을 갖는 2개 이상의 채널을 포함한다.
치료를 필요로 하는 숙주의 신경학적 손상을 치료하는 방법이 또한 본원에 개시되며, 상기 방법은 본원에 개시된 생체 모방 임플란트를 치료가 필요한 위치에 이식하는 단계; 및 손상 부위에서 세포가 재생되도록 하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 신경학적 손상은 척수 손상, 운동 완전 척수 손상, 운동 불완전 척수 손상, 또는 말초 신경 손상이다. 몇몇 실시양태에서, 신경학적 손상은 척수 손상이다. 몇몇 실시양태에서, 신경학적 손상은 말초 신경 손상이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 숙주에게 물리적 치료를 제공하는 것을 추가로 포함한다.
본원에 개시된 생체 모방 임플란트를 제조하는 방법 또한 본원에 개시되며, 상기 방법은 손상 영역을 결정하기 위해 치료를 필요로 하는 숙주의 척수 또는 말초 신경 위치를 스캐닝하는 단계; 및 손상 영역을 둘러싸도록 임플란트를 3차원으로 프린팅하는 단계를 포함한다.
도 1a-e는 척수 구조를 모방하는 3D 프린팅된 임플란트를 도시한다. 도 1a는 UV 광원(파장 365 nm), 슬라이싱된 이미지 흐름 생성 및 시스템 동기화를 위한 컴퓨터, 광학 패턴 생성을 위한 디지털 마이크로미러 장치(DMD), 투사 광학계 세트, 샘플 위치 제어용 스테이지, 및 제조 과정의 온라인 모니터링을 위한 CCD 이미징 시스템을 포함하는 3D 프린터 셋업을 도시한다. 도 1b는 잉크젯 3D 프린터에서 종종 관찰되는 별개의 층이 없는 구조를 생성하는 마이크로규모의 연속 투사 3D 프린팅(μCPP) 레이어리스(layerless) 3D 프린팅을 도시한다. 도 1c는 온전한 T3 래트 척수에서의 축삭 돌기의 중쇄 신경필라멘트(NF200) 표지화를 도시한다. 이미지의 왼쪽이 문측, 오른쪽이 미측이다. 백질의 축삭 돌기(패널의 상부)는 문측부터 미측까지 이어지는 평행 배열로 고도로 조직화되어 있으며, 회색질의 축삭 돌기(패널의 하부)는 선형 배열로 나타나지 않는다. 개시된 임플란트는 백질의 선형 조직화를 모방한다. 백색 선은 백질과 회색질 사이의 경계를 구분한다. 도 1d는 T3 래트 척수의 배측면 사분면의 상이한 축삭 돌기 관(다발)의 투사를 도시한다. 적색 척수로(루브로-루브로스파이널 트랙(Ru)), 솔기 척수로(라페-라페스파이널 트랙(Ra)), 그물 척수로(레티쿨로-레티쿨로스파이널 트랙(Ret)), 고유 척수로(프로프리오-프로프리오스파이널 트랙(Pr)), 척수 시상로(스피노탈라믹-스피노탈라믹 트랙(ST)), 및 CST-피질척수로(C)가 예시된다. 중앙의 나비모양 부분은 임플란트의 코어(정상 척수의 "회색질"과 유사함)이고 그림의 나머지는 임플란트의 쉘(정상 척수의 "백질"과 유사함)이다. 도 1e는 문측-미측 축으로 이루어진 안내를 도시하며, 이에 의해 재생하는 축삭 돌기(선)가 병변의 먼 쪽의 적절한 관에 유도된다. 화살표는 임플란트의 재생하는 축삭 돌기의 입구와 출구 지점을 가리키며, 임플란트가 병변 부위 전체에서 정확한 3D 좌표를 유지하여 숙주의 자연 구조와 일치하는 것을 보여준다.
도 2는 동적 기계적 분석(DMA)을 사용한 임플란트의 탄성 계수의 기계적 측정치를 도시한다.
도 3a-e는 본원에 개시된 예시적 척추 임플란트를 도시한다. 도 3a는 인간의 임상적으로 완전한(ASIA A) 척수 손상의 시상 중경부의 T1 가중 자기 공명(MR) 이미지를 도시한다. 여분의 숙주 백질의 은(silver)이 병변(화살표)의 앞쪽(오른쪽)에 분명히 나타난다. 도 3b는 도 3a로부터의 낭포성 병변 공동의 추적된 윤곽을 나타낸다. 도 3c는 정확한 병변 형상에 상응하는 3D 프린팅될 임플란트의 컴퓨터 지원 디자인(CAD) 3D 모델을 나타낸다. 도 3d는 프린팅된 임플란트를 나타낸다. 도 3e는 인간 타박상 공동에 도 3d의 프린팅된 3D 임플란트의 가상적인 피팅을 나타낸다.
도 4는 임플란트가 이식된 지 4주 후의 척수 손상 부위에 이식된 3D 프린팅된 임플란트를 도시한다. 도 4는 축삭 돌기에 대해 표지화된(신경필라멘트 NF200) 병변 부위의 임플란트의 단면 이미지를 나타내며, 이는 이식된 지 4주 후에 전체적인 임플란트 구조가 온전히 남아있다는 것을 보여준다(횡단면). 스케일 막대는 500 ㎛이다.
도 5a-c는 이식된 지 4주 후의 척수 손상 부위에 이식된 3D 프린팅된 임플란트를 도시한다. 이식 부위(T3 완전 절단 부위)의 니슬(Nissl) 염색이 아가로스 스캐폴드의 이식 부위의 반응성 세포 층(화살표)을 나타내는 것이 도시되며(도 5a), 이는 본원에 개시된 3D 프린팅된 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트/젤라틴 메타크릴올(PEGDA/GelMa) 임플란트의 이식 후에 상당히 약화된다(도 5b). 스케일 막대는 200 ㎛이다. 왼쪽이 문측, 오른쪽이 미측이다. 파선은 숙주 척수와 임플란트의 경계를 표시한다. 도 5c는 반응성 세포 층(RCL)의 두께의 정량화를 도시하며, ±S.E.M. *p<0.05이다(스튜던트 t-검정).
도 6a-d는 이식된 지 4주 후의 척수 손상 부위에 이식된 3D 프린팅된 임플란트를 도시한다. 병변만을 갖는(임플란트가 없는) 동물에서 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP) 면역반응성에 의해 나타난 숙주 신경교성 반흔(도 6a), 병변 부위의 아가로스 스캐폴드(도 6b), 또는 병변 부위의 3D 프린팅된 임플란트(도 6c)가 도시된다(왼쪽이 문측, 오른쪽이 미측). 도 6a 및 도 6b의 스케일 막대는 250 ㎛이고, 도 6c의 스케일 막대는 100 ㎛이다. GFAP 표지화된 배리어는 3D 프린팅된 PEGDA/GelMa 임플란트 주위에 나타나지 않고, 대신 잠재적으로 축삭 돌기가 연장되는 것을 도울 수 있는 채널 내로 신경교 섬유가 길이방향으로 배열되었다는 것을 유의해야 한다. 도 6d는 병변 부위를 둘러싸는 숙주 척수의 GFAP 강도의 정량화를 도시하며, ±S.E.M. *p<0.05이다(post-hoc Tukey's와 ANOVA).
도 7a-b는 이식된 지 4주 후의 척수 손상 부위에 이식된 3D 프린팅된 임플란트를 도시한다. 임플란트는 혈관화가 잘 되어있고(혈관에 대해 RECA-1 면역표지화)(도 7a), 톨루이딘 블루 염색은 혈관을 보여준다(별표)(도 7b). 도 7a의 스케일 막대는 25 ㎛이고 도 7b의 스케일 막대는 20 ㎛이다.
도 8a-b는 이식된 지 4주 후의 척수 손상 부위에 이식된 3D 프린팅된 임플란트를 도시한다. NF200 표지화된 숙주 축삭 돌기는 아가로스 스캐폴드 주위에 존재하는 반흔을 가로지르지 못하지만(도 8a), 3D 프린팅된 임플란트에 손쉽게 침투한다(도 8b). 스케일 막대는 100 ㎛이다. 점선은 병변 부위의 문측으로부터의 임플란트 입구를 나타낸다.
도 9a-c는 이식된 지 4주 후의 척수 손상 부위에 이식된 3D 프린팅된 임플란트를 도시한다. 도 9a는 인접한 초성화(ensheath) 슈반 세포(Sc)와 관련된 축삭 돌기(별표)를 나타내는 채널 내의 전자 현미경사진이다. 스케일 막대는 1 ㎛이다. 도 9b는 NF200 표지화된 축삭 돌기(화살표)를 초성화하는 S100 표지화된 슈반 세포를 보여주는 도 9a로부터의 확대된 채널을 도시한다. 스케일 막대는 5 ㎛이다. 도 9c는 슈반 세포(SC)를 갖는 임플란트의 수초화 축삭 돌기를 나타내는 채널의 전자 현미경사진이다. 스케일 막대는 0.5 ㎛이다.
도 10a-h는 래트에 이식된 지 4주 후의, 본원에 개시되고 신경 줄기 세포가 로딩된 3D 프린팅된 임플란트를 도시한다. 도 10a는 GFP 발현 신경 줄기 세포(화살표)로 채워진 채널을 도시한다(수평 단면). 스케일 막대는 200 ㎛이다. 도 10b는 숙주 NF200 표지화된 축삭 돌기가 침투하는 채널에 대한 문측 입구를 도시한다; 숙주 세포는 GFP 발현의 부재로 인해 그래프트 유래 축삭 돌기와 구별된다. 스케일 막대는 50 ㎛이다. 도 10c는 이식된 신경 줄기 세포가 임플란트 선형 구조에 의해 선형화된 GFP 발현 축삭 돌기를 연장하는 것을 도시한다. 도 10d는 병변의 문측(왼쪽)으로부터 줄기 세포가 채워진 채널로 들어가서 채널(화살표)에서 선형적으로 재생되는, 5HT 표지화된 숙주 세로토닌성 축삭 돌기를 도시한다. 스케일 막대는 100 ㎛이다. 도 10e는 줄기 세포가 없는 빈 임플란트로 선형적으로 재생되지만, 침투하는 축삭 돌기의 수는 감소되는 세로토닌성 축삭 돌기를 도시한다. 스케일 막대는 100 ㎛이다. 도 10f는 임플란트 구조에 의해 생성된 선형 경계를 고려하여, 줄기 세포를 포함하는 임플란트의 미측 단부로 재생되는 5HT 표지화된 숙주 세로토닌성 축삭 돌기를 도시한다. 스케일 막대는 50 ㎛이다. 도 10g는 임플란트의 미측 부분에 닿는 5HT 축삭 돌기의 정량화를 도시한다. *p<0.05(ANOVA, +S.E.M.). 도 10h는 5HT 표지화된 운동 축삭 돌기가 채널의 미측에서 빠져나와 병변에 원위인 숙주 척수로 재생되는 것을 도시한다. 선은 미측 채널로부터의 출구와 미측 척수의 경계를 표시한다. 스케일 막대는 50 ㎛이다.
도 11은 초미세구조 수준에서, 다양한 직경의 축삭 돌기가 채널 내에 존재하며, 도 10의 임플란트가 이식된 후 많은 축삭 돌기가 수초화된다는 것을 도시한다. 스케일 막대는 500 ㎛이다.
도 12a-b는 이식된 지 4주 후 임플란트 부위의 초미세구조 분석을 도시한다. 도 12a는 다양한 직경의 축삭 돌기(별표)가 채널 내에 존재하고 많은 축삭 돌기가 수초화된 것(M)을 도시한다. 스케일 막대는 500 nm이다. 도 12b는 축삭 돌기를 수초화 및 초성화하기 위해 다수의 프로세스를 보내는 희소 돌기 아교 세포(oligodendrocyte)를 도시한다. 스케일 막대는 0.2 ㎛이다.
도 13은 이식된 지 4주 후, 신경 줄기 세포가 로딩된 프린팅된 임플란트를 도시한다. 시냅스(화살표)는 채널 내의 축삭 돌기와 이식된 신경 줄기 세포의 수상 돌기 사이에 형성된다. 스케일 막대는 200 ㎛이다. 시냅스는 비대칭이고 시냅스전 부톤(bouton)은 둥근 소낭을 포함하여, 이들이 흥분성임을 나타낸다.
도 14a-b는 이식된 지 4주 후, 신경 줄기 세포가 로딩된 프린팅된 임플란트를 도시한다. 도 14a는 이식된 지 4주 후에 임플란트 채널로 재생되는 5HT 숙주 축삭 돌기가 이식된 신경 줄기 세포(GFP)의 수상 돌기(Map2로 표지화됨)와 병렬 접촉(화살표)을 형성하는 것을 도시한다. 스케일 막대는 10 ㎛이다. 도 14b는 임플란트의 미측 단부에 닿는 5HT 축삭 돌기의 정량화를 도시한다. *p<0.05(ANOVA P<0.01, NSC-임플란트 둘 다의 군과 NSC 그래프트만의 군 또는 빈 임플란트 군을 비교하여, post-hoc Tukey's P<0.01).
도 15A-G는 장기간 생체내 연구에서의 신경 줄기 세포가 로딩된 프린팅된 임플란트를 도시한다. 도 15A-E는 임플란트의 6개월 후의 해부학적 구조를 도시한다. 도 15A: 채널은 구조적으로 온전히 유지되고, GFP 발현 신경 줄기 세포로 채워진다. 수평 단면, 왼쪽이 문측이다. 도 15B: RFP로 앞쪽에 표지화된 피질척수 축삭 돌기는 임플란트에 들어가고, 임플란트 구조에 의해 정렬된 미측 방향으로 선형으로 연장된다. 수평 단면. 도 15C: 피질척수 축삭 돌기(CST) 축삭 돌기는 채널 내부의 NeuN 표지화된 뉴런에 수렴하여, 체세포와 함께 잠재적 부톤 같은 접촉을 형성한다. 도 15D: GFP 면역반응성 축삭 돌기는 임플란트로부터 병변에 대해 미측의 숙주 백질 및 회색질로 연장된다. 복외측 백질, 병변에 대해 미측 2 mm. 도 15E: 신경 줄기 세포(NSC) 유래 GFP 표지화된 축삭 돌기는 회색질에 잠재적 부톤 같은 구조를 형성하고, NeuN 면역반응성 축삭 돌기는 병변에 대해 미측 2 mm에 위치한다. 도 15F-G는 행동 연구를 도시한다. 도 15F: 신경 줄기 세포/임플란트 처리된 동물은 임플란트 후 5개월 동안 BBB 운동 스케일에서 상당한 기능적 회복을 보이며, 이는 두 뒷다리의 세 관절 각각의 일관된 움직임을 나타낸다(**p<0.05, *p<0.01). 도 15G: 임플란트 후 6개월에 수행된 전기생리학 연구의 개요. 경두개의 전기 자극이 뇌의 운동 피질에 적용되었고, 운동 유발 전위(MEP)는 뒷다리에서 기록되었다.
도 16a-d는 이식된 지 6달 후의 신경 줄기 세포가 로딩된 3D 프린팅된 임플란트를 도시한다. 3D 프린팅된 줄기 세포 임플란트를 갖는 래트는 MEP 반응의 부분 회복을 나타낸다(도 16a). 이 회복은 임플란트 위의 코드를 후속으로 재절단하면 사라진다(도 16b). 빈 임플란트를 갖는 동물은 MEP의 회복을 보이지 않는다(도 16c). 도 16d는 신경 줄기 세포 함유 임플란트가 이식된 동물에서 평균 MEP 진폭이 상당히 크다는 것을 도시한다(p<0.01).
도 17은 BBB 운동 스케일에서 현저한 기능 개선을 나타내는 줄기 세포가 로딩된 임플란트 동물을 도시하며, 양쪽 다리의 3개의 관절 각각의 움직임을 나타낸다(*p<0.05, **p<0.01). NSC/임플란트 군에서 N=8, 빈 임플란트 군에서 N=6.
도 18a-b는 2 mm(도 18a) 및 4 mm(도 18b)의 상이한 길이의 프린팅된 임플란트의 길이방향 이미지를 도시한다. 스케일 막대는 0.5 mm이다.
도 19a-d는 아가로스(도 19a), PEGDA/GelMa(도 19b), 및 히알루론산 임플란트(도 19c)의 니슬 염색을 도시하며, 4주에서 아가로스 및 PEGDA에서의 임플란트 구조의 지속성 및 히알루론산 스캐폴드의 분해를 보여준다. 도 19d는 PEGDA-GelMa 임플란트에서 RCL의 두께가 현저하게 감소된다는 것을 도시한다(p<0.05, ANOVA; PEGDA 군과 아가로스 및 HA 스캐폴드를 비교하는 post-hoc Tukey's). 평균 ±s.e.m. 스케일 막대는 250 ㎛이다.
도 20은 벽 두께의 감소로 측정된 임플란트 분해를 도시한다. *p<0.0001, **p<0.001. (ANOVA; post-hoc Tukey's).
도 21a-d는 이식된 지 4주 후의 뉴런의 재생을 도시한다. 도 21a는 설치류 신경 줄기 세포로 채널을 완전하고 균일하게 채우며, 또한 임플란트와 숙주 사이의 경계(화살표)를 차지하는 것을 나타내는, 4가지 상이한 동물의 GFP 표지화된 임플란트를 도시한다. 스케일 막대는 0.5 mm이다. 도 21b-c는 GFP 외에도 신경 마커 Hu(도 21b) 또는 NeuN(도 21c)을 발현하는 채널 내의 줄기 세포 유래 세포를 도시한다. 스케일 막대는 5 ㎛이다. 도 21d는 이들이 또한 GFP와 함께 희소 돌기 아교 세포 마커 Olig2를 발현한다는 것을 도시하며, 도 21e는 GFP와 함께 성상세포 마커 GFAP를 예시한다. 스케일 막대는 5 ㎛이다.
도 22는 채널 내 그래프트 세포에서의 줄기 세포 분화 마커 분포를 도시한다.
도 23은 세로토닌성 축삭 돌기(화살표)가 임플란트 없이 병변 부위에 주입된 줄기 세포 그래프트에서 보인다는 것을 도시한다; 축삭 돌기는 수직 방향으로 있고 따라서 병변 부위의 문측-미측 축과 엇갈리게 배열되어 있다. 파선은 그래프트-숙주 경계를 구분한다. 왼쪽이 문측, 오른쪽이 미측(병변 부위)이다. 스케일 막대는 50 ㎛이다.
도 24a-b는 줄기 세포 충전이 없는 채널(도 24a) 또는 임플란트가 없는 줄기 세포 그래프트(도 24b)를 도시하며, 임플란트의 미측에 5HT 표지화된 축삭 돌기를 실질적으로 거의 포함하지 않는다. 스케일 막대는 50 ㎛이다.
도 25는, 채널 내 5HT 표지화된 숙주 운동 축삭 돌기의 10 ㎛ z 스택의 3D 렌더링이 GFP와 함께 표지화되지 않았음을 도시하며, 이는 척수 유래 신경 줄기 세포 그래프트에 세로토닌성 신경 세포체가 없다는 것을 나타낸다.
도 26은 5HT 표지화된 운동 축삭 돌기를 숙주 회색질(K1, 스케일 막대 100 ㎛), 숙주 백질(K2, 스케일 막대 50 ㎛)의 병변에 대해 미측의 숙주 척수에서 볼 수 있고, 백질에서 회색질로 가로지르는 것을 도시한다. 숙주 축삭 돌기에 대한 NF200 염색을 볼 수 있다.
도 27a-b는 혈관화를 나타내는, 신경 줄기 세포가 로딩된 3D 프린팅된 임플란트의 단일 채널을 도시한다. GFP 발현 NSC로 로딩된 채널 내의 GAP43 표지화된 축삭 돌기(도 27a, 스케일 막대 25 ㎛). 임플란트에 대해 미측인, 숙주 척수의 GAP43 표지화된 축삭 돌기(도 27b, 스케일 막대 25 ㎛).
도 28a-b는 톨루이딘 블루 염색을 도시하며, 화살표는 혈관을 가리킨다(도 28a, 스케일 막대 100 ㎛). EM 이미지에서, 혈관은 별표로 표지화된다(도 28b, 스케일 막대 1 ㎛).
도 29는 혈관 주위 세포에 대한 PDGFR 표지화가 BBB 복원을 나타내는 RECA-1 표지화된 혈관을 둘러싸는 혈관 주위 세포를 드러내었음을 도시한다. 스케일 막대는 15 ㎛이다.
도 30은 MEP 반응잠시(latency)가 빈 임플란트 처리된 동물에 비해 줄기 세포 임플란트가 이식된 동물에서 더 짧았으며, 온전한 동물에게서 관찰된 반응잠시에 가까웠다는 것을 도시한다(p<0.01).
도 31은 줄기 세포가 있거나 없는 임플란트가 이식된 동물로부터의 운동 유발 전위 기록을 도시한다.
도 32a는 선형 채널을 포함하는 임플란트를 도시한다. 도 32b는 도 32a의 줌인 버전이다.
도 33a는 함께 패킹된 선형 채널의 허니콤 구조를 포함하는 임플란트를 도시한다. 도 33b는 도 33a의 줌인 버전이다.
임플란트, 및 척수 또는 말초 신경의 복잡한 섬유속 마이크로스케일 아키텍처를 생체 모방하는 재생 촉진 임플란트의 신속한 3차원(3D) 마이크로스케일 프린팅 방법이 본원에 개시된다. 폴리머로 이루어진 임플란트는 신속하게 프린팅될 수 있고, 임상적으로 관련있는 척수 또는 말초 신경 크기 및 병변의 기하학적 구조로 확장이나 축소가 가능하다. 손상된 숙주 축삭 돌기는 3D 생체 모방 임플란트로 재생되고, 장치에 이식된 신경 줄기 세포로 시냅스되며, 그 후 이식된 신경 줄기 세포는 임플란트로부터 손상 부위 아래의 숙주 척수 또는 말초 신경으로 확장되어 시냅스 전달을 복원하고 기능적 결과를 현저히 향상시킨다. 손상 부위를 가로지르는 새로운 대체 전기생리학적 릴레이는 현저한 기능적 운동 향상을 돕는 것을 형성한다. 따라서, 복잡한 3D 생체 모방 임플란트는 정밀 의학을 통해 중추 신경계 재생을 향상시키는 수단을 제공한다.
신체 기능을 복원하는 것을 돕는 의료용 임플란트가 본원에 개시된다. 인간, 말, 돼지, 젖소, 황소, 염소, 양, 돌고래, 개, 고양이, 낙타 등을 포함할 수 있는 포유동물에서 기능이 복원될 수 있다. 한 실시양태에서, 포유동물은 인간이다. 본원의 몇몇 실시양태에서, 포유동물은 숙주라고 언급된다.
몇몇 실시양태에서 이 의료용 임플란트는 척수 또는 말초 신경 손상 후 축삭 돌기의 재생을 촉진시키기 위해 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 의학적 임플란트는 3차원 임플란트 및 선택적으로 줄기 세포를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 임플란트는 3D 프린팅에 의해 제조된다. 이러한 임플란트는 특정 환자의 해부학적 구조에 합치되도록 맞춤 설계될 수 있다. 용어 "스캐폴드" 및 "임플란트"는 상호교환적으로 사용되고, 줄기 세포가 있거나 없는 3D 프린팅된 구조를 언급한다.
생체공학 스캐폴드 또는 임플란트는 척수, 또는 말초 신경, 병변 부위로의 축삭 돌기의 재생을 돕지만, 이러한 기술은 이식 부위에서의 이물 반응, 까다로운 제조 요건, 인간 크기의 손상으로 확대하는 것에 대한 제한 및 자연적인 척수 또는 말초 신경의 생체 모방의 부족에 의해 제한되어왔다. 본원에 기술된 임플란트 및 임플란트의 사용 방법은 척수 또는 말초 신경의 복잡한 섬유속 아키텍처를 생체 모방하는 구조를 포함한다. 프린팅될 수 있는 임플란트는 간단하고 신속하게 제조되고/되거나, 이물 반응을 감소시키고/시키거나, 병변 부위를 가로질러 선형의, 정렬된 숙주 축삭 돌기의 재생을 도울 수 있다. 또한, 신경 줄기 세포가 임플란트에 로딩될 수 있다. 줄기 세포는 병변 부위를 가로질러 그 너머로 가교를 형성함에 따라 숙주 축삭 돌기의 재생을 도울 수 있으며, 생체내에서 기능적 재생을 용이하게 할 수 있다.
척수는 척수 임플란트를 디자인하기 위한 템플릿으로서 사용된다(도 1a). 손상부위의 위와 아래에 숙주 축삭 돌기 관을 갖는 임플란트 채널의 정렬을 제공하기 위해 마이크로채널이 포함된다(도 1d-e). 척수의 내부 "회색질" 영역은 일반적으로 손상 부위 아래로 돌출된 축삭 돌기가 없고, 따라서 임플란트의 이러한 구성요소인 코어는 임플란트의 구조적 완전성을 향상시키는 중실형 영역으로서 디자인된다(도 1d). 아가로스 마이크로채널화 임플란트의 사용은 병변 부위에 들어가는 숙주 축삭 돌기의 80%가 선형, 또는 평행한 도관에 의해 안내되어 병변의 반대쪽(미측) 단부에 도달할 수 있음을 입증하였다. 그러나, 아가로스는 임플란트 내에 축삭 돌기를 감쇠시키고 가두는 콜라겐 기반 반응성 세포 층으로 이루어진 이물 반응을 유발하여, 채널 너머로의 축삭 돌기 성장을 막는다. 따라서, 이물 반응의 감소로 인해 반응성 세포 층이 감소되어 숙주 축삭 돌기가 잘 침투하고 심지어 병변 너머로 가로지르게 하는, 분해가능한 재료의 혼합물로부터 제조된 임플란트가 본원에 개시된다.
임플란트를 형성하는 데 사용되는 재료는 생물학적으로 허용가능한 폴리머를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA) 및 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드와 같은, 하지만 이에 한정되지 않는 폴리에틸렌 글리콜 기반 폴리머를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리머는 젤라틴 메타크릴올(GelMA) 하이드로젤을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드, 및 젤라틴 메타크릴올의 조합을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트와 젤라틴 메타크릴올의 조합을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리머는 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴아미드와 젤라틴 메타크릴올의 조합을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 생체적합성 재료인 PEGDA는 임플란트 재료로서 사용된다. PEGDA는 세포에 대해 비접착성이며, 따라서 세포 결합 리간드 및 매트릭스 메탈로프로티나제 분해 부위를 유지하는 광중합가능한 변성 콜라겐인 젤라틴 메타크릴레이트(GelMa)가 포함되어, 세포가 임플란트 벽에 부착되는 것과 장기간 세포 생존능력을 돕는다. 각 재료의 다양한 농도 및 프린팅된 임플란트의 가교결합 밀도가, 이러한 조합이 원래의 척수, 또는 말초 신경, 조직의 기계적 특성을 모방한다고 확인될 때까지 테스트되는데, 그 이유는 임플란트와 숙주 사이의 기계적 특성의 불일치는 척수 또는 말초 신경 경계에서의 압축 또는 찢어짐으로 이어지고, 통합의 실패를 유발할 수 있기 때문이다.
3D 바이오프린팅의 이점은 자기 공명 영상(MRI)에서 확인될 수 있는 개별 환자의 병변 부위에 정합하도록 상이한 크기 및 불규칙한 형상의 임플란트를 신속하게 프린팅할 수 있다는 것이다. PEGDA/GelMa로 형성된 임플란트는 도 3a-e에 나타나듯이, MRI에 따른 인간 척수 병변 공동의 정확한 형상에 정합하도록 프린팅된다. 더 복잡한 인간 손상 공동의 모폴로지에 정합하는 임플란트도 프린팅되었다.
본원에 개시된 임플란트는 코어와 쉘을 포함한다. 코어는 일반적인 척수 또는 말초 신경의 "회색질" 부분과 유사하고, 쉘은 일반적인 척수 또는 말초 신경의 "백질" 부분과 유사하다.
임플란트는 하나 이상의 채널을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 채널은 쉘 내에 있다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 채널은 제1 표면에서 제2 표면으로 연장된다. 몇몇 실시양태에서, 제1 표면은 상면이고 제2 표면은 하면이다. 몇몇 실시양태에서, 제1 표면은 하면이고 제2 표면은 상면이다. 몇몇 실시양태에서, 제1 표면은 제1 측면이고 제2 표면은 제2 측면이다. 몇몇 실시양태에서, 제1 표면은 상면이고 제2 표면은 측면이다. 몇몇 실시양태에서, 제1 표면은 하면이고 제2 표면은 측면이다.
채널은 조직 내성장에 도움이 되는 단면 형상을 가질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 단면 형상은 정사각형, 삼각형, 오각형, 육각형, 칠각형, 팔각형, 직사각형, 사다리꼴, 타원, 톡스(torx), 임의의 팔 갯수의 별 모양, 클로버 모양, 임의의 팔 갯수의 잎 모양, 다른 곡선 또는 직선 모양 등등, 또는 이들의 조합일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 채널의 군 또는 클러스터는 허니콤 배열을 가질 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 2개 이상의 상이한 채널의 단면이 단일 임플란트에 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 몇몇 채널은 단면이 직사각형이고 몇몇은 육각형이다(허니콤 구조를 구성한다). 치료 목적을 달성하는 어떠한 조합이든 사용될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트에 적어도 한 유형의 줄기 세포가 로딩될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 한 유형의 줄기 세포는 신경 줄기 세포이다. 신경 줄기 세포는 배아 줄기 세포, iPSC 유래 줄기 세포, 분화된 줄기 세포, 직접 분화된 신경 줄기 세포(예를 들어, 줄기 세포 상태를 거치지 않고 피부에서 뉴런으로의 분화), GFP 발현 신경 줄기 세포, 또는 이들의 조합이다. 다른 실시양태에서, 적어도 한 유형의 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 줄기 세포는 BDNF, NT3, GDNF, 또는 이들의 조합을 발현하도록 조작될 수 있다.
임플란트는 실질적으로 임의의 길이로 형성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 임플란트는 길이가 약 1 mm, 약 2 mm, 약 3 mm, 약 4 mm, 약 5 mm, 약 6 mm, 약 7 mm, 약 8 mm, 약 9 mm, 약 10 mm, 약 20 mm, 약 30 mm, 약 40 mm, 약 50 mm, 약 2 mm 내지 약 4 mm, 약 2 mm 내지 약 10 mm, 또는 약 2 mm 내지 약 20 mm일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트는 척수 구조를 모방하는 형상과 구조로 형성될 수 있다. 이러한 구조는 축삭 돌기 관과 채널을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 축삭 돌기 관은 루브로-루브로스파이널 트랙, 라페-라페스파이널 트랙, 레티쿨로-레티쿨로스파이널 트랙, 프로프리오-프로프리오스파이널 트랙, 스피노탈라믹-스피노탈라믹 트랙, 및 CST-피질척수로를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트는, 병변 부위 전체에 걸쳐 3D 좌표를 유지하여 천연 숙주 아키텍처와 일치하는, 본원에서 "채널"로서 언급되는, 임플란트 내의 축삭 돌기로의 입구와 출구를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트는 탄성 계수가 약 250 kPa 초과, 약 200 kPa 초과, 약 300 kPa 초과, 약 250 kPa 내지 약 300 kPa, 또는 약 200 kPa 내지 약 300 kPa일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트는 실질적으로 생체안정성이다. 실질적으로 생체안정성은 임플란트가 이식된 지 3달 후, 4달 후, 5달 후, 6달 후, 1년 후, 또는 5년 후에 80% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 99% 초과, 또는 완전히 온전한 것을 의미한다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트는 이의 표면 상의 콜라겐 침착을 저지할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 기술된 임플란트는 다른 폴리머 또는 금속 재료로 형성된 임플란트와 비교할 때 약 50% 초과, 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과, 또는 약 95% 초과만큼 콜라겐 침착을 감소시킬 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트는 이식 부위에서의 반응성 세포 침착을 저지할 수 있다(또는 반응성 세포 층의 크기를 감소시킬 수 있다). 몇몇 실시양태에서, 본원에 기술된 임플란트는 다른 폴리머 또는 금속 재료로 형성된 임플란트와 비교할 때 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 약 50% 초과, 또는 약 60% 초과만큼 반응성 세포 층의 크기를 감소시킬 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 기술된 임플란트는 아가로스로 형성된 임플란트와 비교할 때 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 약 50% 초과, 또는 약 60% 초과만큼 반응성 세포 층의 크기를 감소시킬 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트는 이식 후 두께가 약 400 ㎛ 미만, 약 350 ㎛ 미만, 약 300 ㎛ 미만, 약 250 ㎛ 미만, 또는 약 400 ㎛ 내지 약 200 ㎛인 최소 반응성 세포 층을 유인할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트는 다른 폴리머 또는 금속 재료로 형성된 임플란트와 비교할 때 약 50% 초과, 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 또는 약 90% 초과만큼 이식 부위의 신경교성 반흔 형성을 감소시킬 수 있다. 신경교성 반흔 형성(글리오시스(gliosis))은 중추 신경계의 외상 후에 나타나는 아스트로글리오시스(astrogliosis)를 포함하는 반응성 세포 프로세스이다. 몇몇 실시양태에서, 임플란트는 아가로스로 형성된 임플란트와 비교할 때 약 50% 초과, 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 또는 약 90% 초과만큼 이식 부위의 신경교성 반흔 형성을 감소시킬 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트는 치료되지 않은 병변과 비교하여 약 20% 초과, 약 30% 초과, 약 40% 초과, 약 50% 초과, 또는 약 60% 초과만큼 이식 부위의 신경교성 반흔 형성을 감소시킬 수 있다.
아가로스 임플란트와 비교할 때, 본 발명의 임플란트는 잠재적으로 연장되는 축삭 돌기를 지지할 수 있는 채널 내로 길이방향으로 배열되는 신경교 섬유를 유도할 수 있다.
본원에 기술되는 임플란트는 혈관화가 잘 되어 혈관이 임플란트로 침윤하는 것을 허용할 수 있다.
또한, 임플란트는 축삭 돌기가 임플란트 재료를 침투하도록 할 수 있다. 이러한 침투는 아가로스 기반 임플란트와 같은 다른 임플란트와는 대조적인데, 이러한 임플란트에서는 축삭 돌기가 이러한 임플란트 주위에 발생하는 성상세포 반흔을 가로지르지 못한다. 본원에 기술된 임플란트를 관통하는 축삭 돌기는 인접한 초성화 슈반 세포와 연관될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트에 적어도 한 유형의 줄기 세포가 로딩될 경우, 숙주 축삭 돌기는 줄기 세포가 채워진 채널에 들어가서 채널에서 선형적으로 또는 평행하게 재생될 수 있다. 다른 실시양태에서, 숙주 세로토닌성 축삭 돌기는 병변의 문측으로부터 줄기 세포가 채워진 채널에 들어가서 채널에서 선형적으로 또는 평행하게 재생될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 세로토닌성 축삭 돌기는 줄기 세포가 없는 경우에도 임플란트에 들어가서 채널에서 선형적으로 또는 평행하게 재생될 수 있다. 그러나, 줄기 세포를 함유한 임플란트와 비교할 때 이러한 재생은 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 또는 약 40% 내지 약 50%만큼 감소될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 재생하는 숙주 축삭 돌기는 임플란트의 미측 부분에 닿을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 한 유형의 줄기 세포가 로딩되는 경우, 임플란트는 줄기 세포가 없는 임플란트와 비교할 때 적어도 약 50%, 적어도 약 80%, 적어도 약 100%, 또는 적어도 약 120%만큼 임플란트의 미측 부분에 닿는 축삭 돌기의 증가를 유발한다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트는 운동 축삭 돌기가 채널의 미측을 빠져나와 병변 원위부의 숙주 척수, 또는 말초 신경으로 재생하도록 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 운동 축삭 돌기는 병변을 넘어 약 3.5 mm까지, 약 2.5 mm까지, 또는 약 4.5 mm까지, 검출가능한 상태로 남아있을 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 기술된 임플란트의 채널은 다양한 직경의 축삭 돌기를 수용하거나 유인할 수 있다. 또한, 채널에서 재생된 축삭 돌기는 수초화될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 축삭 돌기가 채널 내에서 형성되는 경우, 시냅스는 채널 내의 축삭 돌기와 이식된 신경 줄기 세포의 수상 돌기 사이에 형성될 수 있다. 시냅스는 둥근 소낭을 포함하는 비대칭이고/이거나 시냅스전 부톤일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 형성된 시냅스의 적어도 일부는 흥분성일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 숙주 축삭 돌기는 채널로 재생되고 이식된 신경 줄기 세포의 수상 돌기와 병치 접촉을 형성할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 기술된 임플란트는 운동 유발 전위(MEP) 반응의 적어도 부분적 회복을 제공할 수 있다. 운동 유발 전위는 척수의 자기적 또는 전기적 직접 자극에 따라 근육으로부터 기록된다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 MEP 반응은 손가락 및 발가락을 포함하는 팔 및/또는 다리에 있을 수 있다. 줄기 세포가 로딩된 임플란트는 빈 임플란트와 비교할 때 약 4배 내지 약 10배, 약 3배 내지 약 10배, 약 4배 내지 약 8배, 또는 약 3배 내지 약 8배만큼 MEP 반응을 증가시킬 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 기술된 임플란트는 손상후 운동 행동의 적어도 부분적 기능 향상을 제공할 수 있다. 설치류의 손상후 운동 행동은 Basso, Beattie 및 Bresnahan(BBB) 운동 스케일을 통해 측정된다. 스케일(0 내지 21)은 순차적인 회복 단계를 나타내며 관절 움직임, 뒷다리 움직임, 스테핑, 앞다리 및 뒷다리의 조화, 몸통의 위치 및 안정성, 발 배치, 및 미측 위치의 조합을 분류한다.
몇몇 실시양태에서, 이식 후, 임플란트 채널은 줄기 세포로 균일하게 채워질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이식 후, 채널은 신경 줄기 세포로 균일하게 채워질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 줄기 세포는 임플란트와 숙주 사이의 경계면을 차지할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 채널 내의 줄기 세포 유래 세포는 Hu 또는 NeuN과 같은(하지만 이에 한정되지 않는) 신경 마커를 발현할 수 있다. 다른 실시양태에서, 채널 내의 줄기 세포 유래 세포는 Olig2와 같은(하지만 이에 한정되지 않는) 희소 돌기 아교 세포 마커, 또는 GFAP와 같은(하지만 이에 한정되지 않는) 성상세포 마커를 발현할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 전술한 것 중 둘 이상을 발현할 수 있다.
놀랍게도, 몇몇 실시양태에서, 척수 유래 신경 줄기 세포 그래프트에 세로토닌성 신경 세포체가 존재하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 척수 유래 신경 줄기 세포 그래프트에 세로토닌성 신경 세포체가 실질적으로 존재하지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 적어도 한 유형의 줄기 세포가 로딩된 본원에 기술된 임플란트가 이식된 숙주는 빈 임플란트가 이식된 숙주에 비해 짧은 MEP 반응잠시를 나타낼 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 한 유형의 줄기 세포가 로딩된 본원에 기술된 임플란트가 이식된 숙주는 온전한 숙주에서 관찰된 반응잠시와 매우 유사한 MEP 지연을 나타낼 수 있다. 몇몇 실시양태에서, MEP 반응잠시는 약 9 ms 내지 약 12 ms, 약 8 ms 내지 약 10 ms, 약 8 ms 내지 약 12 ms, 약 9 ms 내지 약 10 ms, 또는 약 7 ms 내지 약 13 ms일 수 있다.
논의되었듯이, 몇몇 실시양태에서, 본원에 기술된 임플란트는 프린팅된다. 기능성 조직을 바이오프린팅하는 것은 일반적으로 많은 도전과제에 직면하는데, 그 중에서도 세포 성장을 유도하고 조직 성숙을 촉진시키는 데 필수적인 복잡한 3D 마이크로아키텍처를 구축하기 위한 적절한 바이오패브리케이션 기술이 부족하다. 일반적인 잉크젯 또는 압출 기반 바이오프린팅 접근법은 노즐을 사용하여 피부, 연골과 같은 간단한 2D 구조 및 혈관, 대동맥 판막, 기관과 같은 간단한 3D 구조의 프린팅을 가능하게 하는 재료를 증착시킨다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 기술된 임플란트는 마이크로스케일 연속 투사 3D 프린팅(μCPP)을 사용하여 제조될 수 있다. 마이크로스케일 연속 투사 3D 프린팅은 다양한 생체재료 및 세포와 함께 복잡한 3D 아키텍처를 제조할 수 있다. 이러한 프린팅은 X 및 Y 방향 둘 다로의 스캐닝 없이 달성될 수 있다(노즐 기반 접근법과는 대조적으로). 따라서, 3D 물체는 Z 방향으로 하나의 연속적인 프린팅으로 제조될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 전체 임플란트를 프린팅하는 데 수 초만이 필요할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 임플란트는 약 1초, 약 2초, 약 2초 미만, 약 3초 미만, 약 4초 미만, 약 5초 미만, 약 10초 미만, 약 20초 미만, 또는 약 30초 미만 내에 프린팅될 수 있다. 한 실시양태에서, 전체 2 mm의 임플란트를 프린팅하는 데 1.6초만이 필요하다. 이러한 프린팅 속도는 전통적 노즐 프린터보다 약 1,000배 빠른 속도에 해당한다.
중합에 집속 광을 사용하는 것은 노즐 기반 잉크젯 프린터보다 50배 향상된 1 ㎛의 프린팅 해상도를 만들어낸다. 잉크젯 또는 압출 기반 접근법에서, 기계적 완전성은 드롭 또는 라인 사이의 인공적 경계면에 의해 훼손될 수 있으며, 생체내 적용 중 또는 후에 기계적 결함을 야기할 수 있다. Z 방향으로 층이 없는 해상도를 제공함으로써, 선형 스테이지가 새로운 위치로 이동하여 유도된 이러한 평면 인공 구조(경계면)를 나타내지 않을 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 μCPP는 3D 프린팅된 임플란트의 기계적 완전성을 향상시킬 수 있으며, 마이크로스케일 해상도에서 복잡한 3D 생체 모방 구조의 신속한 제조를 제공할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 임플란트는 척수 절단 또는 말초 신경 손상 부위에 이식하기 위해 단일 부분으로 프린팅된다. 몇몇 실시양태에서, 임플란트는 둘 이상의 부분으로 프린팅되어, 손상되었지만 절단되지 않은 척수, 또는 말초 신경이 본원에 기술된 임플란트로 치료될 수 있다. 척수 손상(SCI), 또는 말초 신경 손상이 절단이 아닌 경우, 임플란트의 하나 이상의 부분이 생물학적으로 허용가능한 접착제를 사용하여 서로 붙어있는 생존 조직 및 부분을 둘러싸도록 이식될 수 있다. 따라서, 임의의 생존 조직은 유지될 수 있고 숙주 척수 또는 말초 신경의 재생이 손상 부위에서 촉진된다.
임플란트는 각 환자에 대해 맞춤 제작된다. 환자의 척수 또는 말초 신경 손상을 이미지화할 때 CAD 소프트웨어를 사용하여 3D 모델이 만들어진다. 그 후 이 모델은 병변에 합치하고 병변을 채우는 환자 특이적 임플란트를 프린팅하는 데 사용된다. 따라서, 때때로 도 1d에 디자인된 전체 임플란트를 프린팅할 필요가 없다. 손상이 전체 척수만큼 크지 않은 경우(부분 병변) 모델은 도 1d에 도시된 것보다 작을 것이다. 의사는 병변의 어느 부분, 또는 전부를 임플란트로 채울지 최종 결정을 내릴 것이다. 예를 들어, 의사는 채널 부분만을 프린팅하도록 결정할 수 있다(나비 형상 없이).
다른 실시양태에서, 3D 프린팅된 생체 모방 임플란트는 척수 또는 말초 신경 손상에 기반하여 프린팅되고, 프린팅된 임플란트의 일부만이 손상 부위에 이식된다. 몇몇 실시양태에서, 허니콤 부분만이 이식된다.
본원에 기술된 임플란트는 생체내 안전성을 나타내고 심각한(완전한) SCI의 부위를 가로지르는 축삭 돌기의 재생 및 재수초화를 도울 수 있다. 미국의 50만 명이 넘는 사람들이 SCI로 고통받으며, 환자와 보호자 모두에게 상당한 정신적 및 경제적 비용을 초래한다. 본원에 기술된 장치 및 방법을 사용하는 3차원 프린팅은 축삭 돌기의 재생을 자극하고, 유도하고, 정렬하도록 개인의 손상의 정확한 해부학적 구조에 "합치하는" 개인 맞춤 임플란트의 제조를 가능하게 한다. 또한, 신경의 수복 또는 재수초화를 추가로 돕는 임플란트를 제조하기 위해 임플란트에 신경 줄기 세포가 로딩될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 숙주 운동 축삭 돌기는 생체 모방 임플란트를 통해 완전한 척수, 또는 말초 신경, 병변 부위를 넘어 원위 척수, 또는 말초 신경으로 재생되고 가교할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 임플란트 및 치료 방법은 SCI의 가장 어려운 모델인 완전한 척수 절단에서 기능의 회복을 도울 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 신속한 3D 프린팅과 줄기 세포 생물학의 융합으로, 본 발명의 임플란트는 환자 특이적 재생 치료를 제공함으로써 척수 또는 말초 신경 치료를 제공할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 임플란트는 척수 또는 말초 신경 손상 후 축삭 돌기 재생을 촉진시킬 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 임플란트는 1 mm 내지 20 mm 또는 그 이상의 거리에 걸쳐 수백 개 이상의 손상된 숙주 축삭 돌기의 재생 또는 재수초화를 제공할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 임플란트는 1 mm 내지 20 mm 또는 그 이상의 거리에 걸쳐 수천 개 이상의 손상된 숙주 축삭 돌기의 재생 또는 재수초화를 제공할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 임플란트는 1 mm 내지 20 mm, 1 mm 내지 10 mm, 1 mm 내지 5 mm, 1 mm 내지 4 mm, 1 mm 내지 3 mm, 1 mm 내지 2 mm, 2 mm 내지 4 mm, 3 mm 내지 4 mm, 2 mm 내지 5 mm, 또는 3 mm 내지 5 mm의 거리에 걸쳐 숙주 축삭 돌기의 재생 또는 재수초화를 제공할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 임플란트는 약 50 mm 초과, 약 100 mm 초과, 약 150 mm 초과, 약 200 mm 초과, 또는 그 이상의 거리로 연장될 수 있는 축삭 돌기를 도울 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 임플란트는 완전한 척수 또는 말초 신경 절단 후에도 숙주에게 기능 개선을 제공할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 임플란트는 줄기 세포 이식 후 숙주에게 손상된 회로의 "접합"을 유도하는 기능적 이점을 제공할 수 있으며, 이 때 숙주 축삭 돌기는 그래프트의 뉴런과 함께 침투하고 시냅스하며, 이어서 그래프트 유래 축삭 돌기는 병변 부위로부터 연장되고 손상에 대해 미측의 숙주 척수내 또는 말초 신경과 시냅스한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 임플란트는 병변 부위의 신경 줄기 세포 임플란트로부터 나오는 축삭 돌기의 기능적 유용성을 최적화할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 임플란트는 접합된 회로와 이들의 적절한 미측 백질 돌출부를 정렬시킬 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 임플란트는 각각의 환자 병변에 "커스텀 핏(custom fit)"을 제공할 수 있다.
본원에 기술된 임플란트의 제조 방법 또한 기술된다. 상기 방법은 치료가 필요한 영역을 스캐닝하는 단계 및 본원에 기술된 임플란트를 프린팅하는 단계를 포함할 수 있다. 프린팅은 3D 프린팅에 의한 것일 수 있다.
또한, 본원에 기술된 임플란트를 사용하여 병태를 치료하는 방법이 기술된다. 병태는 신경학적 손상, 척수 손상, 운동 완전 척수 손상, 운동 불완전 척수 손상, 말초 신경 손상, 장기능 장애, 실금, 발기부전, 다른 성기능 장애, 통증, 무감각, 신경병증, 체온 조절 장애, 기타 등등, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 병태의 일부는 척수 손상의 후유증이며 따라서 손상 부위를 치료하는 것 및 손상 부위의 기능을 회복하는 것은 하나 이상의 후유증을 치료하는 것이다.
한 실시양태에서, 신경학적 손상의 치료 방법이 기술된다. 신경학적 손상의 치료 방법은 치료가 필요한 영역을 스캐닝하는 단계, 본원에 기술된 임플란트를 프린팅하는 단계, 상기 영역 내의 위치에 임플란트를 이식하는 단계, 및 신경학적 손상을 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 척수 손상의 치료 방법이 기술된다. 척수 손상의 치료 방법은 치료가 필요한 영역을 스캐닝하는 단계, 본원에 기술된 임플란트를 프린팅하는 단계, 상기 영역 내의 위치에 임플란트를 이식하는 단계, 및 척수 손상을 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 운동 완전 척수 손상의 치료 방법이 기술된다. 운동 완전 척수 손상의 치료 방법은 치료가 필요한 척수의 영역을 스캐닝하는 단계, 본원에 기술된 임플란트를 프린팅하는 단계, 상기 영역 내의 위치에 임플란트를 이식하는 단계, 및 운동 완전 척수 손상을 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 마비의 치료 방법이 기술된다. 마비의 치료 방법은 치료가 필요한 척수의 영역을 스캐닝하는 단계, 본원에 기술된 임플란트를 프린팅하는 단계, 상기 영역 내의 위치에 임플란트를 이식하는 단계, 및 마비를 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 척수 손상에 의한 장기능 장애의 치료 방법이 기술된다. 척수 손상에 의한 장기능 장애의 치료 방법은 치료가 필요한 척수의 영역을 스캐닝하는 단계, 본원에 기술된 임플란트를 프린팅하는 단계, 상기 영역 내의 위치에 임플란트를 이식하는 단계, 및 척수 손상에 의한 장기능 장애를 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 척수 손상에 의한 발기부전의 치료 방법이 기술된다. 척수 손상에 의한 발기부전의 치료 방법은 치료가 필요한 척수의 영역을 스캐닝하는 단계, 본원에 기술된 임플란트를 프린팅하는 단계, 상기 영역 내의 위치에 임플란트를 이식하는 단계, 및 척수 손상에 의한 발기부전을 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 통증의 치료 방법이 기술된다. 통증의 치료 방법은 치료가 필요한 척수의 영역을 스캐닝하는 단계, 본원에 기술된 임플란트를 프린팅하는 단계, 상기 영역 내의 위치에 임플란트를 이식하는 단계, 및 통증을 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 말초 신경 손상의 치료 방법이 기술된다. 완전 또는 부분적 말초 신경 손상의 치료 방법은 치료가 필요한 말초 신경 부위의 영역을 스캐닝하는 단계, 본원에 기술된 임플란트를 프린팅하는 단계, 상기 영역 내의 위치에 임플란트를 이식하는 단계, 및 말초 신경 손상을 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 위치는 척수 병변일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 위치는 말초 신경 병변일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 치료 방법은 개체가 다른 치료 양식을 받게 하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 치료 양식은 피험자를 신체적으로 훈련시키고, 이에 의해 외상에 의해 손상된 피험자의 신체의 부분에 추가적인 신경학적 신호를 제공하도록 구성된 훈련 장치 또는 시스템을 포함할 수 있다. 훈련 장치는 훈련을 돕기 위해 로봇공학, 외골격, 트레드밀, 지팡이, 보행기, 목발, 체중 보조 시스템, 물리 치료, 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 치료 방법은 임플란트 채널을 통해 성장하는 축삭 돌기를 추가로 포함할 수 있다.
키트 또한 기술된다. 키트는 통합 용기 내에 임플란트, 및 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
몇몇 키트는 통합 용기 내에 치료가 필요한 영역의 스캔 및 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
다른 키트는 통합 용기 내에 치료가 필요한 영역의 스캔, 임플란트를 프린팅하는 데 필요한 폴리머, 및 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
다른 키트는 통합 용기 내에 치료가 필요한 영역의 스캔, 임플란트를 프린팅하기 위한 PEGDA 및 GelMa, 및 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다.
실시예 1
척수 임플란트를 디자인하기 위한 템플릿으로 래트 척수를 사용하였다.
이 실시예에 사용된 임플란트 재료: PEGDA(Mn=700 Da)를 Sigma-Aldrich(미국)로부터 구입하였다. 젤라틴 메타크릴레이트(GelMa)를 선행 문헌에 기술된 대로 합성하였다(Soman, P. et al., Biotechnol Bioeng 110:3038-3047, 2013). 광개시제 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP)를 선행 문헌에 기술된 대로 합성하였다(Fairbanks, B.D. et al., Biomaterials 30:6702-6707, 2009). Dulbecco 인산 완충 식염수(DPBS) 중에 7.5%(w/v) GelMa, 25%(v/v) PEGDA 및 0.025%(w/v) LAP를 혼합시킴으로써 임플란트를 프린팅하는 데 사용되는 매트릭스 재료를 만들었다.
이 실시예에 사용된 임플란트 3D 프린팅: 본원에 기술된 3D 바이오프린터(μCPP)는 도 1a에 도시된 하기 6개의 구성요소를 포함한다: (1) 광중합을 위한 UV LED 광원(365 nm); (2) 광학 패턴 생성을 위한, 1920×1080 마이크로미러로 이루어진 디지털 마이크로미러 배열 장치(DMD) 칩(Texas Instruments); (3) DMD 칩 상의 광학 패턴을 스테이지 상의 제조 평면에 영상화하기 위한 투사 광학계; (4) 제조를 위한 모노머 용액을 유지하는 자동 스테이지; (5) 실시간 모니터링 및 제조 공정의 영상화를 위한 디지털 카메라; 및 (6) 3D 프린팅 공정을 위한 UV 광원, DMD 칩, 스테이지 및 카메라를 조정하는 컴퓨터.
이 실시예에 사용된 래트 척수 임플란트 프린팅: 코어의 디지털 이미지(척수의 회색질에 해당함) 및 쉘(척수의 백질에 해당함)을 척수의 단면 이미지를 가공하여 생성하였고, 그 후에 이들을 DMD 칩으로 임포트하여 프린팅 공정 동안 마이크로미러를 제어하였다. 채널(직경 200 ㎛)을 쉘에 도입하여 축삭 돌기의 재생을 위한 선형, 또는 평행한 안내를 제공하였다. 프린팅된 임플란트의 기계적 강도를 향상시키기 위해 코어를 GelMa, 25%(v/v) PEGDA 및 0.225%(w/v) LAP의 중실형 블록으로 디자인하였다. 프린팅된 임플란트의 Z축 높이를 제어하기 위해 매트릭스 재료의 모노머 용액을 2 mm PDMS 스페이서가 있는 저장조에 로딩하였다. 3D 프린터를 제어하기 위한 자체 개발 소프트웨어를 사용하여 연속 프린팅 공정을 개시하였다. 임플란트를, 쉘 이미지를 위한 단계와 코어 이미지를 위한 단계의 두 단계로 프린팅하였는데, 각 단계는 0.8초의 시간이 걸린다. 그 후 프린팅된 임플란트를 저장조로부터 꺼내어, 멸균 DPBS 및 항생제(1% Pen Strep)로 3번 세척하였다.
이 실시예에 사용된 인간 척수 임플란트 프린팅: 전형적인 만성 척수 손상을 모델링하기 위해 경부 MRI 스캔을 사용하였다. 병변을 추적하였고, 인간 손상 부위 치수에 맞추기 위해 3D 척수 컴퓨터 지원 디자인(CAD) 모델을 사용하였다. 그 후 3D 모델을 척수의 길이 방향을 따라 일련의 디지털 마스크로 슬라이싱하였고, 이를 순차적으로 DMD 칩에 임포트하였다. 스테이지의 움직임으로 디지털 마스크를 동적으로 변화시킴으로써, 환자 특이적 척수 임플란트는 앞서 기술된 방법으로 사용되었다.
이 실시예에 사용된 템플릿 아가로스 스캐폴드의 제조: 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA)의 연속 매트릭스에 의해 분리된 육각형 밀집 배열로 배열된 직경 200 ㎛의 폴리스티렌 섬유(워싱턴주 밴쿠버 Paradigm Optics)로부터 다성분 섬유 번들(MCFB) 템플릿을 제조하였다. 이들을 허니콤 배열로 66 ㎛ 간격으로 배열하여 벽 크기가 66 ㎛이고 채널 직경이 200 ㎛인 최종 임플란트를 생성하였다. 폴리스티렌 섬유가 번들의 세로축과 평행하게 놓이도록 번들을 동시에 압출 및 융합시켰다. 다성분 섬유 번들 템플릿을 길이가 2 mm이고 단면의 폭 및 깊이가 1.5 mm가 되도록 트리밍하였다. 폴리스티렌 섬유를 고정시키고 외부의, 단단한 다성분 섬유 번들 템플릿을 형성하기 위해 시클로헥산을 사용하여 길이가 1.5 mm인 폴리스티렌 엔드 캡을 섬유 번들 말단에 결합시켰다. 그 후 6개의 이러한 다성분 섬유 다발 유닛을 선형 템플릿 배열로 교착하는 2개의 폴리스티렌 사이드 캡과 연속적으로 정렬시켰다. 그 후 폴리(메틸 메타크릴레이트) 매트릭스를 99.7% 프로필렌 카보네이트(Sigma-Aldrich)에 3회 침지하여 선택적으로 제거하고, 다음으로 95% 에탄올 세척 및 증류수 세척을 행하였다. 초고순도 아가로스(30 mg/ml, Sigma-Aldrich)를 100℃에서 증류수 중에 용해시키고 그 후 65℃로 냉각시켰다. 다성분 섬유 번들 템플릿을 아가로스 용액에 담그고 원심분리하여(30초 동안 300 rpm) 패킹된 폴리스티렌 섬유 배열을 통해 아가로스를 침투시켰다. 그 후 아가로스 캐스트를 상온에서 젤화시키고, 트리밍하고, 상온에서 24시간 동안 99% 테트라히드로퓨란(Sigma-Aldrich)에 침지시켰다. 이를 두 번 반복하여 폴리스티렌 몰드를 제거하여, 프리 플로팅(free-floating) 개별 아가로스 스캐폴드를 얻었다. 스캐폴드를 모으고 아세톤, 95% 에탄올, 및 멸균수로 3회 순차적으로 세척하였다. 사용할 때까지 스캐폴드를 상온에서 멸균수 중에 보관하였다.
이 실시예에 사용된 E14 신경 줄기 세포의 제조: 간략하게, GFP 발현 E14 F344 배아로부터의 척수를 해부하고 수막을 제거하였다. 조직을 15분 동안 트립신 처리하고 그 후 상온에서 2,500 rpm으로 원심분리하였다. 조직을 2% B27(Gibco)을 함유하는 NeuroBasal 배지(Gibco)에 재현탁시키고, 척수 조직을 불로 다듬질한 점점 작아지는 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 분쇄하였다. 그 후 세포를 2분 동안 2,500 rpm으로 원심분리하고, B27을 함유하는 NeuroBasal 배지에 재현탁시키고, 40 ㎛ 세포 필터 스트레이너를 사용하여 여과하였다.
이 실시예에 사용된 외과적 절차: 실험실 동물 관리 및 안전을 위한 NIH 가이드라인을 엄격히 준수하였다. T3 척수 레벨에서 완전한 절단에 이식된 임플란트가 수행되었다. 간략하게, 동물을 깊이 마취시키고, T3 추궁절제술을 수행한 다음, 미소가위 및 미소흡인의 조합을 사용하여 척수를 절단하였다. 1.8 mm의 블록을 제거하고 길이가 2 mm인 임플란트를 이식하여, 임플란트를 절단된 척수의 세그먼트 사이에 단단히 유지시켰다. 그룹 1(n=14)은 빈 아가로스 스캐폴드를 받았고, 그룹 2(n=14)는 빈 3D 프린팅된 임플란트를 받았고, 그룹 3(n=14)는 4성분 성장 인자 칵테일(신경 줄기 세포의 생존을 돕기 위한 BDNF 50 ng/㎕(Peprotech), 혈관형성을 촉진시키기 위한 VEGF 10 ng/㎕(Peprotech) 및 bFGF 10 ng/㎕(Peprotech), 및 신경 보호를 위한 칼페인 억제제인 MDL28170 50 μM(Sigma))을 포함하는 피브린 매트릭스에 현탁된 E14 신경 줄기 세포가 로딩된 3D 프린팅된 임플란트를 받았다. 그룹 4(n=8)는 손상을 입었지만 임플란트가 이식되지 않는 가짜 수술을 받았다. 그룹 5(n=8)는 앞서 기술된 래트 E14 척수 유래 다분화능 신경 전구 세포의 임플란트를 받았다(Lu, P. et al. Cell 150:1264-1273, 2012). 세포들을 앞서 기술된 성장 인자 칵테일과 함께 동일한 피브리노겐/트롬빈 매트릭스에 현탁시켰다. 이식 후, 등근육 및 피부를 봉합하고 항생제 및 진통제를 투여했다.
손상 위 절단 지점에서 손상 아래 온전한 척수로의 올바른 재진입 지점까지 축삭 돌기를 유도하고 정렬하도록 마이크로채널(직경 200 ㎛)을 디자인하였다(도 1a-e). 내부 코어 영역은 일반적으로 손상 부위 아래로 돌출된 축삭 돌기가 없다. 따라서, 임플란트의 이 구성요소는 임플란트의 구조적 지지를 향상시키는 중실형 영역으로서 디자인되었다. 아가로스 마이크로채널 임플란트에 대한 이전 연구는 병변 부위에 들어가는 축삭 돌기의 80%가 임플란트에 의해 유도되고 병변의 반대쪽으로 가교된다는 것을 보였다. 그러나, 아가로스는 임플란트 내 축삭 돌기를 감쇠시키고 가두는 콜라겐 기반 반응성 세포 층으로 이루어진 이물 반응을 유발하여, 축삭 돌기가 채널로부터 빠져나가는 것을 막는다. 따라서, 이물 반응의 감소로 인해 반응성 세포 층을 감소시켜, 숙주 돌기 세포가 병변에 더 잘 침투하고 가로지르게 할 수 있는 분해가능한 재료로부터 임플란트를 제조하였다. 임플란트 재료로서, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA) 및 젤라틴 메타크릴레이트(GelMa)의 두 생체적합성 재료의 조합을 사용하였다. PEGDA는 세포에 대해 비접착성이며, 따라서 세포 결합 리간드 및 매트릭스 메탈로프로티나제(MMP) 분해 부위를 유지시켜 잠재적으로 세포의 장기간 생존 능력을 향상시키는 광중합가능한 변성 콜라겐인 GelMa를 첨가하였다. 각 재료의 농도 및 프린팅된 임플란트의 가교결합 밀도는 원래의 척수 조직의 기계적 특성을 모방하도록 디자인될 수 있는데, 임플란트와 숙주 사이의 기계적 특성이 불일치하면 척수 경계면에서의 압축 또는 찢어짐이 발생하여, 통합에 실패할 수 있기 때문이다.
3D 프린팅된 PEGDA/GelMa 임플란트의 탄성 계수를 측정하기 위해 동적 기계적 분석(DMA)을 사용하였다. 원래의 척수의 탄성 계수가 200 kPa 내지 600 kPa인 것에 따라, 이식에 사용되는 바이오프린팅된 임플란트의 탄성 계수는 260 kPa 내지 300 kPa의 범위 내에 있었다(도 2).
면역표지화를 수행하였다. 척수를 20 ㎛ 간격으로 설정된 저온 유지 장치에서 절편화하고, 다음을 위해 가공하였다: 1) 그래프팅된 세포 생존 및 분화 및 축삭 돌기 확장을 평가하기 위한 GFP 표지화(GFP 토끼 다클론, Invitrogen, 1:500 희석); 2) 미성숙 뉴런에 대해 Hu(인간 다클론, 1:500 희석), 성숙 뉴런 핵에 대해 NeuN(마우스 단일클론, Abcam, 1:500 희석), 성숙 뉴런에 대해 MAP-2(마우스 단일클론, BD Biosciences, 1:500 희석), 축삭 돌기를 표지화하는 뉴로필라멘트 200(마우스 단일클론, Millipore, 1:500 희석), 성숙 뉴런 및 축삭 돌기에 대해 세로토닌(5HT, 염소 다클론, ImmunoStar, 1:500 희석), 성상세포에 대해 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP, 닭 다클론, Millipore, 1:500 희석), 희소 돌기 아교 세포에 대해 Olig2(Olig 2, 마우스 단일클론, IBL, 1:200 희석)를 포함하는 신경 세포 마커. 3) 슈반 세포를 표지화하기 위한 S100(토끼 다클론, Dako, 1:500 희석). 4) 콜라겐 유형 IV(토끼 다클론, Biogenex, 1:500 희석). 일차 항체를 위해 절편들을 상온에서 밤새 인큐베이션하였고, 그 후 상온에서 3시간 동안 Alexa 488-, 594- 또는 647-접합된 염소 또는 당나귀 이차 항체(1:250, Invitrogen)에서 인큐베이션하였다. 반응성 세포 층의 두께는 니슬 염색된 절편에서 총 배율 200배로 측정하였다(동물당 8개의 절편을 정량화하였고, 결과는 평균 ±SEM으로 나타냄). GFAP 면역반응성은 GFAP 면역표지화 절편의 숙주 척수-임플란트 경계면에서 측정된 픽셀당 평균 회색 값으로 정량화하였다(동물당 8개의 절편을 정량화하였고, 결과는 평균 ±SEM으로 나타냄). 채널의 미측 부분의 400 ㎛ 부분의 200배 확대 이미지를 사용하여 5HT 운동 축삭 돌기 정량화를 수행하였다(축삭 돌기를 수작업으로 세었고, 동물당 8개의 절편을 정량화함). 앞서 언급된 항체를 사용하여 채널 내 줄기 세포 분화를 정량화하였다. 각 슬라이드를 DAPI와 GFP로 대조표지화하였고 세포를 수작업으로 세었다. 각 세포 유형 수를 채널 내의 총 DAPI/GFP 표지화된 핵으로 정규화하였다(동물당 8개의 절편을 정량화하고, 정량화는 ImageJ를 사용하여 수행함).
통계적 분석- 두 그룹의 비교는 P<0.05의 지정된 유의성 수준에서 양측 스튜던트 t-검정(JMP 소프트웨어)에 의해 검정되었다. 다중 그룹의 비교는 P<0.05의 지정된 유의성 수준에서 단측 ANOVA(JMP 소프트웨어)에 의해 검정되고, 그 후 터키 검정을 사용하여 post-hoc 분석을 수행하였다.
전자 현미경 분석- 시냅스 형성 및 축삭 돌기의 수초화에 대한 상세한 분석을 전자 현미경을 사용하여 다음과 같이 수행하였다: 피험체를 4% 파라포름알데히드 및 0.25% 글루타르알데히드로 관류시키고, 척수를 1% 사산화오스뮴으로 후고정시키고, 탈수시키고, 둘쿠판(durcupan) 수지에 포매하였다. 전체적인 모폴로지를 위해 0.5 ㎛의 반초박 절편을 톨루이딘 블루로 염색하였다. 그리고, 60 nm 절편을 울트라마이크로톰을 사용하여 절편화하고, UCSD 초저온 전자현미경 핵심 시설에서 FEI 200KV Sphera 현미경을 사용하여 가시화하였다.
주사 전자 현미경 영상화- 환자 특이적 척수 임플란트를 영상화하기 위해 주사 전자 현미경(SEM, Zeiss Sigma 500)을 사용하였다. 임플란트를 일련의 에탄올 배스에서 탈수시키고, 초임계점 건조기(Tousimis AutoSamdri 815A)로 건조시킨 후, Emitech K575X를 사용하여 85 mA의 증착 전류에서 7초 동안 이리듐으로 스퍼터(sputter) 코팅하였다. 스퍼터 코팅 후, 5 kV에서 Zeiss Sigma 500 SEM을 사용하여 임플란트를 영상화하였다.
기능 분석- 그룹의 아이덴티티를 알지 못하는 2명의 독립적인 관찰자가 BBB 오픈 필드 21포인트 운동능력 등급 스케일을 매주 평가하였다.
전기생리학- 뒷다리의 MEP를 측정하였다. 요약하면, 프로포폴(100 mg/kg, PropoFlo Abbot)을 사용하여 동물을 마취시켰다. 2개의 경피 배치된 30G 스테인리스강 자극 전극을 사용하는 경두개 전기(DS3 정전류 절연 자극기(Digitimer, 영국 웰윈 가든 시티)를 사용하여 9 mV에서 1 ms의 펄스 지속시간). 3개 내지 5개의 가장 높은(안정된) 기록된 전위가 유사할 때까지, 양쪽 뒷다리에 배치된 링 전극으로 MEP를 기록하였다. 이식한 지 26주 후에 MEP를 기록하였다.
몇몇 실시양태에서, 3D 바이오프린팅의 이점은 상이한 크기(도 17a-b) 및 특이한 형상의 임플란트를 신속하게 프린팅하여, 수술 전 MRI 스캔에서 확인한 대로 개별적 환자의 병변 부위에 정합시킬 수 있다는 것이다. 임플란트는 도 3a-e에 도시된 대로 환자의 만성 병변 공동의 정확한 형상 및 크기에 정합하도록 프린팅되었다.
바이오프린팅된 임플란트는 래트 척수 완전 T3 절단 부위에 이식된다. 이것은 SCI의 가장 어려운 모델이며, 척수 재생 연구에 있어서 가장 도전적인 모델이다. 축삭 돌기는 손상 시 절단되기 때문에 이것은 또한 축삭 돌기 재생을 연구하기 위한 모델이며, 생존한 축삭 돌기가 있는 예비 조직의 테두리가 있는 타박상과는 다른데, 이는 관찰된 축삭 돌기가 정말로 재생된 축삭 돌기인지 또는 예비 또는 자라난 축삭 돌기인지를 결정하기 어렵게 만든다. 19마리의 Fischer 344 래트가 T3 완전 척수 절단되고 병변 부위에 2 mm 길이의 임플란트를 즉시 배치하였다. 8마리의 대조군 동물은 병변만을 가졌다. 4주 후, 척수가 제거되고 임플란트 구조, 생체적합성, 및 축삭 돌기의 재생/재수초화가 평가되었다. 결과는 이전에 동일한 병변 및 생존 시간을 갖는 템플릿 아가로스 임플란트를 받은 동물과 비교되었다.
이식한 지 4주 후, 3D 프린팅된 PEGDA/GelMa 임플란트는 구조적 완전성을 유지하였다: 임플란트의 채널 및 중실형 코어는 모든 동물에서 파손 또는 변형 없이 그들의 이식전 구조를 유지하였다(도 4). 4주 시점에서 임플란트의 생분해는 아직 명확하지 않았다. 히알루론산과 같은 다른 임플란트 재료를 사용하는 이전의 노력은 보다 신속한 임플란트의 분해 및 구조의 붕괴로 이어졌다(도 18a). 임플란트의 분해는 6달에 걸쳐 벽 두께가 44 ㎛ 감소됨을 보이는 것으로 특징지어졌으며, 이는 구조의 66%가 보존됨을 나타낸다(도 19). 임플란트 구조의 유지는 병변 부위 전반에 물리적 지지를 유지하고, 재생하는 축삭 돌기의 성장을 돕고, 조직화하고 정렬하는 데 필수적인 것으로 여겨진다.
6달 후 해부학적 분석은 모든 임플란트가 3D 구조를 유지함을 나타냈다(도 15A). 그러나, 이식 전 크기와 비교하여 임플란트 벽의 두께는 49% 감소되었는데, 이는 시간에 따라 천천히 분해됨을 암시한다. 빈 임플란트가 이식된 동물 중에, 숙주 뉴로필라멘트 표지화된 축삭 돌기는 이식된 지 4주 후에 관찰된 수(97±8 축삭 돌기)와 유사한 상대적으로 보통의 수(118±8)가 임플란트로 재생되었다. 어떠한 경우에도 숙주 축삭 돌기가 임플란트를 넘어서, 그리고 빈 임플란트가 이식된 동물의 원위 숙주 척수로 재생되지 않았다. 신경 줄기 세포가 로딩된 3D 생체 모방 PEGDA/GelMa 임플란트가 이식된 동물 중에, 그래프팅된 세포는 6달의 기간 동안 생존하였고 모든 채널을 완전히 채웠다(도 15). 네스틴 표지화는 검출되지 않았는데, 이는 이식된 신경 줄기 세포의 완전한 성숙을 나타내며, Ki67 표지화 또한 검출되지 않았는데, 이는 그래프트에 의한 세포 분열의 완료를 나타낸다. 4주 임플란트에서 관찰되듯이, 5HT 면역반응성 축삭 돌기가 임플란트로 들어갔다. 87±5개의 세로토닌성 축삭 돌기가 신경 줄기 세포가 로딩된 채널의 미측 단부에 도달하였고, 이식된 지 4주 후에 관찰된 축삭 돌기의 수와 유사한 수의 축삭 돌기가 미측 척수로 계속 재생되었다(도 14b). 이러한 관찰은 임플란트로의 세로토닌성 축삭 돌기의 재생이 4주까지는 완료된다는 것을 시사한다. 적색 형광 단백질(RFP)을 발현하는 AAV2 벡터를 운동 피질에 주입함으로써 앞서 표지화된 숙주 피질척수 운동 축삭 돌기 또한 줄기 세포가 로딩된 임플란트로 재생되었고(도 15B), 1 mm의 거리인 임플란트 중간 지점까지 연장되었다. 피질척수 축삭 돌기는 임플란트 채널 내의 NeuN 표지화된 뉴런에 추정적인 부톤과 같은 구조를 형성하였다(도 15C). 또한, 그래프트 유래 GFP 표지화된 축삭 돌기는 임플란트로부터 손상에 대해 미측인 숙주 척수로 돌출되어, 병변에 대해 미측인 척수의 숙주 뉴런에 추정적인 부톤과 같은 구조를 형성하였다(도 15D-E). 임플란트로부터 원위 숙주 척수로의 그래프트 유래 축삭 돌기 외성장의 양(도 15D)은 임플란트를 넘어서 재생된 숙주 세로토닌성 축삭 돌기의 수를 크게 초과하였다. 이러한 관찰은 병변 부위 전반의 회복된 뉴런 릴레이가, 존재한다면, 임플란트로 재생되는 숙주 축삭 돌기에 의해 매개될 수 있고, 그래프팅된 신경 줄기 세포로 시냅스되며, 줄기 세포 유래 축삭 돌기는 원위 숙주 척수로 연장됨을 암시한다.
반응성 세포 층의 감쇠는, 템플릿 아가로스 스캐폴드와 비교하여 3D 프린팅된 임플란트를 받은 동물들 중에 존재하고, 감소된 콜라겐 침착(도 4b) 및 감소된 세립화 조직(도 5a)에 의해 특징지어진다. 반응성 세포 층은 두께가 340±52 ㎛인데, 아가로스 스캐폴드와 비교하여 35%의 유의적인 감소량이다(P<0.05, 도 5a). 성상세포의 반응 또한 3D 프린팅된 임플란트에 의해 감쇠되었다: 대조군 병변 피험체에서, 성상세포가 반응성이 되어 병변 부위를 "벽으로 막았다"(도 6a). 아가로스 스캐폴드가 있는 동물에서, 성상세포 벽은 여전히 존재하였고 스캐폴드를 숙주 척수로부터 막았다(도 6b). 대조적으로, 3D 프린팅된 임플란트는 성상세포 반흔 두께의 감쇠 및 숙주 척수로부터 임플란트 채널로의 연속성을 더 이상 차단하지 않도록 반흔의 재편성을 나타내었다(도 6c). 몇몇 실시양태에서, 성상세포 프로세스는 숙주와의 경계면에서 수직 벽을 형성하는 것에서 임플란트를 선형적으로 침투하는 가닥을 형성하는 것으로 변하였으며, 이것에 재생된 숙주 축삭 돌기가 연관되었다. 3차원 프린팅된 임플란트는 아가로스 스캐폴드와 비교하여 성상세포 면역반응성의 66% 감소, 및 병변만을 가진 동물과 비교하여 97% 감소를 보였다(P<0.05, 도 6d). 임플란트는 전체 길이를 따라 쉽고 광범위하게 혈관화되었다(도 7a-b).
반응성 세포 층 두께의 감소에 따라, 3D 프린팅된 임플란트에 접근하는 숙주 축삭 돌기는 척수의 문측-미측(하강) 축을 따라 정렬되었고, 굴절 없이 쉽게 임플란트의 채널에 침투하였다. 이는 아가로스 스캐폴드와 숙주의 경계면에서 발생하는 빈번한 축삭 돌기의 정렬불량 및 굴절과는 대조적이다(도 8a-b). 말초 신경계로부터의 숙주 슈반 세포는 임플란트로 옮겨졌고 재생된 숙주 축삭 돌기를 초성화 또는 재수초화하였다(도 9a-c).
몇몇 실시양태에서, 본원에 기술된 척수 복원을 위한 임플란트에 재생 또는 재수초화를 향상시킬 수 있는 세포가 로딩될 수 있다. 따라서, 3D 프린팅된 임플란트에 Fischer 344 래트의 배아일 14 척수로부터 얻어진 GFP 발현 래트 신경 줄기 세포가 로딩되었다. 직접 주입에 의해 8 ㎕ 부피의 총 3×106개의 세포가 임플란트에 로딩되었다. 총 14마리의 래트가 T3 척수 완전 절단되었고, 1.8 mm 길이의 척수 세그먼트가 제거되었고, 신경 줄기 세포가 로딩된 2 mm 길이의 3D 프린팅된 임플란트를 이식하였다. 동물들은 4주 동안 생존하였고 임플란트 완전성, 세포 생존 및 숙주 축삭 돌기의 재생 및 재수초화를 평가하기 위해 희생되었다.
몇몇 실시양태에서, 줄기 세포는 모든 그래프팅된 동물에서 생존하였고 임플란트 채널을 채웠다(도 10a, 도 20a-d). 신경 줄기 세포 또한 임플란트 또는 숙주 척수 구조를 변형시키지 않고 임플란트와 숙주 척수 사이의 경계면에 존재하였다(도 20a-d). 시험된 샘플 중에서, 그래프팅된 줄기 세포의 47±2%는 초기 신경 마커 Hu를 발현하였고(도 21a), 그래프팅된 세포의 20±3%는 성숙 신경 마커 NeuN을 발현하였고(도 521b), 세포의 11±2%는 희소 돌기 아교 세포 마커 Olig2를 발현하였고(도 21c), 세포의 21±3%는 성상세포 마커 GFAP를 발현하였다(도 21d 및 22). 줄기 상태 마커 Nestin은 검출되지 않았다.
숙주 축삭 돌기는 쉽게 임플란트에 침투하였다(GFP 리포터 발현의 부재에 의해 그래프트 유래 축삭 돌기와 구별됨)(도 10b). 많은 숙주 긴 관 세로토닌성 축삭 돌기 또한 줄기 세포가 로딩되고 채널 방향에 따라 선형화된 3D 프린팅된 임플란트에 쉽게 침투하였다(도 10c). 줄기 세포 그래프트는 침투하는 축삭 돌기를 선형화하지 못하였다(도 23). 5HT 축삭 돌기는 임플란트의 미측 단부로 재생되도록 유도되었다(도 10e). 대조적으로, 빈 임플란트(줄기 세포 충전이 없는)의 미측 단부 또는 줄기 세포 그래프트에 닿는 세로토닌성 축삭 돌기는 거의 없었다(도 24a-b). 빈 3D 프린팅된 임플란트의 11±5개의 축삭 돌기와 비교하여, 동물당 임플란트당 줄기 세포가 로딩된 채널의 미측 400 ㎛ 내에 평균 85±21개의 세로토닌성 축삭 돌기가 정량화되었다. 평균 8±4개의 축삭 돌기 세로토닌성 축삭 돌기가 임플란트가 없는 줄기 세포 그래프트를 갖는 동물의 병변 부위의 끝에 도달하였는데, 이는 줄기 세포 그래프트를 포함하는 임플란트와 비교하여 축삭 돌기의 수가 10배 감소한 것이다(줄기 세포가 있는 임플란트와 없는 임플란트를 비교하여, ANOVA, P<0.05 ANOVA, P<0.05 post-hoc Tukey's; 도 10f). 따라서, 몇몇 실시양태에서, 신경 줄기 세포를 포함하는 3D 프린팅된 임플란트는 축삭 돌기가 병변 부위의 미측 단부로 재생되는 것을 향상시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 향상은 유의적이고 실질적일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 숙주 세로토닌성 운동 축삭 돌기는 병변 부위/임플란트를 통해 완전히 재생되고, 미측 척수로 다시 들어간다(도 10g). 병변에 대해 미측 숙주 척수에 위치한 세로토닌성 축삭 돌기는 그래프트 유래가 아니었는데, 왜냐하면 임플란트의 신경 줄기 세포는 5HT(세로토닌)를 면역표지화하지 않고 이러한 축삭 돌기는 GFP를 표지화하지 않았기 때문이다(도 25). 임플란트의 미측 가장자리에서 2 mm 떨어진 곳에서, 세로토닌성 축삭 돌기가 숙주 척수의 백질 및 회색질에서 검출되었고, 종종 분지화되어 회색질로 들어갔다(도 26a-c). 숙주 긴 관 세로토닌성 축삭 돌기는 병변에서 3.5 mm까지 떨어진 곳에서 검출되었지만(도 10h) 그 이상을 넘어서는 검출되지 않는데, 이는 이들이 재생하는 축삭 돌기라는 사실을 추가로 지지한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 임플란트와 장치는 숙주 운동 축삭 돌기가 완전 척수 절단 부위에 이식된 임플란트로 및 임플란트를 넘어서 재생되는 것을 제공할 수 있다. 재생은 채널 및 숙주 미측 척수의 GAP43 면역표지화된 축삭 돌기의 존재로 인해 추가로 입증되었다(도 27a-b).
몇몇 실시양태에서, 조직 공학의 장애물은 장기 혈관화이다. 톨루이딘 블루 및 전자 현미경 분석은 본원에 기술된 임플란트 채널(도 28a-b)에서의 광범위한 혈관화를 입증하였다. 이러한 혈관 주위의 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFP) 면역표지화의 나타남으로 혈관주위세포의 존재 및 혈뇌 장벽의 복원을 확인하였다(도 29). 신경 줄기 세포가 채워진 채널의 축삭 돌기의 전자현미경 분석은 작게는 수초화하지 않은 축삭 돌기(직경 1 ㎛ 미만)부터 크게는 수초화된 축삭 돌기(1 ㎛ 내지 3 ㎛, 도 11)까지, 축삭 돌기의 직경 및 수초화 상태의 범위를 보여주었다. 톨루이딘 블루 염색은 희소 돌기 아교 세포가 이러한 축삭 돌기를 수초화하는 것을 보여주었다(도 12). 임플란트에 성숙 뉴런 마커 NeuN을 발현하는 신경 줄기 세포가 로딩되기 때문에, 임플란트 채널의 재생 숙주 축삭 돌기와 뉴런 사이의 시냅스의 형성에 대한 잠재력이 존재하였다. 몇몇 실시양태에서, 흥분성 시냅스의 전형적인 둥근 시냅스 소낭을 포함하는 축삭 돌기로부터의 입력을 수신하는 비대칭 시냅스가 쉽게 관찰되었다(도 13). 채널로 재생되는 숙주 세로토닌성 축삭 돌기는 MAP2와 GFP에 대한 공동 표지화로 식별된(도 14) 줄기 세포 유래 뉴런의 수상 돌기와 밀접하게 연관될 수 있으며, 또한 시냅스 형성을 암시한다.
기능적 또는 행동적 결과가 두 독립적 테스트를 사용하여 측정되었다. 이식된 지 26주 후 운동 피질에 경두개 전기 자극을 적용함으로써 전기생리학적 연구가 수행되었고, 뒷다리로부터의 운동 유발 전위(MEP)가 기록되었다. MEP는 근육으로부터의 EMG 신호를 기록함으로써 말초 신경계에 대한 뇌의 척수 상방 제어를 시험하기 위한 기능의 전기생리학적 회복(인간 및 동물 모두에서)을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 손상된 지 26주 후 신경 줄기 세포가 로딩된 3D 프린팅된 임플란트가 이식된 래트는 C8 척추 레벨(이식 부위 T3 위)에서의 척수의 재절단 시 중단된 MEP 반응의 회복을 나타낸다. 이러한 데이터는 뒷다리의 근육 활동이 숙주로부터 임플란트를 통한 시냅스 전달에 의해 생성되었음을 나타낸다(도 15A-E, 도 31). 따라서, 몇몇 실시양태에서, 기술된 임플란트는 숙주로부터 임플란트를 통해 시냅스 전달을 제공하여 뒷다리의 근육 활동을 제공할 수 있다.
뒷다리의 신경이 제거되어 동물이 뒷다리에 체중을 지탱할 수 없었기 때문에, 근육이 쇠퇴되고, 반응할 수 있는 근육 유닛이 줄어들었다. 이는 온전한 동물들과 실험 동물들 사이의 크기의 차이를 설명한다(도 15A-E). 이러한 관찰에 부합하여, MEP의 진폭은 빈 임플란트를 갖는 동물보다 유의적으로 더 컸다(p<0.05, 도 15E). 추가로, 기록된 MEP의 반응잠시(최대 진폭까지의 시간)는 줄기 세포 임플란트에서 더 짧았고, 관찰된 온전한 반응잠시에 더 가까웠다(ANOVA p<0.01, 도 30).
3D 생체 모방 PEGDA/GelMa 임플란트에 의한 운동 기능 회복의 정도를 결정하기 위해, 행동이 정체되고 안정적일 때까지 6달의 기간 동안 Beattie Basso Bresnahan(BBB) 운동 스케일을 사용하여 동물을 평가하였다. 신경 줄기 세포가 로딩된 임플란트를 받은 동물은 빈 임플란트를 갖는 동물과 비교하여 유의적인 기능 회복을 나타냈다.
손상 후 첫 4주 동안 병변 대조군과 그래프팅된 피험체 모두에게서 뒷다리 운동이 손상되었다(예를 들어, 심각하게). 5주차에, NSC가 로딩된 임플란트를 받은 피험체는 BBB 스케일에서 개선을 보이기 시작하였는데, 병변이 있는 대조군에서의 최소한의 움직임과는 대조적으로, 뒷다리의 각 관절에 대한 움직임을 나타내는 레벨 7에 도달하였다(반복 측정값 ANOVA p<0.01; 각 시점 *p<0.01; 도 16).
6달 더 일찍 임플란트의 신경 줄기 세포를 받은 동물은 BBB 스케일에서 기능 점수가 평균값 6.6+0.5(+SEM)점에 도달하였는데, 이는 뒷다리의 각 관절 둘레의 움직임을 나타내며, 오직 한 관절 둘레의 일치하지 않는 움직임을 나타내는 빈 임플란트 대조군에서의 평균 점수 0.3+0.2점과는 대조적이다(*p<0.01, 반복 측정값 ANOVA; 각 시점에 대한 t-검정 및 post-hoc Tukey's; 도 15F). 신경 릴레이의 형성은 뇌의 전기적 자극에 반응하는 뒷다리로부터의 근원성 MEP를 측정함으로써, 완전 절단 부위를 통한 전기생리학적 전달을 통해 추가로 조사되었다(도 15G, 도 16a-c).
손상된 지 6달 후, 신경 줄기 세포가 로딩된 3D 생체 모방 PEGDA/GelMa 임플란트를 이식받은 래트는 운동 유발 반응의 회복을 보였으나, 반면 빈 임플란트를 이식받은 동물은 베이스라인 노이즈의 범위에서 반응을 보였다(p<0.01, t-검정; 도 15G 및 도 16d). C8 레벨(임플란트 부위 위)에서 척수의 재절단은 뒷다리에서 모든 유발 전위의 손실을 초래하였으며(도 16a-c), 이는 병변 전체에 걸친 새로운 전기생리학적 릴레이의 형성을 확인해 준다.
이러한 연구는 생체 모방 중추 신경계 구조의 신속한 3D 프린팅의 용도를 입증한다. 이러한 임플란트는 특정 병변의 형상 및 길이로 쉽게 개별화될 수 있다. 3차원 프린팅된 PEGDA/GelMa 임플란트는 생체내에서 적어도 26주 동안 구조를 유지할 수 있다. 또한, 기술된 프린팅된 임플란트는 신경 줄기 세포의 생착을 도울 수 있다. 여전히 또한, 기술된 프린팅된 임플란트는 새로운 시냅스의 형성을 도울 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 임플란트는 잘 혈관화되어, 지속적인 세포 및 축삭 돌기의 생존을 돕기 위한 혈액, 산소 및 영양분을 적절히 이용할 수 있게 한다.
전술한 발명은 예시적 실시양태이다. 본원에 기술된 장치, 기술 및 방법은 본 발명의 실시에서 잘 기능하는 대표적 실시양태들을 설명한 것임이 당업자에게 인식되어야 한다. 그러나, 본 발명의 관점에서, 당업자들은 많은 변화들이 개시된 구체적 실시양태에서 이루어질 수 있으며, 본 발명의 사상과 범주를 벗어나지 않고 비슷하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 인식해야 한다.
달리 지시되지 않았다면, 명세서 및 청구범위에 사용된 성분의 양, 분자량과 같은 특성, 반응 조건, 등등을 나타내는 모든 숫자는 용어 "약"에 의해 모든 경우에 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 지시되지 않았다면, 하기 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사값이다. 최소한, 청구범위의 범주에 균등론의 적용을 제한하려는 시도로서가 아니라, 각 수치 파라미터는 보고된 유효 숫자의 수의 관점에서, 그리고 일반적인 반올림법을 적용함으로써 적어도 이해되어야 한다. 본 발명의 넓은 범주를 설명하는 수치 범위 및 파라미터가 근사값임에도 불구하고, 구체적 실시예에 제시된 수치 값들은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 어떠한 수치 값이든 각각의 시험 측정에서 발견된 표준편차로 인해 필연적으로 발생하는 특정 오차를 본질적으로 포함한다.
본 발명을 기술하는 문맥에서(특히 하기 청구범위의 문맥에서) 사용되는 용어 "한" 및 "하나의" 및 "상기" 및 유사한 지시자는, 본원에서 달리 지시되거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는다면, 단수 및 복수 모두를 다루는 것으로 이해되어야 한다. 본원의 값의 범위의 나열은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별적인 값을 개별적으로 언급하는 속기법으로서 역할하도록 의도된다. 본원에서 달리 지시되지 않으면, 각 개별적인 값은 본원에 각각 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에 달리 지시되거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않으면 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 임의의 및 모든 실시예, 또는 본원에 제공된 예시적 언어(예를 들어 "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 나타내기 위해 의도된 것이며, 달리 청구된 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 명세서의 어떠한 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 청구되지 않은 요소를 지시하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 명백히 대안만을 언급하도록 지시되거나 대안이 상호 배타적이지 않은 경우 "및/또는"을 의미하도록 사용되지만, 본 발명은 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 지지한다.
본원에 개시된 본 발명의 대안 요소 또는 실시양태의 그룹화는 제한으로 이해되어서는 안 된다. 각 그룹의 멤버는 개별적으로, 또는 그룹의 다른 멤버 또는 본원에서 확인되는 다른 요소와의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 멤버는 편리성 및/또는 특허성의 이유로 그룹에 포함되거나 그룹으로부터 삭제될 수 있다고 예상된다. 임의의 이러한 포함 또는 삭제가 일어나는 경우, 본원의 명세서는 수정된 그룹을 포함하는 것으로 여겨지고, 따라서 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠쉬 그룹의 서면 설명을 이행한다.
본 발명자에게 공지된 본 발명을 수행하기 위한 최고의 방식을 포함한 본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 기술된다. 물론, 이러한 바람직한 실시양태에 대한 변형은 전술한 설명을 읽음으로써 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명자는 당업자가 이러한 변형을 적절하게 이용할 것이라 예상하고, 본 발명자는 본 발명이 본원에 구체적으로 기술된 것과 다르게 실시될 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 준거법에 의해 허용되는 것과 같이 본원에 첨부된 청구범위에 인용된 주제의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 또한, 본원에 달리 지시되거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는다면, 앞서 기술된 요소의 모든 가능한 변형의 임의의 조합은 본 발명에 의해 포함된다.
본원에 기술된 특정 실시양태는 언어 '이루어지는' 또는 '실질적으로 이루어지는'을 사용하여 청구범위에서 추가로 제한될 수 있다. 청구범위에서 사용되는 경우, 제출된 그대로이든 또는 보정에 의해 추가된 것이든, 연결어 '이루어지는'은 청구범위에 구체화되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 배제한다. 연결어 '실질적으로 이루어지는'은 청구범위를 특정된 재료 또는 단계 및 기본적이고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 청구된 본 발명의 실시양태는 본원에서 내재적으로 또는 명시적으로 기술되고 실시 가능하다.
또한, 본원에 기술된 본 발명의 실시양태는 본 발명의 원리를 예시하는 것으로 이해되어야 한다. 이용될 수 있는 다른 변형은 본 발명의 범주 내에 있다. 따라서, 제한이 아닌 예시로서, 본 발명의 대안적 구성이 본원의 교시에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 제시되고 기술된 바로 그것에 제한되지 않는다.

Claims (19)

  1. 척수 또는 말초 신경 손상을 위한 생체 모방 임플란트로서,
    제1 단부 및 제2 단부를 포함하고 코어 및 쉘을 포함하며 손상 부위의 구조를 모방하는 3차원(3D) 임플란트와,
    제1 단부에서 시작하여 제2 단부에서 끝나는, 쉘 내의 적어도 하나의 채널과,
    적어도 하나의 채널에 포함된 적어도 한 유형의 줄기 세포
    를 포함하는 생체 모방 임플란트.
  2. 제1항에 있어서, 3D 프린팅에 의해 제조되는 생체 모방 임플란트.
  3. 제1항에 있어서, 적어도 한 유형의 줄기 세포가 신경 줄기 세포인 생체 모방 임플란트.
  4. 제3항에 있어서, 신경 줄기 세포가 배아 줄기 세포, iPSC 유래 줄기 세포, 직접 분화된 신경 줄기 세포, 또는 이들의 조합인 생체 모방 임플란트.
  5. 제1항에 있어서, 적어도 한 유형의 줄기 세포가 중간엽 줄기 세포인 생체 모방 임플란트.
  6. 제1항에 있어서, 줄기 세포가 BDNF, NT3, GDNF, 또는 이들의 조합을 발현하도록 조작된 것인 생체 모방 임플란트.
  7. 제1항에 있어서, 3차원 프린팅된 임플란트가 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트, 또는 젤라틴 메타크릴올, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 생체 모방 임플란트.
  8. 제1항에 있어서, 척수를 생체 모방하는 생체 모방 임플란트.
  9. 제1항에 있어서, 말초 신경을 생체 모방하는 생체 모방 임플란트.
  10. 제1항에 있어서, 채널이 선형인 것인 생체 모방 임플란트.
  11. 제1항에 있어서, 채널이 서로 평행한 것인 생체 모방 임플란트.
  12. 제1항에 있어서, 채널이 재생하는 축삭 돌기를 제1 단부에서 제2 단부로 유도하는 것인 생체 모방 임플란트.
  13. 제1항에 있어서, 허니콤 구조로서 클러스터링된 육각형 단면을 갖는 2개 이상의 채널을 포함하는 생체 모방 임플란트.
  14. 치료를 필요로 하는 숙주의 신경학적 손상의 치료 방법으로서,
    제1항의 생체 모방 임플란트를 치료가 필요한 위치에 이식하는 단계, 및
    손상 부위에서 세포가 재생되도록 하는 단계
    를 포함하는 치료 방법.
  15. 제14항에 있어서, 신경학적 손상이 척수 손상, 운동 완전 척수 손상, 운동 불완전 척수 손상, 또는 말초 신경 손상인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 신경학적 손상이 척수 손상인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 신경학적 손상이 말초 신경 손상인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 숙주에게 물리 치료를 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  19. 제1항의 생체 모방 임플란트의 제조 방법으로서,
    손상 영역을 결정하기 위해 치료가 필요한 숙주의 척수 또는 말초 신경 위치를 스캐닝하는 단계; 및
    손상 영역을 둘러싸도록 임플란트를 3차원으로 프린팅하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
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