CN108602089B - 三维微组织生物打印机 - Google Patents

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Abstract

生物打印机包括一个或多个分配单元。每个分配单元可包括(i)针筒，其包括中空本体和尺寸能在该本体内平移的柱塞，其中所述本体具有出口孔；(ii)致动器，其与柱塞近端接触；(iii)用于移动致动器的控制器；和(iv)喷嘴，其具有限定从喷嘴入口到喷嘴出口的流体通路的壁。喷嘴的入口与针筒本体的出口孔流体联通。喷嘴包括与流体来源以及流体通路流体联通的流体路径。生物打印机可用于制备微组织的方法中，包括将生物墨水从生物打印机的一个或多个分配单元分配到平板上。微组织可包括软骨细胞或肿瘤细胞或肝脏细胞。

Description

三维微组织生物打印机
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年9月4日提交的美国专利申请62/214,551的优先权。
关于联邦资助研究的声明
不适用。
背景技术
1.发明领域
本发明涉及三维生物打印机，更具体涉及计算机控制的可编程三维(3D)生物打印机，其能以精准控制的微尺度准确XYZ运动和体积为纳升的分配能力建立活微组织。
2.相关领域描述
开发了生物打印机以尝试和克服三维组织打印的挑战。生物打印机通过按滴打印细胞和作为“生物胶水”的材料来构建结构。生物打印机受到因其构建物质的小尺寸以及需要沉积的大量构建单元而固有的低通量的限制。对于各种生物打印应用，存在各种科技。
接触生物打印是一种不含细胞的聚合物打印，被Envisiontec公司的3D生物绘图机所采用。聚合物打印法仅仅用塑料样聚合物打印支架。
活细胞生物打印采用较大尺寸的接触活细胞生物打印。该技术不能打印微组织，因为得到的组织尺寸有数厘米。接触活细胞生物打印只能进行低通量打印。
基于阀的非接触生物打印技术提供了仅细胞的生物打印。见例如，Faulkner-Jones等“用于形成人胚胎干细胞球状聚集物的基于阀门的细胞打印机的开发”("Development of a valve-based cell printer for the formation of humanembryonic stem cell spheroid aggregates")，Biofabrication，5.1(2013)：015013。基于阀的非接触生物打印技术也可提供细胞和水凝胶的生物打印。见例如Moon等，“携带细胞的水凝胶液滴的逐层三维组织外延生长”("Layer by layer three-dimensional tissueepitaxy by cell-laden hydrogel droplets")，Tissue Engineering，C部分：方法16.1(2009)：157-166。Moon等将液滴打印成较大的片状，且其系统仅能产生悬浮在水凝胶内的细胞结构，而不具有组织结构或形态。其他商业打印机不能打印具有与天然组织类似的结构和形态的组织。
空气驱动的分配可提供共轴气流珠粒生成。该技术使用连续的气流，以共轴设置连续分配物质流，其不能控制每个液滴的体积，也不能分配单个液滴。该技术一般一次分配数以千计的液滴，在商业系统中，例如购自Nisco Engineering AG的那些中，材料限于藻酸盐。
在细胞聚集物-非保真3D模式下，细胞聚集物是通过悬滴法产生的，或来自非粘附细胞培养物表面。该技术已被他人用于尝试模拟3D组织，也已有商业产品。然而，这种聚集物仅仅是堆积的两维细胞，没有胞外基质。例如，已显示细胞聚集物的药物抗性机制和两维汇合细胞相同。参见例如Steadman，Kenneth等“聚HEMA球状体并不是难治性实体瘤的药物抗性的适当模型”("PolyHEMA spheroids are an inadequate model for the drugresistance of the intractable solid tumors.")Cell Cycle 7.6(2008):818-829。而且两维细胞培养物并不能重现体内复杂的生物或病理学环境。由于物种差异，动物模型并不能完全模拟人类疾病。
从临床上看，对于关节和许多骨骼手术总是优选侵入最少的方法。他人也已经采用了注射来自膝盖或间充质干细胞的软骨细胞，希望能修复组织缺陷。然而，弱机械性能、体积缩小和体内生长时间长使其无法用于关节软骨或骨骼修复。
因此，仍然需要体外打印人组织的技术，其能模仿体内的人组织性质。
发明内容
在一个方面，本文公开了包括一个或多个分配单元的生物打印机。每个分配单元可包括(i)针筒，其包括中空本体和尺寸能在本体内平移(translate)的柱塞，其中所述本体具有出口孔；(ii)致动器，其与柱塞近端接触；(iii)用于移动致动器的控制器；和(iv)喷嘴，其具有限定从喷嘴入口到喷嘴出口的流体通路(fluid path)的壁。喷嘴的入口与针筒本体的出口孔流体联通。喷嘴包括与流体来源以及流体通路流体联通的流体路径(fluidpassageway)。生物打印机可用于制备微组织的方法中，包括将生物墨水从生物打印机的一个或多个分配单元分配到平板上。微组织可包含干细胞、骨骼细胞、软骨细胞、肝细胞、肿瘤细胞、肿瘤间质细胞、内皮细胞和其他类型的细胞。生物打印机可用于修复骨骼缺陷或软骨缺陷的方法中，该方法包括：从生物打印机的一个或多个分配单元分配生物墨水，以建立包含软骨细胞的微组织；以及，将微组织植入到骨骼缺陷或软骨缺陷中。生物打印机可用于药物发现的高通量筛选方法中，该方法包括：从生物打印机的一个或多个分配单元分配生物墨水，以建立多个微组织样本；以及，使所述多个微组织样本的至少一部分与药物候选化合物接触。所述微组织样本可包含肿瘤细胞。
在该方面，所述控制器可执行来自其中所含计算机的程序，以驱动致动器朝柱塞近端移动，以从针筒本体分配生物墨水。生物打印机还可包括围绕针筒本体的温度控制器，用于从喷嘴出口接受生物墨水的温度受控的平板，用于在温度受控的平板邻近处建立湿度受控区域的加湿器。在生物打印机中，来自流体路径的流体能分散分配物质的液滴，并可驱使分配物质的液体从喷嘴出口排出。在生物打印机中，每个液滴的体积可在10纳升到15微升之间。流体来源可包括用于提供流体的可控阀门。可控阀门可受第二控制器控制。生物打印机中的流体来源可包括用于提供脉冲流体、脉冲空气、毫秒脉冲空气和亚毫秒脉冲空气的可控阀门。在生物打印机中，每个分配单元可以是非接触分配单元，喷嘴与针筒本体可以是一体的，喷嘴也可以与针筒本体分离。喷嘴出口可具有100微米到3毫米的内径。生物打印机可包括多个分配单元，各个分配单元可装载在XYZ运动系统上。
在另一个方面，本文公开了包括一个或多个分配单元的生物打印机。每个分配单元可包括(i)针筒，其包括中空本体和尺寸能在本体内平移的柱塞，其中所述本体具有出口孔；(ii)致动器，其与柱塞近端接触并移动该近端；(iii)用于控制致动器移动的控制器；和(iv)喷嘴，其具有限定从喷嘴入口到喷嘴出口的流体通路的壁。喷嘴的入口与针筒本体的出口孔流体联通。针筒在针筒本体的出口孔和柱塞近端之间不包括阀。生物打印机可用于制备微组织的方法中，该方法包括将生物墨水从生物打印机的一个或多个分配单元分配到平板上。微组织可包含干细胞、骨骼细胞、软骨细胞、肝细胞和其他类型的细胞。生物打印机可用于修复骨骼缺陷或软骨缺陷的方法中，该方法包括：从生物打印机的一个或多个分配单元分配生物墨水，以建立包含软骨细胞的微组织；将微组织植入到骨骼缺陷或软骨缺陷中。生物打印机可用于药物发现的高通量筛选方法中，该方法包括：从生物打印机的一个或多个分配单元分配生物墨水，以建立多个微组织样本；使所述多个微组织样本的至少一部分与药物文库接触，以寻找候选化合物。微组织样本可包含肿瘤细胞。
在该生物打印机形式下，控制器可执行存储在控制器中的程序，以驱动致动器朝柱塞近端移动，以从针筒本体分配生物墨水。生物打印机还可包括围绕针筒本体的温度控制器，用于从喷嘴出口接受生物墨水的温度受控的平板，用于在温度受控的平板邻近处建立湿度受控区域的加湿器。生物打印机中的喷嘴可包括与流体来源以及流体通路流体联通的流体路径。来自流体路径的流体可分散分配物质的液滴，并可驱使分配物质的液滴从喷嘴出口排出。在生物打印机中，每个液滴的体积可在10纳升到15微升之间。流体来源可包括用于提供流体的可控阀门。可控阀门可受第二控制器控制。生物打印机中的流体来源可包括提供脉冲流体、脉冲空气、毫秒脉冲空气和亚毫秒脉冲空气的可控阀门。在生物打印机中，每个分配单元可以是非接触分配单元，喷嘴与针筒本体可以是一体的，喷嘴也可以与针筒本体分离。喷嘴出口可具有100微米到3毫米的内径。生物打印机可包括多个分配单元，每个分配单元装载在XYZ运动系统上。
本文的生物打印机的一个形式是计算机控制的可编程三维(3D)生物打印机，其能以精准控制的微尺度准确XYZ运动和体积为纳升的分配能力建立活的微组织。
本文的生物打印机的一个形式直接将人细胞和胞外基质混合物打印到细胞培养容器，例如培养皿和微孔板的表面。打印出的组织可具有天然组织的形态和功能。生物打印机以两种模式工作：(1)高速打印模式，其用于以组织再生为目的的微组织的大量生物打印；和(2)精准打印模式，其在96孔或384孔板的每个孔中生物打印一个或特定数量的微组织，用于药物筛选或个性化治疗目的。
我们的生物打印机具有计算机控制的XYZ线性运动系统，其能控制对齐的分配单元(例如打印机头)的位置和运动。每个分配单元以以下机制分配包含细胞或基质或两者的特定混合物(生物墨水)的我们感兴趣的组织。分配单元如下组成：(1)线性致动器驱动的针筒泵，其由计算机控制；(2)分配针筒，其容纳生物墨水，并每次通过喷嘴分配预定的纳升体积的物质；和(3)新颖的分配喷嘴。由于在喷嘴和分配物质之间存在黏附力，在没有外力的情况下仅靠重力仅能产生较大的液滴，约50微升或以上。我们采用毫秒脉冲空气分配单元，将纳升级的分配物质从针筒喷嘴吹出，将其分配到表面上。短脉冲气流能非常精确地定位，而且不影响已经分配的液滴。
打印好的组织在药物筛选中为高通量形式。生物打印机迅速打印功能性的活微组织，用于组织再生和建模。打印的组织可由以下组成：(1)细胞原型，例如肿瘤细胞，肝细胞和心肌细胞；(2)支持细胞，和(3)胞外基质，从而使其因重建了组织的微环境而如天然组织般运作。另外，我们能生物打印用于软骨和骨骼再生的干细胞和基质。我们理论上能够生物打印可产生弹性蛋白(一种随着生命而消耗从而产生皱纹的分子)的成纤维细胞。这可能对于美容手术有至深的影响。打印各种其他组织的能力也是无限的。
体积化非接触分配单元优于现有的分配技术。体积化分配单元以纳升的分辨率从分配喷嘴挤出细胞和/或基质混合物，挤出由线性致动器实现。由于体积为纳升水平时挤出的细胞-基质混合物不会由于重力作用从喷嘴落下，我们的分配单元使用毫秒空气脉冲将其从喷嘴吹出，以实现分配。其他基于阀门或压电的非接触打印头，依赖于计时或压力来控制分配体积。它们需要对不同粘度的物质进行校准，而我们的(分配单元)并不需要。
我们能打印形态学与天然组织类似的微组织。为了实现该目的，我们将生物墨水的液滴打印在温度受控的表面上，以在打印过程中部分固化打印好的生物墨水，并控制湿度以防止打印好的生物墨水干燥、并维持高细胞活力。我们的精确技术使我们能印刷形态上与天然组织相当的组织系统。
我们的系统能用共轴设置或非共轴设置来传递脉冲空气。非共轴设置对分配的材料具有更好的位置控制。
我们的结果显示，我们打印出的与天然肿瘤组织具有相同组分的肿瘤微组织，比起细胞聚集物对化疗药物有高得多的药物抗性。另外，有许多类型的细胞不能聚集，也不适于常规的细胞聚集技术。我们仍然能用我们的生物打印机/技术打印这些非聚集性组织。这代表了真实得多的测试环境。
我们生物打印的微组织已在体外预生长且机械增强。一旦注射到体内，该组织本身能装配成能修复缺陷的较大组织融合物。
我们生物打印的微组织满足了预测对人器官的药物效力或其他药物的需求。
通过以下详述、附图和所附权利要求书可以更好地理解本发明的这些特征、方面和优点，以及其他的特征、方面和优点。
附图说明
图1是本发明的生物打印机的透视图，包含显示生物打印机分配单元的部分分解截面图。
图2是图1的生物打印机的部分侧视图，其中分配单元是横截面。
图2A是图1和图2的生物打印机的XYZ运动系统的透视图。
图3显示的示意图为本发明的3D生物打印机的一种形式，其生物打印间充质干细胞微组织，以及生物打印的间充质干细胞微组织。
图4显示了微组织中的间充质干细胞(MSC)在生物打印后(A)和通过1.4毫米(mm)内径(I.D.)针注射后(B)的高细胞活力。比例尺表示100μm。
图5显示了共聚焦图像(A 3D，B切片)，揭示高细胞密度和胞外基质(ECM)的组织学构造。比例尺表示100μm。
图6显示3天培养后稳定化的MSC组织的尺寸，这是选择用于移植的时间点。
图7显示了MSC微组织向外生长到周围的水凝胶中(如相差成像所示)。比例尺表示250μm。
图8显示了用Cellbrite红、绿和蓝荧光染料标记并分别生物打印成独立微组织的MSC。当其相邻放置时，观察到组织融合。比例尺表示500μm。
图9显示了打印的微组织能够通过1.4mm内径的透明针。比例尺为500μm。如图4B所示，注射后微组织中的MSC显示高细胞活力。
图10显示了猪关节软骨外植体中产生的软骨缺陷(2.0mm，A-左侧显示缺陷)。缺陷的立体显微镜图像(A-右侧)和荧光显微镜图像(B)显示MSC微组织的填充。
图11显示了移植后两周，微组织填充组(A)中的缺陷仍然被微组织完全填充，而在MSC和水凝胶填充的组(B)中由于凝胶收缩产生了大比例的空隙空间。(C)是未处理组。
图12显示移植后两周，外植体沿着(A)所示的线垂直切开。切开的组织用细胞活力染料染色。B是切片界面的荧光图像(箭头指向缺陷底部)。绿色荧光表示高细胞活力。
图13显示了本发明生物打印机的示意图。
图14显示了：(A)，生物打印的肿瘤微组织(TMT)的H&E染色，该TMT与天然肿瘤组织具有相似的形态学。(比例尺＝100μm)；(B)，生物打印的TMT的3D体积重建图像，其通过共聚焦显微镜成像；和(C)，384孔板的一个孔中的微肿瘤组织的代表性图像，绿色染色表示活细胞。(比例尺＝100μm)
图15显示了(A)中TMT的代表性图像，该TMT由(B)人内皮细胞、(C)人间充质干细胞和(D)人癌细胞组成。(比例尺＝100μm)
图16显示了侵入试验。培养过夜后，TMT侵入周围基质。C中的红色区域(中央)显示了第1天时TMT的原始位置。(比例尺＝100μm)
图17显示了用Hypoxyprobe-Green试剂盒染色的TMT切片，该试剂盒能够将低氧区域染成荧光绿色。在生物打印的微肿瘤组织核心中观察到大量的低氧细胞。(比例尺＝100μm)
图18显示了生物打印并嵌入胶原基质的内皮微组织。当与生物打印的肿瘤微组织(箭头)共培养时，内皮微组织强烈萌发毛细血管。与内皮微组织单独或联合血管内皮生长因子刺激相比，TMT显示更高的促新生血管效果。
图19显示了使用384孔板中的两维肿瘤细胞(A)和TMT(B)的化学灵敏度分析。药物处理72小时后，对活/死细胞进行赫斯特染料和溴丙啶(PI)染色。用共聚焦或多光子显微术，以光学切片分析细胞活力，确定IC50。(比例尺＝50μm)
图20显示了用CAM模型进行的肿瘤微组织移植。(A)移植时、(B)移植后8天的立体显微视图。在(C)中，手术取出的肿瘤组织以及周围膜。(比例尺＝500μm)
图21显示了用HepG2人肝细胞和人内皮细胞生物打印的血管化人微肝组织。血管化的微肝组织显示显著更高的细胞密度(A：H&E染色)和活力(B：活-死染色，蓝色表示活细胞，紫色表示死亡细胞)，与非血管化的微肝组织(C：H&E染色,D：活-死染色)相比较。
在下面的图面说明中，将使用相同的附图标记指示图和图之间相同的部分。
具体实施方式
现在根据图1和2，其中显示本发明生物打印机10的一个非限制性实施方式。生物打印机10可包括多个分配单元12。为了方便图示和说明，图1显示了一个分配单元12。分配单元12包括针筒14，喷嘴25，致动机构36，温度控制器43(在图1中以虚线显示)。
针筒14具有确定针筒14中的中空内部空间16的本体15。本体15通常包含不透明的，半透明的，或透明的聚合物材料，例如聚丙烯。柱塞17具有圆盘状近端18和圆盘状远端19，该柱塞位于针筒14的内部空间16中，用于朝向或远离由针筒14的分配端21确定的出口孔20移动。生物墨水22包含在针筒14的内部空间16内。针筒14的本体15的出口孔20与柱塞远端19之间不需要阀门。
喷嘴25具有侧壁26、入口27、出口28，其具有100微米到3毫米的内径。侧壁26确定喷嘴25内，入口27和出口28之间的流体通路29。喷嘴25包括一个流体端口31，其确定与喷嘴25内的流体通路29流体联通的流体路径32。流体导管33使流体端口31的流体路径32与流体来源34流体联通。可将可控阀门置于流体导管33和流体来源34之间，以对流体端口31的流体路径32提供流体。可由控制器控制可控阀门，该控制器打开或关闭可控阀门，以从流体来源34将脉冲流体(例如空气)传递到流体端口31的流体路径32。在所示分配单元12的形式中，喷嘴25与针筒14的本体15分离。然而，喷嘴25也可与针筒14的本体15为一体。
分配单元12的致动机构36包括控制器37和致动器38，后者具有导螺杆39和圆盘状远端部分41。控制器37可以与致动器38通过电缆42连接。当针筒14装置在分配单元12中时，致动器38的远端部分41设置为与柱塞17的近端18接触。致动器38是线性致动器。致动器38是基于步进马达的装置。通过导螺杆39和内部的旋转锁合机构，致动器38将致动器38内部步进马达的旋转转换成导螺杆39的线性运动。远端41移动的距离由步进马达旋转的程度决定。旋转的程度受控制器37的控制，后者接收计算机程序发送的指令。导螺杆39朝柱塞17的近端18移动，以从针筒14的本体15分配生物墨水22。
分配单元12的温度控制器43包括外壳44，其围绕温度控制元件45，例如珀尔帖(Peltier)冷却-加热元件。温度控制器43提供温度受控的围隔物，其包围针筒14和分配喷嘴25。温度受控的围隔物的一个目的是为了将生物墨水22(例如细胞和/或基质)的温度控制在所需的水平，其大部分时间是冷却的，但偶尔也可根据不同的用途加温。
仍然根据图1和图2，生物打印机10包括温度控制平板50，以接收从分配单元12分配的生物墨水22。温度控制平板50可包含电阻加热元件，或珀尔帖冷却-加热元件，其通过电导线51接受电力。生物打印机10也包括装有管式导流件59的加湿器58。加湿器58建立了邻近温度控制平板50的湿度受控的区域61。生物墨水22的液滴66从喷嘴25的出口28排出，在温度控制平板50上建立微组织68。
见图2A，生物打印机10包括XYZ运动系统80，其具有支承件X、支承件Y1、支承件Y2和外壳Z1、Z2、Z3，它们各自容纳如图1所示的分配元件12。驱动控制机构85控制支承件Y1、支承件Y2以图2所示的Ay和By方向彼此朝向或反向运动。驱动控制机构86控制支承件X以图2所示的Ax和Bx方向运动。驱动控制机构87a、87b、87c控制外壳Z1、Z2和Z3以图2所示的Az和Bz方向运动。驱动控制机构85、86、87a、87b、87c可与可编程控制器电连接，以控制外壳Z1、Z2和Z3的XYZ运动(每个外壳容纳一个分配单元12)。每个分配单元12装在Z轴上。
在图2A中，以非限制性代表数目显示了3个Z轴分配单元外壳Z1、Z2和Z3。然而，对于分配单元的数目没有限制，其依赖于需要多少种组分来打印特定微组织。例如，当使用三个分配单元时，(i)三个分配单元可以彼此包含相同的生物墨水，(ii)两个分配单元可包含相同的墨水，而另一个可包含不同的生物墨水，或(iii)三个分配单元可包含彼此不同的生物墨水。
我们已经描述了生物打印机10的组件，可进一步解释生物打印机10的操作。可将包含孔阵列的微孔板(例如384、1536、或3456孔)置于温度控制平板50上，以接受从分配单元12分配的生物墨水22。或者，其他不包括孔阵列的细胞培养容器(例如皮氏(Petri)培养皿或单孔平板)也可置于温度控制平板50上直接接受从分配单元12分配的生物墨水22。
填充有相同或不同的生物墨水的针筒14安置在各分配单元12中，对控制器37编程以控制分配顺序。控制器37使每个致动器38的远端部分41与相应柱塞17的近端18接触。XYZ运动系统80使分配单元在所选的孔(或温度控制平板50上所选的位置)上方移动。随着控制器驱动每个致动器38朝平板50移动，生物墨水22从流体通路29流入喷嘴25。然后可控阀门打开或关闭，以从流体来源34将脉冲流体(例如空气)传递到流体端口31的流体路径32。脉冲流体从喷嘴25的流体通路29中的生物墨水流形成分离的液滴66。每个液滴的体积可在10纳升到15微升之间。液滴66重复置于平板50上(或在微孔板的孔中)，建立微组织样本68(见图2)。生物打印机10使用基于体积的分配，意味着分配的体积对于柱塞17移动的距离是线性的。
本发明在以下实施例中进行进一步说明，所述实施例仅用于说明而非限制目的。
实施例
实施例1
实施例1描述了使用3D生物打印开发可注射间充质干细胞(MSC)微组织，用于修复软骨缺陷。这是我们高速生物打印的一个代表性项目，其中我们用人骨髓间充质干细胞(MSC)生物打印了微软骨和骨骼组织。我们成功地生物打印了微骨骼组织和混合了MSC的组织，用于软骨和骨骼再生。我们生物打印的微组织已在体外预生长，而且机械增强。一旦注射到体内，组织本身能装配成能修复缺陷的较大组织融合物。
绪论
关节软骨显示弱固有修复能力，组织工程学是一种新的关节软骨修复途径。骨髓间充质细胞(MSC)和团块状水凝胶(bulk hydrogel)已被用于开放手术中的软骨缺陷修复。由于关节手术中总是优选侵袭性最小的方法，可注射组织工程化的软骨可能是修复软骨缺陷的理想方案。然而，水凝胶的体积收缩和弱机械性能导致移植物中的空隙空间，限制了MSC-水凝胶注射的应用。在本实施例中，我们致力于使用3D生物打印开发体积稳定的MSC微组织，并通过微组织自装配修复关节软骨中的缺陷。
方法
1.3D生物打印：使用本发明定制开发的3D生物打印机，直接生物打印出包含预先优化组合的人MSC和由水凝胶组成的生物墨水的微组织。(见图3).
2.细胞活力：生物打印后，进行MSC微组织中的活/死细胞活力试验。
3.形态学：通过HE染色和共聚焦显微术研究微组织的形态学。
4.尺寸改变：通过在一系列时间点通过显微镜对微组织直径成像，分析体积变化。
5.单组织3D向外生长：将微组织嵌在96孔板中的水凝胶内，在倒置显微镜下观察组织的向外生长。
6.多组织融合/装配：用Cellbrite染料(分别为红、绿和蓝)标记MSC，将几个微组织置于超低附着表面上以观察不同时间点的组织融合。
7.可注射性：将悬浮在培养液中的生物打印的微组织推过1.4mm内径的针，用活/死细胞染色分析细胞活力。
8.软骨外植体培养物模型中的软骨缺陷修复：在猪关节软骨外植体中制造直径为2mm的缺陷。用MSC微组织填充缺陷，以评估整合结果。用MSC水凝胶作为对照。还进行了活/死细胞染色以研究2周培养后的细胞活力。
结果
图3显示的示意图为本发明的3D生物打印机的一种形式，其生物打印间充质干细胞微组织，以及生物打印的间充质干细胞微组织。
图4显示了微组织中的间充质干细胞(MSC)在生物打印后(A)和通过1.4毫米(mm)内径(I.D.)针注射后(B)的高细胞存活率。比例尺表示100μm。
图5显示了共聚焦图像(A 3D，B切片)，揭示高细胞密度和ECM的组织学构造。比例尺表示100μm。
图6显示3天培养后稳定化的MSC组织的尺寸，这是选择用于移植的时间点。
图7显示了MSC微组织向外生长到周围的水凝胶中(如相差成像所示)。比例尺表示250μm。
图8显示了用Cellbrite红、绿和蓝荧光染料标记并分别生物打印成独立微组织的MSC。当其相邻放置时，观察到组织融合。比例尺表示500μm。
图9显示了打印的微组织能够通过1.4mm内径的透明针。比例尺为500μm。如图4B所示，注射后微组织中的MSC显示高细胞存活率。
图10显示了猪关节软骨外植体中产生的软骨缺陷(2.0mm，A-左侧显示缺陷)。缺陷的立体显微镜图像(A-右侧)和荧光显微镜图像(B)显示MSC微组织的填充。
图11显示了移植后两周，微组织填充组(A)中的缺陷仍然被微组织完全填充，而在MSC和水凝胶填充的组(B)中由于凝胶收缩产生了大比例的空隙空间。(C)是未处理组。
图12显示移植后两周，外植体沿着(A)所示的线垂直切开。切开的组织用细胞活力染料染色。B是切片界面的荧光图像(箭头指向缺陷底部)。绿色荧光表示高细胞存活率。
结论
在实施例1中，我们成功开发了一种产生MSC微组织的新3D生物打印方法，其显示了以最小程度的侵袭性修复关节软骨缺陷的前景。
实施例2
实施例2描述了用于药物开发和个性化癌症治疗的肿瘤微组织的高通量3D生物打印。
绪论
2014年，癌症导致了美国全部死亡中的约25％。体外抗癌药物筛选广泛用于药物工业和病人的化疗敏感性测试。然而，先前仅使用2D试验和简单的3D培养物模型。但这些模型与天然肿瘤微环境并不相像，或产生了对药物敏感性的不准确的预测。在本实施例中，我们报道了一种用于高通量筛选的新的3D生物打印肿瘤微组织(TMT)模型，其与天然肿瘤特征相像。我们鉴定了3D生物打印的肿瘤的各个方面特征。
方法
3D生物打印：将由肿瘤细胞、基质细胞和ECM的生物墨水装载到我们定制开发的本发明的3D生物打印机中。直接将微肿瘤组织生物打印到96或384孔板的各个孔中。用活/死细胞染色分析组织中的细胞活力。图13显示了3D生物打印机的示意图。
形态学特征分析：将TMT冷冻切片或光学切片，用苏木精和曙红(H&E或HE)染色，分别用共聚焦或多光子显微术分析。
低氧微环境分析：用Hypoxyprobe-Green试剂盒对TMT冷冻切片染色，该试剂盒将低氧区域标记为绿色荧光。
侵入试验：首先将TMT打印出来，将额外的不含细胞的生物墨水打印在肿瘤组织周围。用相差或荧光成像分析肿瘤侵入基质。
血管生成试验：为了分析肿瘤细胞分泌的促血管生成生物分子，将仅由人脐带静脉血内皮细胞(HUVEC)和基质组成的生物打印的微组织嵌入胶原水凝胶中，与生物打印的TMT共培养，通过相差和荧光显微术分析血管生成性萌发。
化疗敏感性测试：为了确定3D生物打印的TMT和传统2D细胞的化疗敏感性，将细胞和TMT铺在384孔板的每个孔中。加入药物72小时，进行活/死细胞荧光测试。用共聚焦或多光子显微术分别分析3D和2D的细胞活力。
体内移植：用尿囊绒膜(CAM)评估体内致肿瘤性。在发育的第8天，将TMT植于生长中的CAM顶部。在第16日，用立体显微镜观察每个卵。手术取出肿瘤以及周围膜，将其固定在4％多聚甲醛中用于进一步组织分析。
结果
图14显示了：(A)生物打印的肿瘤微组织(TMT)的H&E染色，该TMT与天然肿瘤组织具有相似形态学。(比例尺＝100μm)；(B)，生物打印的TMT的3D体积重建图像，其通过共聚焦显微镜成像；和(C)，384孔板的一个孔中的微肿瘤组织的代表性图像，绿色染色表示活细胞。(比例尺＝100μm)
图15显示了(A)中TMT的代表性影像，该TMT由(B)人内皮细胞、(C)人间充质干细胞和(D)人癌细胞组成。比例尺＝100μm)
图16显示了侵入试验。培养过夜后，TMT侵入周围基质。C中的红色区域(中央)显示了第1天时TMT的原始位置。(比例尺＝100μm)
图17显示了用Hypoxyprobe-Green试剂盒染色的TMT切片，该试剂盒能够将低氧区域染成荧光绿色。在生物打印的微肿瘤组织核心中观察到大量的低氧细胞。(比例尺＝100μm)
图18显示了生物打印并嵌入胶原基质的内皮微组织。当与生物打印的肿瘤微组织(箭头)共培养时，内皮微组织强烈萌发毛细血管。与内皮微组织单独或联合血管内皮生长因子刺激相比，TMT显示更高的促新生血管效果。
图19显示了使用384孔板中的两维肿瘤细胞(A)和TMT(B)的化学灵敏度分析。药物处理72小时后，对活/死细胞进行赫斯特染料和溴丙啶(PI)染色。用共聚焦或多光子显微术，以光学切片分析细胞存活率，确定IC50。(比例尺＝50μm)
图20显示了用CAM模型进行的肿瘤微组织移植。(A)移植时、(B)移植后8小时的立体显微视图。在(C)中，手术取出的肿瘤组织以及周围膜。(比例尺＝500μm)
结论
我们成功开发了一种高通量3D生物打印系统，以体外产生肿瘤微组织，其与天然肿瘤组织的许多性质相像。由此证明该系统是一种筛选抗癌药物和选择个性化癌症治疗敏感药物的强大工具。
实施例3
我们3D生物打印了肝脏组织。具体的，我们成功使用HepG2人肝细胞和人内皮细胞生物打印了血管化人微肝组织。如图21所示，血管化的微肝组织与非血管化的微肝组织(C和D)相比，显示显著高的细胞密度(A)和活力(B)。
因此，本发明提供了一种三维微组织生物打印机，和使用该三维微组织生物打印机的方法。我们已公开了计算机控制的可编程3D生物打印机，其能以精准控制的微米级准确XYZ运动和体积为纳升的分配能力建立活微组织。我们打印了许多类型的组织，其包含许多不同类型的细胞，包括多能干细胞、骨髓间充质干细胞、成骨细胞、成纤维细胞、人内皮细胞、肝细胞和许多不同的肿瘤细胞。
我们生物打印了微肿瘤组织，用于高通量药物筛选和治疗目的。我们对打印出的肿瘤组织的许多方面的特征进行了鉴定，包括形态学、功能、生物标记、微环境、3D结构和侵入性以及药物敏感性。由于我们已在肿瘤生物打印方面有了经验，我们预期成功的微心脏和肝脏组织打印，其需要使用不同细胞的相同技术过程。我们3D生物打印了肝脏组织。
如上所述，我们已用3D生物打印的肿瘤组织进行了抗肿瘤药物筛选。这是药物工业用于开发新抗癌药物的一项理想服务，这些新抗癌药物包括但不限于化疗药和放疗敏感性增强药物。优点是我们的系统能够显著更快和以显著更低开发成本帮助开发(而不使用动物研究)。生物打印的组织的3D性质还使其能比目前使用的2D培养细胞筛选更准确地进行评估，而且节约了金钱和时间。
本发明还能用于个性化的癌症治疗。在手术或活检后使用分离自各个病人的癌细胞三维生物打印出的肿瘤组织可用于确定各个病人的敏感药物或药物组合，包括但不限于化疗药和放疗增强药物。由于3D肿瘤组织与体内情况非常相似，其能更准确地帮助癌症学家找到对病人的最佳药物方案。
本发明可用于最小侵袭性手术的软骨和骨骼组织再生。
本发明可用于药物工业的药物代谢测试。我们可利用我们的3D生物打印的微肝组织以高通量测试开发中药物的代谢情况。
本发明可用于药物工业的药物毒性筛选。我们可利用我们3D生物打印的微肝脏和心脏组织在药物工业中筛选候选药物的毒性。
尽管已经参考某些实施方式相当详细地描述了本发明，但是本领域技术人员应理解，可以通过不同于所述实施方式的方式实施本发明，本文所述的实施方式是为了举例说明，而没有限制的作用。因此，所附权利要求书的范围不应限于本文包含的实施方式的内容。

Claims (42)

1.一种生物打印机(10)，其包括：
一个或多个分配单元(12)，每个分配单元(12)包括：
(i)针筒(14)，其包括中空本体(15)和尺寸能在该本体(15)内平移的柱塞(17)，其中所述本体(15)具有出口孔(20)；
(ii) 致动器(38)，其与柱塞(17)近端(18)接触；
(iii) 用于控制致动器(38)线性运动的控制器(37)，所述控制器(37)执行来自控制器(37)内计算机的程序，以驱动致动器(38)朝柱塞(17)近端(18)移动，以从针筒(14)本体(15)分配生物墨水(22)；和
(iv) 喷嘴(25)，其具有限定从喷嘴(25)入口(27)到喷嘴(25)出口(28)的流体通路(29)的壁，所述喷嘴(25)入口(27)与针筒(14)本体(15)的出口孔(20)流体联通，其中随着所述控制器(37)驱动致动器(38)朝柱塞(17)近端(18)移动，生物墨水(22)流入流体通路(29)，
其中所述喷嘴(25)包括与流体来源(34)以及流体通路(29)流体联通的流体路径(32)，
其中流体来源(34)包括可控阀门，以从流体来源(34)将脉冲流体传递到流体路径(32)，通过用将来自流体来源(34)的脉冲流体驱使生物墨水(22)液滴从喷嘴(25)排出，从喷嘴(25)的流体通路(29)中的生物墨水(22)流形成分离的液滴(66)。
2.如权利要求1所述的生物打印机(10)，还包括
围绕针筒(14)本体(15)的温度控制器(43)。
3.如权利要求1所述的生物打印机(10)，还包括
用于从喷嘴(25)出口(28)接受生物墨水(22)的温度受控的平板。
4.如权利要求3所述的生物打印机(10)，还包括
用于在温度受控的平板邻近处建立湿度受控区域的加湿器(58)。
5.如权利要求1所述的生物打印机(10)，其中：
每个液滴(66)的体积在10纳升到15微升之间。
6.如权利要求1所述的生物打印机(10)，其中：
可控阀门受第二控制器控制。
7.如权利要求1所述的生物打印机(10)，其中：
脉冲流体包括脉冲空气。
8.如权利要求1所述的生物打印机(10)，其中：
脉冲流体包括毫秒脉冲空气。
9.如权利要求1所述的生物打印机(10)，其中：
每个分配单元(12)是非接触分配单元。
10.如权利要求1所述的生物打印机(10)，其中：
喷嘴(25)与针筒(14)本体(15)是一体的。
11.如权利要求1所述的生物打印机(10)，其中：
喷嘴(25)与针筒(14)本体(15)分离。
12.如权利要求1所述的生物打印机(10)，其中：
喷嘴(25)出口(28)具有100微米到3毫米的内径。
13.如权利要求1所述的生物打印机(10)，其中：
所述生物打印机(10)包括多个分配单元(12)。
14.如权利要求1所述的生物打印机(10)，还包括：
每个分配单元(12)装载在XYZ运动系统(80)中。
15.一种制备微组织的方法，所述方法包括：
(a) 将生物墨水(22)从权利要求1所述的生物打印机(10)的一个或多个分配单元(12)分配到平板上。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于：
所述微组织包含软骨细胞。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于：
所述微组织包含肿瘤细胞、肿瘤基质细胞和内皮细胞。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于：
所述微组织包含肝细胞。
19.一种修复骨骼缺陷或软骨缺陷的方法，该方法包括：
(a) 从权利要求1所述的生物打印机(10)的一个或多个分配单元(12)分配生物墨水(22)，以建立包含软骨细胞的微组织；和
(b) 将微组织植入到骨骼缺陷或软骨缺陷中。
20.一种用于药物发现的高通量筛选方法，该方法包括：
(a) 从权利要求1所述的生物打印机(10)的一个或多个分配单元(12)分配生物墨水(22)，以建立多个微组织样本；和
(b) 使所述多个微组织样本的至少一部分与药物候选化合物接触。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于：
所述微组织样本包含肿瘤细胞。
22.一种生物打印机(10)，其包括：
一个或多个分配单元(12)，每个分配单元(12)包括：
(i)针筒(14)，其包括中空本体(15)和尺寸能在该本体(15)内平移的柱塞(17)，其中所述本体(15)具有出口孔(20)；
(ii) 致动器(38)，其与柱塞(17)近端(18)接触；
(iii) 用于移动致动器(38)的控制器(37)，其中所述控制器(37)执行来自控制器(37)内计算机的程序，以驱动致动器(38)朝柱塞(17)近端(18)移动，以从针筒(14)本体(15)分配生物墨水(22)；和
(iv) 喷嘴(25)，其具有限定从喷嘴(25)入口(27)到喷嘴(25)出口(28)的流体通路(29)的壁，所述喷嘴(25)入口(27)与针筒(14)本体(15)的出口孔(20)流体联通，其中随着所述控制器(37)驱动致动器(38)朝柱塞(17)近端(18)移动，生物墨水(22)流入流体通路(29)，
其中所述针筒(14)在针筒(14)本体(15)的出口孔(20)和柱塞(17)远端(19)之间不包括阀门，
其中流体来源(34)包括可控阀门，以从流体来源(34)将脉冲流体传递到流体通路(29)，通过用将来自流体来源(34)的脉冲流体驱使生物墨水(22)液滴从喷嘴(25)排出，从喷嘴(25)的流体通路中的生物墨水(22)流形成分离的液滴(66)。
23.如权利要求22所述的生物打印机(10)，还包括
围绕针筒(14)本体(15)的温度控制器(43)。
24.如权利要求22所述的生物打印机(10)，还包括
用于从喷嘴(25)出口(28)接受生物墨水的温度受控的平板。
25.如权利要求22所述的生物打印机(10)，还包括
用于在温度受控的平板邻近处建立湿度受控区域的加湿器(58)。
26.如权利要求22所述的生物打印机(10)，其中：
每个液滴(66)的体积在10纳升到15微升之间。
27.如权利要求22所述的生物打印机(10)，其中：
可控阀门受第二控制器控制。
28.如权利要求22所述的生物打印机(10)，其中：
脉冲流体包括脉冲空气。
29.如权利要求22所述的生物打印机(10)，其中：
脉冲流体包括毫秒脉冲空气。
30.如权利要求22所述的生物打印机(10)，其中：
每个分配单元(12)是非接触分配单元。
31.如权利要求22所述的生物打印机(10)，其中：
喷嘴(25)与针筒(14)本体(15)是一体的。
32.如权利要求22所述的生物打印机(10)，其中：
喷嘴(25)与针筒(14)本体(15)分离。
33.如权利要求22所述的生物打印机(10)，其中：
喷嘴(25)出口(28)具有100微米到3毫米的内径。
34.如权利要求22所述的生物打印机(10)，其中：
所述生物打印机(10)包括多个分配单元(12)。
35.如权利要求22所述的生物打印机(10)，还包括
每个分配单元(12)装载在XYZ运动系统(80)中。
36.一种制备微组织的方法，所述方法包括：
(a) 将生物墨水(22)从权利要求22所述的生物打印机(10)的一个或多个分配单元(12)分配到平板上。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于：
所述微组织包含软骨细胞。
38.如权利要求36所述的方法，其特征在于：
所述微组织包含肿瘤细胞。
39.如权利要求36所述的方法，其特征在于：
所述微组织包含肝细胞。
40.一种修复骨骼缺陷或软骨缺陷的方法，该方法包括：
(a) 从权利要求22所述的生物打印机(10)的一个或多个分配单元(12)分配生物墨水，以建立包含软骨细胞的微组织；和
(b) 将微组织植入到骨骼缺陷或软骨缺陷中。
41.一种用于药物发现的高通量筛选方法，该方法包括：
(a) 从权利要求22所述的生物打印机(10)的一个或多个分配单元(12)分配生物墨水(22)，以建立多个微组织样本；和
(b) 使所述多个微组织样本的至少一部分与药物候选化合物接触。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于：
所述微组织样本包含肿瘤细胞。
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